Полипептид, имеющий ферментативную активность фосфодиэстеразы

Полипептид, имеющий ферментативную активность фосфодиэстеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится в общем к семейству фосфодиэстераз, названному PDE8A, и его применениям.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фосфодиэстеразы (PDE) гидролизуют 3',5'-циклические нуклеотиды до соответствующих нуклеозид-5'-монофосфатов. Циклические нуклеотиды цАМФ и цГМФ синтезируются аденилил- и гуанилилциклазами соответственно и служат в качестве вторичных мессенджеров в ряде клеточных путей передачи сигналов. Продолжительность и сила сигнала этих вторичных мессенджеров является функцией скорости синтеза и скорости гидролиза циклического нуклеотида.

Были идентифицированы многочисленные семейства PDE. Система номенклатуры включает в себя сначала число, которое указывает семейство PDE. К настоящему времени известны семь семейств (PDE1-7), которые классифицируются по: (i) первичной структуре; (ii) субстратной предпочтительности; (iii) реакции на различные модуляторы; (iv) чувствительности к специфическим ингибиторам и (v) способам регуляции (Loughney and Ferguson, in Phosphodiesterase Inhibitors, Schudt, et al. (Eds), Academic Press: New York, New York (1996) pp.1-91). За числом, указывающим семейство, следует заглавная буква, указывающая определенный ген, и за заглавной буквой следует второе число, указывающее специфический сплайсинг-вариант или специфический транскрипт, который использует уникальный сайт инициации транскрипции.

Аминокислотные последовательности всех PDEs млекопитающих, идентифицированных к настоящему времени, включают в себя высококонсервативную область из приблизительно 270 аминокислот, расположеннную в карбоксиконцевой половине белка [Charbonneau, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:9308-9312 (1986)]. Этот консервативный домен включает в себя каталитический сайт для гидролиза цАМФ и/или цГМФ и два предположительных сайта связывания цинка, а также специфические для семейства детерминанты [Beavo, Physlol. Rev. 75:725-748 (1995); Francis, et al., J. Biol. Chem. 269:22477-22480 (1994)]. Аминоконцевые области различных PDE являются высоковариабельными и включают в себя другие специфические для семейства детерминанты, такие как: (i) сайты связывания кальмодулина (PDE1); (ii) некаталитические сайты связывания циклического ГМФ (PDE2, PDE5, PDE6); (iii) нацеливающие на мембрану сайты (PDE4); (iv) сайты гидрофобного связывания с мембраной (PDE3) и (v) сайты фосфорилирования для кальмодулинзависимой киназы II (PDE1), цАМФ-зависимой киназы (PDE1, PDE3, PDE4) или цГМФ-зависимой киназы (PDE5) [Beavo, Physiol. Rev. 75:725-748 (1995); Manganiello, et al., Arch. Biochem. Acta 322:1-13 (1995); Conti, et al., Physiol. Rev. 75:723-748 (1995)].

Члены семейства PDE1 активируются кальцием-кальмодулином. Были идентифицированы три гена: PDE1A и PDE1B предпочтительно гидролизуют цГМФ, тогда как PDE1C, как было показано, проявляет высокую аффинность в отношении как цАМФ, так и цГМФ. Семейство PDE2 характеризуется как семейство, специфически стимулируемое цГМФ [Loughney and Ferguson, supra]. Был идентифицирован только один ген, PDE2A, ферментативный продукт которого специфически ингибируется эритро-9-(2-гидрокси-З-нонил)аденином (EHNA). Ферменты в семействе PDE3 специфически ингибируются цГМФ. Известны два гена, PDE3A и PDE3B, оба имеющие высокую аффинность в отношении как цАМФ, так и цГМФ, хотя V_макс для гидролиза цГМФ является достаточно низкой, чтобы цГМФ действовал как конкурентный ингибитор для гидролиза цАМФ. Ферменты PDE3 специфически ингибируются милриноном и эноксимоном [Loughney and Ferguson, supra]. Семейство PDE4 выполняет гидролиз цАМФ и включает в себя четыре гена, PDE4A, PDE4B, PDE4C и PDE4D, каждый из которых имеет многочисленные сплайсинг-варианты. Члены этого семейства специфически ингибируются лекарственным средством, антидепрессантом ролипрамом. Члены семейства PDE5 связывают цГМФ в некаталитических сайтах и предпочтительно гидролизуют цГМФ. Был идентифицирован только один ген, PDE5A. Фоторецепторные ферменты PDE6 специфически гидролизуют цГМФ [Loughney and Ferguson, supra]. Гены включают в себя PDE6A и PDE6B (белковые продукты которых димеризуются и связывают две копии меньшей ингибиторной субъединицы γ с образованием палочкообразной PDE), в дополнение к PDE6C, которая связывается с тремя меньшими белками с образованием конусообразной PDE. Семейство PDE7 выполняет гидролиз цАМФ, но, в противоположность семейству PDE4, не ингибируется ролипрамом [Loughney and Ferguson, supra]. Был идентифицирован только один ген, PDE7A.

Таким образом, при условии важности цАМФ и цГМФ во внутриклеточной передаче сигнала, в данной области существует растущая необходимость идентификации дополнительных видов PDE. Идентификация до сих пор неизвестных семейств PDE, и их генов и сплайсинг-вариантов, обеспечит дополнительные фармакологические подходы к лечению состояний, в которых связанные с циклическими нуклеотидами пути являются нарушенными, а также состояний, в которых желательно модулирование внутриклеточных уровней цАМФ и/или цГМФ в определенных типах клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вкратце, данное изобретение обеспечивает полипептиды и соответствующие полинуклеотиды для нового семейства PDE, обозначенного PDE8. Данное изобретение включает в себя как природно-встречающиеся, так и не встречающиеся в природе полинуклеотиды PDE8 и их полипептидные продукты. Природно-встречающиеся продукты PDE8 включают в себя определенные разновидности генов и полипептидов в семействе PDE8 (например, PDE8A); эти разновидности включают в себя разновидности генов и полипептидов, которые экспрессируются в клетках одного и того же животного, а также соответствующие гомологичные разновидности, экспрессируемые в клетках других животных. В каждой разновидности PDE8, данное изобретение предусматривает далее сплайсинг-варианты, кодируемые тем же самым полинуклеотидом, но возникающие из отличающихся мРНК-транскриптов (например, PDE8A1 и PDE8A2). Не встречающиеся в природе продукты PDE8 включают в себя варианты природно-встречающихся продуктов, такие как аналоги (т.е. продукты, в которых одна или несколько аминокислот добавлены, заменены или делегированы) и такие продукты PDE8, которые включают в себя ковалентные модификации (т.е. слитые (гибридные) белки, гликозилированные варианты, Met^-1PDE8s, Met^-2-Lys^-1-PDE8s, Gly^-1PDE8s и т.п.) Семейство PDE8 отличается от известных ранее семейств PDE проявлением высокой аффинности в отношении гидролиза как цДМФ, так и цГМФ, но относительно низкой чувствительностью к ингибиторам фермента, специфическим для других семейств PDE. В предпочтительном варианте изобретение предусматривает полинуклеотид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Данное изобретение включает в себя также полинуклеотиды, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Предпочтительный в настоящее время полипептид по данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, представленную в последовательности SEQ ID NO:2. Изобретение предусматривает два сплайсинг-варианта кДНКs, которые дают два полипептида, обозначенных PDE8A1 и PDE8A2. Полипептиды PDE8A1 и PDE8A2 и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, обсуждаются здесь как характерные представители семейства ферментов PDE8, включенные в данное изобретение.

Данное изобретение предусматривает новые очищенные и выделенные полинуклеотиды (например, последовательности ДНК и РНК-транскрипты, как смысловые, так и комплементарные антисмысловые цепи, в том числе их сплайсинг-варианты), кодирующие PDE8s человека. Последовательности ДНК данного изобретения включают в себя геномные и кДНК-последовательности, а также полностью или частичные химически синтезированные последовательности ДНК. Термин "синтезированные", в применении здесь и в понимании специалистов в данной области, относится к чисто химическим, в противоположность ферментативным, способам получения полинуклеотидов. Таким образом, "полностью" синтезированные последовательности ДНК получают полностью химическими способами, а "частично" синтезированные ДНК включают в себя ДНК, в которых только части полученной ДНК произведены химическими способами. Предпочтительная последовательность ДНК, кодирующая полипептид PDE8 человека, представлена в SEQ ID NO:1. Также предпочтительными являются полинуклеотиды, кодирующие полипептид PDE8 SEQ ID NO:2, и сплайсинг-вариантные полипептиды PDE8A1 и PDE8A2, представленные в SEQ ID NOs:6 и, соответственно. Предпочтительные полипептиды, кодирующие PDE8A1 и PDE8A2, представлены в SEQ ID NOs:5 и, соответственно. Кроме того, данное изобретение включает в себя разновидности ДНК, предпочтительно млекопитающих, являющиеся гомологами ДНК PDE8 человека.

Данное изобретение включает в себя также последовательности ДНК, кодирующие молекулы PDE8, которые гибридизуются при умеренно строгих условиях с некодирующими цепями, или комплеменатами, полинуклеотидов, представленных в SEQ ID NOs:1, 3 и 5. Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды PDE8A, которые могли бы гибридизоваться с ними, если бы не вырожденность генетического кода, включены в это изобретение. Примером умеренных условий гибридизации являются следующие условия: гибридизация при 65°С в 3Х SSC (растворе хлорида и цитрата натрия), 0,1% саркозиле и 20 мМ фосфате натрия, рН 6,8, и промывание при 65°С в 2Х SSC с 0,1% ДСН. В данной области понятно, что условия эквивалентной строгости могут быть достигнуты путем варьирования температуры и буфера или концентрации солей, как описано Ausebel, et al., (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10. Модификации в условиях гибридизации могут быть определены эмпирически или точно рассчитаны на основании длины и процента спаривания оснований гуанозин/цитозин (ГЦ) зонда. Условия гибридизации могут быть рассчитаны, как описано в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp.9.47-9.51.

Обеспечены также автономно реплицирующиеся рекомбинантные экспрессионные конструкции, такие как плазмидные и вирусные ДНК-векторы, включающие в себя последовательности PDE8. Обеспечены также экспрессионные конструкции, в которых PDE8-кодирующие полинуклеотиды оперативно (функционально) связаны с эндогенной или экзогенной регулирующей экспрессию ДНК-последовательностью и терминатором транскрипции.

Согласно другому аспекту данного изобретения предусмотрены клетки-хозяева, в том числе прокариотические и эукариотические клетки, стабильно или временно трансформированные последовательностями ДНК данного изобретения таким образом, что они делают возможной экспрессию полипептидов PDE8 данного изобретения. Клетки-хозяева данного изобретения представляют собой ценный источник иммуногена для разработки антител, специфически иммунореактивных с PDE8. Клетки-хозяева данного изобретения являются также в большой степени применимыми в способах крупномасштабного получения полипептидов PDE8, в которых эти клетки выращивают в подходящей культуральной среде и желаемые полипептидые продукты выделяют из этих клеток или из среды, в которой выращивались эти клетки, например, при помощи иммуноаффинной очистки.

Знание ДНК-последовательностей PDE8 позволяет модифицировать клетки таким образом, чтобы сделать возможной или увеличить экспрессию эндогенной PDE8. Клетки могут быть модифицированы (например, гомологичной рекомбинацией) для обеспечения повышенной экспрессии PDE8 путем замены, полностью или частично, природно-встречающегося промотора PDE8 полным гетерологичным промотором или его частью таким образом, что эти клетки экспрессируют высокие уровни PDE8. Гетерологичный промотор может быть встроен таким образом, что он оперативно связан с кодирующими PDE8 последовательностями. См., например, РСТ International Publication No. WO 94/12650, РСТ International Publication No. WO 92/20808 и РСТ International Publication No. 91/09955. Данное изобретение обсуждает также, что, кроме гетерологичного промотора ДНК, амплифицируемая маркерная ДНК (например, ada, dhfr и мультифункциональный ген CAD, который кодирует карбамилфосфатсинтазу, аспартаттранскарбамилазу и дигидрооротазу) и/или интронная ДНК могут быть встроены вместе с гетерологичным промотором ДНК. При соединении их с кодирующей последовательностью PDE8 амплификация маркерной ДНК с применением стандартных способов отбора приводит к ко-амплификации кодирующих PDE8 последовательностей в этих клетках.

Информация о последовательностях ДНК, обеспечиваемая данным изобретением, позволяет получить, например, при помощи стратегий гомологичной рекомбинации или "нокаута" [Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)], животных, которые не могут экспрессировать функциональную PDE8 или которые экспрессируют вариант PDE8. Такие животные применимы в качестве моделей для исследования активностей in vivo PDE8 и модуляторов PDE8.

Данное изобретение предусматривает также очищенные и выделенные полипептиды PDE8 млекопитающих. Предпочтительные в настоящее время полипептиды PDE8A представлены в SEQ ID NOs:4 и 6. Наиболее предпочтительным является полипептид PDE8, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NOs:2. Полипептиды PDE8 данного изобретения могут быть выделены из природных клеточных источников или могут быть химически синтезированными, но их предпочтительно получают рекомбинантными процедурами с использованием клеток-хозяев данного изобретения. Ожидается, что применение клеток-хозяев млекопитающих обеспечит такие посттрансляционные модификации (например, гликозилирование, усечение, липидирование и фосфорилирование), которые могут быть необходимыми для придания оптимальной биологической активности рекомбинантным экспрессионным продуктам данного изобретения. PDES-продукты данного изобретения могут быть полноразмерными полипептидами, биологически активными фрагментами или их вариантами, которые сохраняют биологическую активность PDE8. Варианты могут включать в себя полипептидные аналоги PDE8, в которых одна или несколько специфических (т.е. природно-кодируемых) аминокислот делегированы или заменены или в которых добавлены одна или несколько не указанных аминокислот: (1) без потери одной или нескольких биологических активностей или иммунологических характеристик, специфических для PDE8; или (2) со специфическим лишением конкретной биологической активности PDE8.

Вариантные продукты данного изобретения включают в себя зрелые продукты PDE8A, т.е. продукты PDE8, в которых удалены лидерная или сигнальная последовательности, имеющие дополнительные аминоконцевые остатки. Рассматриваются PDE8-продукты, имеющие дополнительный остаток метионина в положении -1 (Met^-1PDES), как и PDE8-продукты, имеющие дополнительные остатки метионина и лизина в положениях -2 и -1 (Met^-2Lys^-1-PDES). Варианты этих типов применимы, в частности, для получения рекомбинантных белков в бактериальных клеточных типах.

Данное изобретение включает в себя также варианты PDE8, имеющие дополнительные аминокислотные остатки, которые возникают вследствие применения специфических систем экспрессии. Например, применение коммерчески доступных векторов, экспрессирующих желаемый полипептид, такой как слитый (гибридный) продукт глутатион-S-трансфераза (GST), обеспечивает желаемый полипептид, имеющий дополнительный остаток глицина в положении -1 как результат отщепления компонента GST от желаемого полипептида. Рассматриваются также варианты, которые возникают из экспрессии в других векторных системах.

Далее, изобретение включает в себя продукты PDE8, модифицированные таким образом, что они включают в себя один или несколько присоединенных водорастворимых полимеров. Особенно предпочтительными являются продукты PDE8, ковалентно модифицированные субъединицами полиэтиленгликоля (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть связаны в специфических положениях, например, при аминоконце продуктов PDE8, или произвольно присоединены к одной или нескольким боковым цепям этого полипептида.

Данным изобретением охватываются также антитела (например, моноклональные и поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела и т.п.) и другие связывающие белки, специфические для продуктов PDE8 или их фрагментов. Специфические связывающие белки могут быть получены с применением выделенных или рекомбинантных продуктов PDE8, вариантов PDE8 или клеток, экспрессирующих такие продукты. Связывающие белки применимы для очистки продуктов PDE8 и обнаружения или количественного определения продуктов PDE8 в пробах жидкости и тканей с применением известных иммунологических процедур. Связывающие белки применимы также, как очевидно, в модулировании (т.е. блокировании, ингибировании или стимуляции) биологических активностей PDE8, в частности активностей, участвующих в трансдукции (передаче) сигнала. Рассматриваются также антиидиотипические антитела, специфические для антител против PDE8.

Научная ценность информации, вносимой описаниями последовательностей ДНК и аминокислотных последовательностей данного изобретения, является очевидной. В качестве одной серии примеров, знание последовательности кДНК для PDE8A делает возможной, посредством применения гибридизации по Саузерну или полимеразной цепной реакции (ПЦР), идентификацию геномных последовательностей ДНК, кодирующих PDE8, и регуляторных последовательностей управления экспрессией PDE8, таких как промоторы, операторы, энхансеры, репрессоры и т.п. Ожидается также, что процедуры гибридизации ДНК/ДНК, проводимые с последовательностями ДНК данного изобретения в условиях умеренной - высокой строгости, позволят выделить ДНК, кодирующие аллельные варианты PDE8A; в данной области известно, что аллельные варианты включают в себя структурно родственные белки, имеющие одно или несколько общих биохимических и/или иммунологических свойств, специфических для PDE8A. Подобным образом, разновидности генов не человека, кодирующие белки, гомологичные PDE8A, могут быть также идентифицированы при помощи анализа по Саузерну и/или ПЦР-анализа. В качестве альтернативы, исследования комплементации могут быть применимы для идентификации других продуктов PDE8 человека, а также белков не человека и ДНК, кодирующих белки, обладающие одним или несколькими общими биологическими свойствами PDE8A.

Полинуклеотиды данного изобретения применимы также в тестах гибридизации для обнаружения способности клеток экспрессировать PDE8. Полинуклеотиды данного изобретения могут быть также основой для диагностических способов, применимых для идентификации генетического изменения (изменений) в локусе PDE8, которое может лежать в основе патологического состояния или состояний.

Посредством данного изобретения становятся также доступными антисмысловые полинуклеотиды, которые узнают полинуклеотиды, кодирующие PDE8, и гибридизуются с ними. Обеспечены полноразмерные антисмысловые полинуклеотиды и их фрагменты. Антисмысловые полинуклеотиды имеют, в частности, отношение к регуляции экспрессии PDE8 клетками, экспрессирующими мРНК PDE8.

Информация о ДНК- и аминокислотной последовательности, обеспечиваемая данным изобретением, делает также возможным систематический анализ структуры и функции PDE8. Информация о ДНК- и аминокислотной последовательности для PDE8 позволяет также идентифицировать молекулы, с которыми будет взаимодействовать PDE8A. Агенты, которые модулируют (т.е. увеличивают, уменьшают или блокируют) активность PDE8, могут быть идентифицированы инкубированием предполагаемого модулятора с PDE8 и определением действия этого предполагаемого модулятора на фосфодиэстеразную активность PDE8. Селективность соединения, которое модулирует активность PDE8, может быть оценена сравнением его активности на PDE8 с его активностью на других ферментах PDE. Способы на основе клеток, такие как дигибридные тесты и тесты расщепления гибридов, а также способы in vitro, в том числе тесты, в которых полипептид или его партнер связывания иммобилизуется, и тесты в растворе рассматриваются данным изобретением.

Селективные модуляторы могут включать в себя, например, антитела и другие белки или пептиды, которые специфически связываются с PDE8 или нуклеиновой кислотой PDE8, олигонуклеотиды, которые специфически связываются с PDE8 или нуклеиновой кислотой PDE8, и другие, непептидные соединения (например, выделенные или синтетические органические молекулы), которые специфически реагируют с PDE8 или кодирующей PDE8 нуклеиновой кислотой. Мутантные формы PDE8, влияющие на ферментативную активность или клеточную локализацию PDE8 дикого типа, также рассматриваются данным изобретением. Предпочтительные в настоящее время мишени для разработки селективных модуляторов включают в себя, например: (1) районы PDE8, которые контактируют с другими белками и/или локализуют PDE8 в клетке, (2) районы PDE8, которые связывают субстрат, (3) аллостерический циклический нуклеотидсвязывающий сайт (сайты) PDE8, (4) сайт (сайты) фосфорилирования PDE8 и (5) районы PDE8, которые участвуют в мультимеризации субъединиц PDE8. Модуляторы активности PDE8 могут быть терапевтически применимыми в лечении большого диапазона заболеваний и физиологических состояний, для которых известно участие активности PDE.

Кроме того, данное изобретение рассматривает низкомолекулярные модуляторы ферментативной активности PDE8A. Имеется по меньшей мере три различных типа библиотек, используемых для идентификации низкомолекулярных модуляторов. Они включают в себя: (1) химические библиотеки, (2) библиотеки природных продуктов и (3) комбинаторные библиотеки, состоящие из произвольных пептидов, олигонуклеотидов или органических молекул.

Химические библиотеки состоят из структурных аналогов известных соединений или соединений, которые идентифицированы как "хиты" ("попадания") ("hits") или "указания" ("leads") при помощи скрининга природных продуктов. Библиотеки природных продуктов являются коллекциями микроорганизмов, животных, растений или морских организмов, которые используют для создания смесей для скрининга при помощи: (1) ферментации и экстракции бульонов из почвенных, растительных или морских микроорганизмов или (2) экстракции растений или морских организмов. Комбинаторные библиотеки состоят из больших количеств пептидов, олигонуклеотидов или органических соединений в виде смеси. Их относительно легко приготовить при помощи традиционных способов автоматизированного синтеза, ПЦР, клонирования или подходящих синтетических способов. Особый интерес представляют собой пептидные и олигонуклеотидные комбинаторные библиотеки. Другие представляющие интерес библиотеки включают в себя пептидные, белковые, пептидомиметические, мультипараллельные синтетические коллекционные, рекомбинаторные и полипептидые библиотеки. В отношении обзора комбинаторной химии и библиотек, создаваемых на ее основе, смотрите Myers, Curr. Opion. Biotechnol. 8:701-707 (1997).

Идентификация модуляторов с применением различных библиотек, описанных здесь, позволяет модифицировать предполагаемый "хит" ("попадание") (или "указание") для оптимизации способности "хита" модулировать активность.

Далее, изобретение предусматривает способы идентификации партнера специфического связывания полипептида PDE8A изобретения, предусматривающие стадии: а) контактирования полипептида PDE8A с соединением в условиях, позволяющих связывание между этим соединением и полипептидом PDE8A; b) детектирования связывания этого соединения с полипептидом PDE8A и с) идентификации этого соединения как партнера специфического связывания полипептида PDE8A. Партнер связывания, идентифицированный в способах данного изобретения, предпочтительно модулирует ферментативную активность PDE8A либо посредством ингибирования, либо посредством активации или усиления этого фермента.

Данное изобретение предусматривает также способы идентификации соединения-партнера связывания полинуклеотида PDE8A изобретения, предусматривающие стадии: а) контактирования полинуклеотида PDE8A с соединением в условиях, позволяющих связывание между этим соединением и полинуклеотидом PDE8A; b) детектирования связывания этого соединения с полинуклеотидом PDE8A и с) идентификации этого соединения как партнера специфического связывания полинуклеотида PDE8A. Партнер связывания полинуклеотида PDE8A предпочтительно модулирует экспрессию полипептида PDE8A, кодируемого этим полинуклеотидом PDE8A, либо посредством ингибирования экспрессии, либо посредством усиления экспрессии.

Данное изобретение обеспечивает также соединения, идентифицированные способом данного изобретения, а также композиции, содержащие идентифицированное соединение и фармацевтически приемлемый носитель.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые относятся к выделению полинуклеотидов, кодирующих полипептиды PDE8, а также к экспрессии и характеристике кодируемых полипептидов. Пример 1 описывает способы поиска в базе данных экспрессируемых маркеров последовательностей (EST) для идентификации зондов, потенциально применимых для выделения ДНК данного изобретения. Пример 2 относится к идентификации кодирующих PDE8A полинуклеотидов. Пример 3 относится к анализу последовательности выделенных полинуклеотидов. Пример 4 описывает анализ полипептидов, кодируемых полинуклеотидами PDE8A. Пример 5 относится к экспрессии рекомбинантных полипептидов PDE8A. Пример 6 относится к Нозерн-анализу экспрессии PDE8A. Пример 7 описывает хромосомное картирование гена, кодирующего PDE8A. Пример 8 описывает подтверждение того, что PDE8A1 и PDE8A2 представляют собой сплайсинг-варианты. Пример 9 относится к экспрессии и характеристике рекомбинантной PDE8A. Пример 10 детализирует получение моноклональных антител против PDE8A. Пример 11 описывает анализ экспрессии PDE8A при помощи гибридизации in situ.

Пример 1

Идентификации EST, относящихся к PDE человека

С использованием последовательностей известных 3',5'-циклический нуклеотид-фосфодиэстераз человека был предпринят поиск в базе данных экспрессируемых маркеров последовательностей (EST) Национального Центра Информации Биотехнологии (NCBI) для идентификации кДНК-фрагментов, которые могли бы быть потенциально применимы для идентификации новых генов фосфодиэстераз (PDE). Эта база данных содержит последовательности ДНК, представляющие один или оба конца кДНК, собранные из многочисленных источников тканей. Один цикл секвенирования выполняют на одном или обоих концах этой кДНК и качество этой последовательности ДНК варьируется чрезвычайно сильно. Во время проведения поисков на PDE база данных последовательностей EST содержала более 600000 кДНК-последовательностей из разнообразных организмов.

Поиск на новые последовательности PDE включал в себя три стадии. В первой стадии использовали программу BLASTN, доступную через NCBI, для идентификации последовательностей ДНК в базе данных последовательностей EST с гомологией в отношении последовательностей кДНК, кодирующих известные PDE человека. Эта программа сравнивает испытуемую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей. кДНК-последовательности пятнадцати известных PDE человека были представлены на экспертизу и было проведено пятнадцать BLASTN-поисков; испытуемые последовательности PDE включали в себя PDE1A3 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271:796-806 (1996)], PDE1B1 [Yu, et al., Cell Signalling, in press (1997)], PDE1C2 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271:796-806 (1996)], PDE2A3 [Rosman, et al., Gene 191:89-95 (1997)], PDE3A [Meacci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3721-3735 (1992)], PDE3B [Miki et al., Genomics 36:476-485 (1996)], PDE4A5 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)], PDE4B2 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)], PDE4C [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)], PDE4D1 и PDE4D3 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)], PDE5A, PDE6A [Pittler, et al., Genomics 6:212-283 (1990)], PDE6B [Collins, et al., Genomics 13:698-704 (1992)], PDE6C [Piriev, et al., Genomics 28:429-435 (1995) и PDE7A1 [Michaeli, et al., J. Biol. Chem. 17:12925-12932 (1993)]. Результаты BLASTN исследовали и последовательности EST, которые были оценены как соответствующие каждой из пятнадцати известных кДНК PDE, были идентифицированы и собраны в таблицу. Последовательности PDE6A и PDE6B, используемые в качестве испытуемых, были усеченными на 3'-конце (с удалением части 3'-нетранслируемого района) вследствие присутствия повторяющихся элементов в 3'-нетранслируемом районе этих кДНК.

Во-вторых, программу TBLASTN NCBI использовали для исследования гомологии между последовательностью белка пятнадцати известных PDE человека (описанных выше) и шестью различными возможными белками, кодируемыми каждой из последовательностей ДНК EST. В этом поиске последовательности EST транслируют в шести рамках считывания и полученные аминокислотные последовательности сравнивают с испытуемыми аминокислотными последовательностями PDE. Последовательности, идентифицированные как гомологичные на уровне аминокислот, исследовали и любые последовательности EST, положительно идентифицированные как соответствующие известной PDE во время поиска BLASTN, описанного выше, были отброшены.

Третья стадия этого поиска включала в себя анализ последовательностей, которые не были известными PDEs. Эти аминокислотные последовательности были гомологичны известным PDE, но не были идентифицированы как один из 15 известных генов PDE во время поисков BLASTN.

Поиски по программе BLASTN идентифицировали последовательность EST (обозначенную как WO4835) из библиотеки кДНК легких эмбриона человека как кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию с каталитическим районом PDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE5A, палочкообразной альфа PDE6A, палочкообразной бета PDE6B, конусообразной альфа PDE6C и PDE7A. Эта последовательность базы данных для WO4835 представлена в SEQ ID NO:7. Результаты из анализа с применением базы данных, обсуждаемые ниже, используют в качестве примера последовательность PDE4D.

кДНК WO4835 получали из Американской коллекции типов тканевых культур (Rockville, MD), которая хранит и делает открыто доступными депозиты EST, идентифицированных и секвенированных при помощи I.M.A.G.E. (Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA). ДНК WO4835 секвенировали под расписку для подтверждения ее идентичности и определили, что она соответствует SEQ ID NO: 7.

Аминокислотную последовательность, кодируемую -1 рамкой считывания последовательности EST WO4835, узнавали все испытуемые последовательности кДНК PDE, за исключением PDE1A, 1В и 1С. С применением результатов TBLASTN с PDE4D3 в качестве примера обнаружили два района сходства. Первый район обнаружил 15/37 точных совпадений или 40% идентичность (19/37 одинаковых аминокислот) и включал в себя мотив HD(X)₂HXG(X)₁₃A (SEQ ID NO: 8), найденный во всех испытуемых последовательностях. [Charboneau, Mol. Pharmacol. Cell Regul. 2:267-298 (1990)]. Второй район обнаружил 9/20 точных совпадений или 45% идентичность и включал в себя мотив YHNxxHA, найденный в большинстве испытуемых последовательностей. BLASTN-анализ последовательности WO4835 выявил, что она была уникальной в том смысле, что она не была идентична ни одной из других последовательностей ДНК человека в базе данных банка генов (Genbank database). Введение WO4835 в базу данных EST идентифицировало эту последовательность как сходную с PIR:A48719, бычьей последовательностью PDE5A1, связывающей цГМФ, гидролизующей цГМФ. Сравнение белковой последовательности рамки -1 WO4835 с бычьей последовательностью PDE5A1 обнаружило 58/153 совпадений для общей идентичности 38%. В этом районе были небольшие районы большей гомологии; один район обнаружил 12/14 идентичных аминокислот. При условии уникального характера последовательности WO4835, ее относительно низкой гомологии с бычьей PDE5A1 и присутствия мотивов аминокислот, обнаруженных в большинстве других известных аминокислотных последовательностей PDE человека, WO4835 представляет собой новую кДНК PDE человека.

Пример 2

Выделение предполагаемой кДНК PDE

кДНК-вставку WO4835 расщепляли из вектора pT7T3D на два фрагмента рестриктазами EcoRI и HindIII и эти два фрагмента очищали при помощи двух последовательных плавящихся при низкой температуре агарозных гелей. Оба фрагмента использовали в качестве зондов для скрининга библиотек кДНК, полученных из сердца человека (Stratagene, La Jolla, CA) и мозга эмбриона человека (Stratagene), с применением процедур, установившейся практикой в данной области. Скринировали приблизительно 5×10⁵ фагов из каждой библиотеки. Гибридизацию проводили в течение ночи в буфере, содержащем 3Х SSC, 0,1% саркозил, 20 мМ фосфат натрия, рН 6,8, 10Х раствор Денхардта и 50 мкг/мл ДНК спермы лосося, при 65°С. Фильтры промывали при 65°С в буфере, содержащем 2Х SSC и 0,1% ДСН, перед авторадиографией.

Девять клонов из библиотеки кДНК мозга эмбриона и два клона из библиотеки кДНК сердца гибридизовались с зондом WO4835. Частичное секвенирование и картирование привело к отбору одного клона из библиотеки мозга эмбриона, обозначенного FB66a, для дальнейшей характеристики.

Второй скриниг приблизительно 7,5×10⁵ фагов из библиотеки кДНК мозга эмбриона в условиях, использованных в первом скрининге, с применением фрагмента EcoRI/HindIII 1,3 т.п.н. из 5'-части WO4835 дал девятнадцать дополнительных клонов кДНК. Шесть из этих кДНК также гибридизовались с фрагментом HindIII/KpnI WO4835, включающим в себя район из 256 нуклеотидов при 5'-конце WO4835. Частичное секвенирование и картирование пяти из этих клонов привело к отбору второго клона, обозначенного FB85c-2, для дальнейшего анализа.

Пример 3

Анализ последовательности ДНК FB66a и FB85c-2

Последовательность ДНК FB66a определяли для обеих цепей с использованием ДНК-олигонуклеотидных праймеров, приведенных ниже в SEQ ID NO:9-31, и ДНК-секвенатора Perkin Elmer Applied Biosystems Division 373A в соответствии с предлагаемым изготовителем протоколом. Количество ПЦР-продукта, используемого в качестве матрицы, рассчитывали на основании размера ПЦР-продукта и продукт секвенировали с применением готового реакционного набора для секвенирования (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) с ДНК-полимеразой ApliTaq, FS (Perkin Elmer, Foster City, CA) и асимметричной ПЦР. Продукт реакции очищали на вращаемой колонке AGCT (Advanced Genetic Technologies Corp., Gaithersburg, MD) и сушили. Буфер для нанесения добавляли к каждой очищенной пробе и смесь нагревали при 90°С в течение двух минут. Раствор переносили на лед и выдерживали до нанесения на 4% полиакриламидный гель. Результаты собирались автоматически, как только была инициирована программа сбора данных, и анализировались автоматически и регистрировались с применением программы анализа последовательности (Sequence Analysis program). Все редактирование выполняли вручную и полученные последовательности выстраивали для определения консенсусной последовательности.

M13Rev.1	GGAAACAGCTATGACCATG	SEQ ID NO:9
W48A2	ACTCTCCAAGGAAATACAG	SEQ ID NO:10
W48A9	CTGTCTCTGCACTAACAC	SEQ ID NO:11
W48A4	TTGGCAAGGCCTCTGCAT	SEQ ID NO:12
W48S1	CCTCTATGAACTGAGCAG	SEQ ID NO:13
W48A1	GAAGGCACTGCCACTGAT	SEQ ID NO:14
W48S6	TCGAGCTGTATCGGCACT	SEQ ID NO:15
W48A5	AGCGTGTGATTGTTCTGAA	SEQ ID NO:16
W48S7	TGCTGGCCAAGTATCAAG	SEQ ID NO:17
W48A6	AAGGTCACAGGCAGTCAT	SEQ ID NO:18
W48S2	GAAGAGTGGCAAGGTCTC	SEQ ID NO:19
W48S3	TCATGACCTGGACCACCAG	SEQ ID NO:20
W48A8	CCTTCTTGAAGAGGTTTGC	SEQ ID NO:21
W48S4	ATGACTGCCTGTGACCTT	SEQ ID NO:22
W48S5	CTGCTATACAACCCTTACC	SEQ ID NO:23
W48S8	GCTAATATTGCTGAGGCC	SEQ ID NO:24
W48A7	TAAGTGAGAGGTGACTGC	SEQ ID NO:25
W48S9	CCTAAAGGGCTGAGATCA	SEQ ID NO:26
W48S10	CGCAGTCACCTCTCACTT	SEQ ID NO:27
M13	TGTAAAACGACGGCCAGT	SEQ ID NO:28
W48A11	ACAAAACGCCTATGGTGG	SEQ ID NO:29
W48A10	TTGATCTCAGCCCTTTAGC	SEQ ID NO:30
W48S11	TCATGTGGCAGGAAACTG	SEQ ID NO:31

кДНК FB66a, представленная в SEQ ID NO:3, имеет длину 4389 нуклеотидов и, от нуклеотида 3 до нуклеотида 2411, кодирует белок из 803 аминокислот с предсказанной молекулярной массой приблизительно 90775 Да (дальтон). Расшифрованная аминокислотная последовательность для FB66a представлена в SEQ ID NO:4. Первый метионин кодируется при нуклеотиде 45; отсутствие по ходу транскрипции в рамке считывания стоп-кодона делает неясным, является ли этот остаток внутренним метионином или началом открытой рамки считывания.

Последовательность ДНК FB85c-2 (SEQ ID NO:5) определяли подобным образом с использованием праймеров M13Rev.1, W48A2, W48A9, W48A4, W48S1, W48A1, W48S6, W48A5, W48A6, W48S2, W48S3, W48S4, W48S5, W48S7, W48A8 и М13. FB85c-2, по-видимому, включает в себя две отличающиеся вставки ДНК, только одна из которых была гомологична WO4835. Район, гомологичный WO4835, был длиной приблизительно 2,8 т.п.н. Точная последовательность на 5'-конце этой вставки не могла быть определена и, следовательно, несколько сотен оснований последовательности, в которой может быть 5'-нетранслируемый район, не включены в последовательность из 2573 нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:5. Район нуклеотид 67 - нуклеотид 2406 кодирует белок, имеющий 779 аминокислот (SEQ ID NO:6), имеющий предсказанную молекулярную массу 88353 Да. Стоп-кодон в рамке считывания делает вероятным, что метионин, кодируемый в положении нуклеотида 67, является инициирующим метионином.

Белки, кодируемые FB66a и FB85c-2, имеют различные аминоконцевые последовательности, которые могут быть связаны с альтернативным