Способ прогнозирования исходов программы эко и пэ

Способ прогнозирования исходов программы эко и пэ

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет применение для прогнозирования оплодотворения in-vitro с целью повышения эффективности метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКОиПЭ).

Проблема лечения бесплодия в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2004). Частота бесплодия в России составляет 10-15%, а в некоторых регионах превышает 15%-ный уровень, определенный проблемной группой ВОЗ как критический, влияющий на демографические показатели (Кулаков В.И., 1999). Сегодня все большее распространение в нашей стране и во всем мире получает метод лечения бесплодия путем экстракорпорального оплодотворения и переноса дробящихся эмбрионов в полость матки пациентки. Если в 1987-1990 эффективность метода составляла 10-15% на один перенос эмбриона, то в настоящее время этот показатель увеличился до 25-35% случаев. Вместе с тем, в клиниках, применяющих метод ЭКО и ПЭ, продолжается поиск новых подходов повышения эффективности метода.

Программа ЭКО и ПЭ сложна в связи с тем, что она многоэтапная, но не все этапы можно объективно проконтролировать. В известной мере часть неудачных исходов ЭКО заложена в самой природе репродуктивного процесса человека, составляющего около 20% для супружеской пары в возрасте 20 лет (Никитин А.И.,1995). В связи с этим возникла идея стимуляции суперовуляции с целью получения большего числа яйцеклеток за счет применения гонадотропинов. Однако увеличение количества яйцеклеток влечет за собой другой отрицательный фактор - некоторые из них могут оказаться неполноценными, с нарушением оогенеза или хромосомной патологией, а другие могут стать на путь обратного развития в процессе фолликулогенеза. С целью улучшения качества ооцитов и предотвращения преждевременного их созревания за счет выброса эндогенного лютеинизирующего гормона в схему стимуляции суперовуляции включают агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (Fleming R. et al., 1990).

Весьма важным фактором для исхода ЭКО является состояние мужских половых клеток. В то же время значительный прогресс, связанный с внедрением в практику метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, позволяет иметь потомство мужчинам с тяжелыми формами заболеваний, ранее обреченным на абсолютное бесплодие (Леонов с соавт., 1999).

Готовность эндометрия - важнейшее условие успешной имплантации перенесенного в матку эмбриона (Tabibzadeh S. et al., 1995). При подозрении на наличие нарушений циклической трансформации эндометрия ряд авторов рекомендуют проводить предварительную терапию лекарственными средствами, содержащими прогестерон и эстрадиол (Ffrindler S. et al., 1992).

Очень важным фактором, влияющим на успешность имплантации эмбриона, является процесс его переноса в матку (Tomar et al., 2002). Но в настоящее время существуют различные типы катетеров, обеспечивающие проведение данной процедуры атравматично (Mansour R.T. et al., 2002). Кроме этого, проведение гистерскопии до проведения программы ЭКО позволяет оценить состояние стенок цервикального канала, эндометрия и в случаях наличия патологии произвести соответствующие оперативные вмешательства.

Существенным моментом, оказывающим влияние на успех имплантации эмбриона, является возраст женщины. Однако учитывая использование донорских ооцитов, частота успешных результатов программы ЭКО и ПЭ не различается у пациенток раннего и позднего репродуктивного возраста (Craft J., 1990).

Особое внимание следует уделить инфекционной заболеваемости, поражающей половую систему, что может приводить к нарушению оплодотворения in-vitro и наступлению беременности, препятствовать рождению здорового потомства (Steyaert С.R., et al., 2000). Поэтому существенным моментом в реализации программы ЭКО и ПЭ является своевременное выявление и лечение у супружеской пары инфекций, тесно связанных с репродуктивной системой, входящих в так называемый TORCH-комплекс (токсаплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции, хламидиоз, сифилис, гепатиты А и В, гонококковая инфекция, листериоз) (Кузьмичев Л.Н., 1998).

Определяющим фактором положительного результата программы ЭКО и ПЭ является состояние эмбриона, которое определяет успешность имплантации П (Lenz J.V. et al., 1996). В то же время для того чтобы получить эмбрионы хорошего качества, необходимо, чтобы развитие преовуляторного ооцита не было нарушено в условиях оплодотворения in-vitro.

Исследования последних лет подтверждают гипотезу о том, что множество иммуноактивных цитокинов участвуют в процессах имплантации и плацентарного развития. Изменение материнского Т-хелперного (Th) клеточного ответа, необходимого для наступления нормальной беременности резко изменяется от реакции Thi- к Тh2-типа. Напротив, персистенция ответа Тh1-типа характерна для нарушения течения беременности ранних сроков (Hill J.A. et al., 1995). Это мнение поддерживается многими клиническими исследованиями (Marzi M. et al., 1996; Raghupathy R. et al., 2000; Makhseed M. et al., 2001), в которых убедительно показано, что повышение продукции периферическими лимфоцитами Th1 цитокинов наблюдается у женщин с неблагоприятными результатами программы ЭКО и ПЭ, в отличие от доминирования Th2 реакции, характерной для нормально протекающей беременности.

В то же время получены данные, свидетельствующие о том, что цитокины, в особенности факторы роста, содержащиеся в фолликулярной жидкости, являются важными модуляторами внутриовариальных процессов, регулирующими развития ооцита (Kane M.T. Morgan P.M. Coonan С. Peptide growth factors and preimplantation development// Hum. Reprod. Upd.- 1997-Vol.3 - 137-157).

Сниженное содержание инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в фолликулярной жидкости было выявлено в группе бесплодных пациенток, имеющих эндометриоз, дисфункцию яичников и низкие результаты программы ЭКО и ПЭ (Cunha-Filho J.S.L., Lemos N.A., Freitas F.M., Kiefer K, Faller M.,Passos E.P. // Insulin-like growth factor (IGF)-l and IGF binding protein-1 and -3 in the follicular fluid of infertile patients with endometriosis Hum. Reprod.- 2003-18-423-428).

Некоторые исследователи связывают сниженные концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) в фолликулярной жидкости с получением ооцитов и эмбрионов более высокого качества, увеличением частоты наступления беременности (Friedman C.I., Seifer D.B., Kennard E.A., et al.. Elevated level of follicular fluid vascular endothelial growth factor is a marker of diminished pregnancy potential // Fertil. Steril. - 1998-70-836-839; Barroso G., Barrionuevo M., Rao P. et al Vascular endothelial growth factor, nitric oxide, and leptin follicular fluid levels correlate negatively with embryo quality in IVF patients// Fertil. Steril.-1999-V.72-P.1024-1026).

Известно, что более высокие концентрации трансформирующего фактора роста (ТФР- b1) в фолликулярной жидкости достоверно связаны с успешным преэмбриональным развитием, повышенными уровнями имплантации эмбрионов и наступления беременности (van Rooij I.A.J., M.Broekmans F.J., te Velde E.R. Serum anti-Mullerian hormone levels: a novel measure of ovarian reserve// Hum. Reprod.- 2002-17-3065-3071).

Hammadeh M. E. и соавт. (2002) не обнаружили значимых изменений в концентрации колониестимулирующего фактора роста в фолликулярной жидкости при сравнительном изучении пациенток с различными факторами бесплодия (трубным, эндометриозом, бесплодием неясного генеза и мужским фактором) (Hammaden M.E., Ertan A.K., Zeppezauer M. et al.Immunoglobulins and Cytokines Level in Follicular Fluid in Relation to Etiology of Infertility and their.//AJRI 2002-47-82-90).

Однако общими недостатками перечисленных выше работ является: проведение определений факторов роста в фолликулярной жидкости в группах пациенток с различными этиологическими факторами женского и мужского бесплодия, иными словами, отсутствуют критерии включения и исключения в группы исследования по этиологическому принципу. В работах также отсутствует информация о показаниях к проведению программы ЭКО и ПЭ. Также существенным недостатком перечисленных выше работ следует признать отсутствие сведений о содержании факторов роста в фолликулярной жидкости в случаях остановки оплодотворения ооцитов или эмбрионов.

Таким образом, на сегодняшний день накоплены определенные сведения, свидетельствующие о возможном прогнозировании результатов программы ЭКО и ПЭ на основании определения содержания факторов роста в фолликулярной жидкости.

В то же время известно о том, что в группе пациенток с трубным бесплодием при проведении программы ЭКО отсутствие оплодотворения яйцеклеток in-vitro отмечается в 9% случаев, а остановка развития эмбриона в 8,4% случаев (Witkin, S.S et al., 1996). При этом следует особо подчеркнуть, что в России для абсолютного большинства пациенток основным показанием для программы ЭКО и ПЭ является трубное бесплодие.

В связи с чем необходима дальнейшая разработка способов, позволяющих проводить прогнозирование оплодотворения in-vitro, причем в первую очередь для данной категории пациенток, что является особенно актуальным в случаях применения дорогостоящих методов лечения бесплодии, к которым относится ЭКО и ПЭ.

Прототипом изобретения выбран способ оценки развития ооцитов путем исследования маркеров в фолликулярной жидкости, полученной во время пункции фолликулов и аспирации их содержимого при проведении программы ЭКО и ПЭ, с целью определения исходов программы. Сущность данного исследования заключается в том, что в фолликуллярной жидкости определяют более высокие уровни инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и низкие интерлейкина-1, что свидетельствуют о благоприятном прогнозе для наступления беременности. (Mendoza С., Ruiz-Requena E., Ortega E., Cremades N., Martinez F., Bemabeu R., Greco, E., Tesarik, J.Follicular fluid markers ofoocyte developmental potential.// Hum. Reprod.-2002-17- 1017-1022).

Недостатками прототипа являются: во-первых, отсутствие четких критериев, при каких значениях исследуемых маркеров следует думать о неблагоприятном исходе программы ЭКО, что снижает точность и информативность данного способа; во-вторых, данное исследование проведено в группе пациенток без патологии со стороны репродуктивной системы, показанием для проведения программы ЭКО был мужской фактор бесплодия, в связи с чем оплодотворение in-vitro осуществлялось с помощью интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида, в то время как основными показаниями к проведению программы экстракорпорального оплодотворения является трубное бесплодие; в-третьих, отсутствуют сведения о пациентках, которым перенос эмбрионов не производился в связи с нарушенным оплодотворением in-vitro.

Указанные недостатки устраняются в предлагаемом изобретении. Задача изобретения - повышение точности способа и его информативности.

Поставленная задача решается тем, что после проведения пункции фолликулов, аспирации их содержимого и выделения ооцитов проводится определение средних концентраций ФНО-α и β-ФРФ. Прогностический индекс (ПИ) получается при расчете формулы: ПИ=0,0027·Х+Y·(+8,9626·10^-7·Y-3,0827·10^-6·Х)0,1448, где Х- ФНО-α, Y- β-ФРФ. Значение ПИ равное или больше, чем 0,3038 свидетельствует о том, что оплодотворения in-vitro будет нарушено. Достоверность полученной формулы - P-value: 2,299e-8

Технический результат, получаемый в результате проведения прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ данным способом, заключается в том, что:

1) существенно повышается точность и информативность прогноза исходов программы ЭКО и ПЭ на ранних этапах ее выполнения;

2) можно провести исследование полученного материала во время пункции (фолликулярную жидкость и клеток, содержащихся в ней) с целью своевременного обследования пациентки;

3) повышается результативность следующих программ ЭКО с помощью проведения этиотропной терапии пациентки с учетом результатов обследования;

4) можно принять своевременное решение об интрацитоплазматической инъекции сперматозоида с целью улучшение результата оплодотворения in-vitro;

5) снижается психологическая нагрузка на пациентку, ожидающую информацию о результатах оплодотворения in-vitro и дне переноса эмбрионов вследствие раннего предупреждения о возможном неблагоприятном исходе оплодотворения.

6) снижается лекарственная нагрузка на пациентку за счет исключения ее из программы ЭКО и ПЭ.

Критерием успеха одного из наиболее важных этапов программы ЭКО является получение эмбрионов хорошего качества. В то же время развитие эмбриона in-vitro напрямую связано с состоянием ооцита и интровариальными процессами, обеспечивающими его развитие, которые происходят, как было отмечено выше, при непосредственном участии факторов роста, определение содержания в фолликулярной жидкости которых может способствовать прогнозированию исходов программы ЭКО и ПЭ на ранних этапах ее проведения.

С целью разработки способа прогнозирования результатов программы ЭКО и ПЭ нами было проведено исследование содержания в фолликулярной жидкости факторов роста - ФНО-α и β-ФРФ в 637 фолликулах у 75 пациенток с трубным фактором бесплодия, обратившихся в Ростовский НИИ акушерства и педиатрии. Из 36 пациенток (1 группа) оплодотворение in-vitro было нарушено на этапе развития яйцеклеток в 61,2% (22) случаев, а на этапе развития эмбрионов в 38,8% (14). Перенос эмбрионов в данной группе не проводился. Во вторую группу исследования были включены 39 пациенток, у которых оплодотворения in-vitro протекало нормально и закончилось переносом эмбрионов. Прогностическая формула (ПИ) была получена на основании сравнительного анализа средних концентраций ФНО-α и β-ФРФ в группах пациенток с произошедшим оплодотворением in-vitro и с отсутствием оплодотворения in-vitro. Математический анализ проводился с помощью программного обеспечения PolyAnalist 3.5 (Megaputer Intelligence).

Анализ научно-медицинской и патентной литературы позволил установить, что изучению нарушений оплодотворения in-vitro посвящены лишь единичные исследования, сводящиеся к определению неблагоприятного влияния жидкости, содержащейся внутри гидросальпинкса, на развитие и имплантацию эмбриона в эксперименте (Arrighi C.V. et aL, 2001, Carrasco I.et al., 2001, Ajonuma L.C. et al., 2003). В других работах нарушение оплодотворения при культивировании ооцитов связывают с клеточными или генетическими нарушениями, которые называют «фактор ооцита», причем, как подчеркивают сами авторы, данные выводы требуют дальнейшего уточнения (Levran D. et al., 2002).

В то же время большинство пациенток, страдающих трубным бесплодием, имеют хронический воспалительный процесс, который вызывает у них спаечную болезнь органов малого таза. Спайки органов малого таза могут быть последствием реконструктивно-пластической хирургии или тубэктомии. Назначение гонадотропинов во время контролируемой стимуляции суперовуляции может быть одним из факторов, способствующих обострению хронического воспалительного процесса придатков матки, что ведет к появлению клеточных и плазменных медиаторов воспалительного процесса - цитокинов, к которым относятся факторы роста ФНО-α и β-ФРФ.

ФНО-α и β-ФРФ, содержащиеся в фолликулярной жидкости, могут быть секретированы клетками гранулезы и лейкоцитами: В-лимфоцитами, моноцитами, естественными киллерами, количество которых увеличено при воспалительных заболеваниях органов малого таза. Теоретически, они также могут попадать в фолликулы из перитонеальной жидкости за счет диффузии через овариальную капсулу в случаях воспалительного процесса органов малого таза, однако эти данные в настоящее время в литературе отсутствуют. Вместе с тем исследование Cheong Y.C. с соавт. (2002) свидетельствует о высоких концентрациях ФНО-α в перитонеальной жидкости при спаечной болезни органов малого таза, что может также оказывать негативное влияния на процессы оогенеза. Факторы роста могут оказывать действие на клетки фолликула различными путями: аутокринным, паракринным, интракринным и эндокринным (Mandrup-Poulsen Т. et al., 1995; Vinatier D. et al., 1995). ФНО-α может вызвать снижение функции яичников на фоне воспалительного процесса в связи ингибированием стимулируемого гонадотропином стероидогенеза в недифференцированных овариальных клетках вследствие снижения секреции аденилилциклазы и ц-АТФ (Terranova P.F., Rice V.M., 1997). Кроме этого, повышенные концентрации ФНО-α в фолликулярной жидкости приводят к апоптозу (Matsubara H. et al, 2000).

В настоящее время получены данные, свидетельствующие о ингибировании продукции эстрогенов ФНО-α (Pottratz S.T. et al., 1994). Более того, установлено, что ФНО-α ингибирует продукцию прогестерона желтым телом и вызывает атрезию фолликула (Buscher U. et al., 1999, Nash M. A.et al., 1999; Yeh J. and Adashi E.Y., 1999; Doraiswamy V. et al, 2000). Увеличение концентрации ФНО-α в фолликулярной жидкости может отрицательно влиять на овуляцию и на оплодотворение in-vitro (Cianci A. et al., 1996) и оказывать эмбриотоксический эффект (Sung L. et al., 1997). С другой стороны, известно, что яичник является органом с чрезвычайно высоким уровнем ангиогенеза (Redmer, D.A. and Reynolds, L.P., 1996) и рост сосудистой части тека-ткани фолликулов регулируется β-ФРФ (Schams D. et al., 1996). Существует также гипотеза, что низкие уровни эстрогенов в сыворотке крови, недостаточные для пролиферации клеток, зависят от различных факторов роста, в том числе от β-ФРФ (Hermenegildo С., Сапо А., 2000). Имеются также сведения о важном значении β-ФРФ для предимлантационного развития эмбриона (Chai N. et al., 1998).

Проведенные исследования позволили установить зависимость между концентрациями ФНО-α и β-ФРФ в фолликулярной жидкости и оплодотворением in-vitro. Определение содержания указанных факторов роста позволяет прогнозировать результат оплодотворения in-vitro на ранних этапах проведения программы ЭКО и ПЭ.

Подробное описание способа и примеры его конкретного применения.

Для реализации способа используют следующую аппаратуру: стандартный набор оборудования и оснащения для лабораторий ЭКО и ПЭ, фотометр (Victor, 1420 Multilabel counter, Wallac, Финляндия). Уровень концентраций в фолликулярной жидкости цитокинов определяли с помощью коммерческих тест-систем ФНО-α (CytElisa) и β-ФРФ (ACCUCYTE) (CYTIMMUNE, Science INC., США).

Стимуляция суперовуляции проводится по «короткому протоколу» с использованием аналога гонадолиберина (Диферелин, Бофур Ипсен) в ежедневной дозе 0,1 мг, который назначается в первый день менструального цикла после ультразвукового исследования. На следующий день начинают стимуляцию фолликулогенеза введением препаратов рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (Пурегон, Органон) в суточной дозе 150-250 ME. Стимуляция проводят до дня достижения лидирующими фолликулами диаметра 18 мм, определяемого при трансвагинальной эхографии, после чего назначают инъекцию «овуляторной дозы» хорионического гонадотропина (Прегнил, Органон).

Через 35-36 часов после инъекции хорионического гонадотропина проводится трансвагинальная пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов. Трансвагинальная пункция производится в гинекологическом кресле с помощью ультразвукового аппарата «ALOKA SAL500» (Япония). Промежность и влагалище дезинфицируются. Пациентку укрывают простынями, оставляя открытой промежность. С помощью влагалищного датчика с установленной на нем специальной насадкой для пункционной иглы проводится ультразвуковое исследование органов малого таза для выбора оптимальной позиции расположения пункционной траектории. После определения правильного направления пункционной траектории через просвет насадки влагалищного ультразвукового датчика проводится пункция содержимого фолликулов с помощью иглы. Аспирация содержимого фолликулов производится с использованием вакуум-отсоса, под давлением 80 мм рт.ст., обеспечивающим поступление аспирата в стерильные пробирки. Полученную фолликулярную жидкость передают эмбриологу для идентификации и выделения из нее ооцитов. Подготовка спермы проводится с использованием методики swim-up в среде Mtdium B1 (CCD, Франция). Аспирированные ооциты инсеминируются и культивируются в среде В2 INRA MEDIUM (CCD, Франция). Образцы фолликулярной жидкости центрифугируются при скорости 400 g в течение 10 минут и чистая фракция используется для определения в ней ФНО-α и β-ФРФ. Методика определения ФНО-α и β-ФРФ описана в инструкции производителя коммерческого набора.

Полученные значения ФНО-α и β-ФРФ подставляются в формулу расчета ПИ=0,0027·X+Y·(+8,9626·10^-7·Y-3,0827·10^-6·X)-0,1448, где Х - ФНО-α, Y - β-ФРФ, и если значение ПИ равное или больше, чем 0,3038, то прогнозируют неблагоприятный исход ЭКО и ПЭ, что является показанием для исключения женщины из программы и направление ее на дополнительное обследование.

Приводим клинические примеры, подтверждающие работоспособность способа.

Пример 1.

Пациентка П-ва Л.В., 35 лет, история болезни №582/60, дата пункции фолликулов 14.06.01.

Диагноз: Хронический двухсторонний сальпингит. Состояние после сальпингоовариолизиса, сальпингостомии. Синдром Фитц-Хью-Куртиса. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-α=20,5 пг/мл, β-ФРФ=167,5 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ=-0,0501, что свидетельствовало о благоприятном исходе ЭКО. В результате культивирования ооцитов in-vitro были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.

Пример 2.

Пациентка Ч-ва Н.В. 28 лет, история болезни №4094/441, дата пункции фолликулов 19.06.02г.

Диагноз: Состояние после 2-сторонней тубэктомии. Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-α=315,1 пг/мл, β-ФРФ=1210,0 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ = 1,1933, что свидетельствовало о неблагоприятном исходе ЭКО. В результате культивирования ооцитов оплодотворение in-vitro не произошло, эмбрионы получены не были.

Пример 3.

Пациентка Ш-к И.В., 33 года, история болезни №2529/286, дата пункции фолликулов 13.04.02 г.

Диагноз: Состояние после 2-сторонней тубэктомии. Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие.

Средние концентрации составили ФНО-α=87,0 пг/мл, β-ФРФ=482,3 нг/мл.

После подстановки полученных данных в формулу было получено значение ПИ = 0,3038, что свидетельствовало о неблагоприятном исходе ЭКО и ПЭ. В результате культивирования ооцитов оплодотворение in-vitro не произошло, эмбрионы получены не были.

По материалам заявляемого способа прогнозирования программы ЭКО и ПЭ нами обследовано 152 пациентки, обратившихся для проведения экстракорпорального оплодотворения по поводу трубного бесплодия в Ростовский НИИ акушерства и педиатрии. Возраст обследованных больных колебался от 24 до 36 лет, в среднем составляя 29,4±2,2 года. Из них у 59% диагностировано первичное бесплодие, у 41%-вторичное. Длительность бесплодия варьировало от 6 до 14 лет, составляя в среднем 7,4±2,1 года. У 11 пациенток значения ПИ составили более 0,3038, оплодотворение in-vitro в этих случаях не произошло, что послужило основаниям для проведения их дальнейшего обследования. У остальных пациенток значения ПИ составили менее 0,3038, оплодотворение in-vitro в этих случаях произошло и им был произведен перенос эмбрионов.

Заявляемый метод основан на использовании стандартного лабораторного оборудования, не требует технической модификации. Использование данной методики позволяет врачу в первые сутки культивирования ооцитов предсказать результат оплодотворения с целью разработки дальнейшей тактики ведения пациентки и проведения дополнительных лабораторных исследований с целью уточнения причин нарушения оплодотворения. Заявленный способ может использоваться в гинекологических стационарах, использующих программу ЭКО и ПЭ.

Способ прогнозирования исхода программы ЭКО и ПЭ путем исследования фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости проводят количественное определение содержания ФНО-α и β-ФРФ, рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле

ПИ=0,0027·Х+Y·(+8,9626·10^-7·Y-3,0827·10^-6·Х)-0,1448,

где Х - количество ФНО-α, Y - количество β-ФРФ, и при значении ПИ, меньшем, чем 0,3038, прогнозируют благоприятный исход оплодотворения in-vitro, а при значении, равном или большем, чем 0,3038, прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in-vitro.