Способ получения гетерологичного белка в прорастающих семенах двудольных растений

Способ получения гетерологичного белка в прорастающих семенах двудольных растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области биотехники и, в частности, касается способа превращения запасных веществ трансгенных семян двудольных растений на основе принципа источник - сток в композиции, содержащей один или несколько представляющих интерес генных продуктов. В изобретении также раскрываются композиции на основе прорастающих семян, включающие как минимум один генный продукт в семядолях прорастающих семян или в среде, окружающей прорастающие семена или проростки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время способы получения терапевтически активных белков млекопитающих путем выделения и очистки таких белков непосредственно из самих млекопитающих вследствие высокого риска заражения почти полностью были заменены технологией рекомбинантных ДНК, которая обеспечивает новые способы получения требуемых в промышленности белков млекопитающих в больших количествах. Методы рекомбинантной ДНК обеспечивают большой выбор хозяев и систем экспрессии. Если нужны белки млекопитающих, то предпочитают использовать эукариотические системы экспрессии, чтобы получить гликозилированные формы этих белков.

Наиболее эффективную систему экспрессии для получения гликозилированных белков в большом объеме и с низкими затратами обеспечивают грибы. Грибы с успехом применяются для получения их собственных белков в больших количествах, однако они менее эффективны при получении гетерологических белков, таких как белки млекопитающих терапевтического назначения.

В настоящее время грибы используют в основном для широкомасштабной продукции гомологических промышленных ферментов, тогда как для получения гликозилированных гетерологических белков исследования сосредоточились на поисках альтернативных систем экспрессии. Поскольку профили гликозилирования и процессы укладки в растительных системах экспрессии близки таковым у млекопитающих, то растительные системы экспрессии являются наиболее экономически эффективными из всех имеющихся. Основной интерес был направлен на продукцию фармацевтических продуктов и важных для промышленности ферментов. Можно указать на получение интерферона, энкефалинов, фактора роста эпидермиса и сывороточного альбумина человека в растениях табака и/или картофеля. Уровни экспрессии в трансгенных растениях были достаточно низкими.

Обычно чужеродные гены в растениях экспрессируют под контролем сильных тканеспецифичных растительных промоторов в развивающихся органах растений. Типичными примерами являются промотор запасных белков семян или клубнеспецифичный промотор пататина в клубнях картофеля. В качестве альтернативы используют культуры клеток или органов и культуры водорослей, а также еще более сложные системы, включая системы на основе вирусов растений, в которых искомый ген встроен в геном вируса и экспрессируется одновременно с вирусными белками. Самые передовые системы основываются на индуцибельной экспрессии и секреции рекомбинантного белка в среду.

В патентах US 5,693,506 и US 5,994,628 раскрыта продукционная система для получения чужеродных белков в прорастающих семенах однодольных растений. Рекомбинантные белки экспрессируют под контролем сильного промотора амилазы в клеточной культуре или в прорастающих семенах, а белок секретируется в питательную среду или экстрагируется из солода. В семенах однодольных растений запасные вещества в основном состоят из крахмала эндосперма. Запасы белка у однодольных растений небольшие по сравнению с семенами двудольных растений. Кроме того, если даже уровень экспрессии амилазы в отдельных клетках высок, в семенах она экспрессируется лишь в небольшом числе клеток. Эти клетки ограничиваются щитком зародыша и алейроновым слоем эндосперма. Существует большая потребность в более экономичных системах, в которых бы использовались белки и масла из запасных веществ семян двудольных растений. В патентах US 5,543,576 и US 5,714,474 раскрыт способ, в котором трансгенные семена добавляют в корма без предварительного проращивания и в размолотом виде в качестве дополнительного источника ферментов.

В патенте US 5,670,349 раскрыто применение индуцируемых при повреждении промоторов HMGR/HMG2 для экспрессии рекомбинантных белков в листьях табака, собранных свежими в поле. Нанесение повреждений на свежий или хранившийся растительный материал путем иссечения или смятия вызывает быстрое усиление экспрессии. Однако содержание белка в листьях табака невелико по сравнению с тем, что можно получить из семян двудольных растений. Кроме того, срок годности у свежих листьев несравним с сухими семенами в отношении времени, пространства и/или затрат на хранение. Использование свежего растительного материала типа листьев, собранных в поле, также является важным источником микробного заражения, что представляет серьезную проблему в технологии ферментации.

В патентных заявках WO 94/11519 и WO 97/32986 раскрыты способы и установки для получения продуктов деградации и превращения у растений с помощью процесса солодования. В этих способах предлагается использовать ферменты глиоксисом, которые катализируют превращение жирных кислот в ацетил-СоА. В норме ацетил-СоА идет на образование органических кислот, которые экспортируются из глиоксисом и поступают в другие метаболические пути, такие как дыхание и синтез сахара, что предлагается заменить генами, кодирующими ферменты пути, ведущего к полигидроксиалканоатам, которые полезны для получения биоразрушаемых термопластиков.

Следует заметить, что даже если процесс солодования известен и применяется главным образом для переработки однодольных растений, этот процесс ограничивается переработкой крахмала. Раскрытые в патентах WO 94/11519 и WO 97/32986 способы, даже если они предполагают использование запасных веществ двудольных растений, ограничиваются применением ферментов и путей, ведущих к образованию сахара и получению энергии, и способами переключения этих продуктов из дыхательных путей на ресинтез.

Даже если процесс солодования известен, как и способы переключения дыхательных путей у растений на продукцию полигидроксиалканоатов, получение белковых продуктов типа структурных белков и ферментов из запасных веществ двудольных растений не было разработано.

Следует заметить, что существует большой спрос на белковые продукты, поэтому главной целью настоящего изобретения является решение проблемы превращения запасных веществ у растений в различные белковые продукты, из которых затем можно получать другие продукты.

Главная задача настоящего изобретения - обеспечить новый, более практичный, экономически эффективный, экологически благоприятный способ и продукционную систему для получения генных продуктов, особенно белковых генных продуктов, в семядолях трансгенных семян двудольных растений. Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что оно предусматривает продукционную систему закрытого типа, в которой генный продукт можно вырабатывать в помещении, а не в поле. Это дает возможность осуществлять настоящий способ в условиях, практически свободных от заражения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цели настоящего изобретения достигаются путем переключения регуляторных последовательностей белков, временно накапливающихся при прорастании, на продукцию требуемых генных продуктов.

Характеристики настоящего изобретения изложены в Формуле изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ФИГУР

На фигуре 1А показано проросшее трансгенное семя, экспрессирующее ген GUS. Ген GUS находится под контролем промотора гена теплового шока сои. Справа показан нетрансформированный контрольный проросток.

На фигуре 1В показано проросшее трансгенное семя, экспрессирующее ген GUS. Ген GUS находится под контролем промотора эндопептидазы.

На фигуре 1С показано проросшее трансгенное семя, экспрессирующее ген GUS. Ген GUS находится под контролем салицилат-индуцируемого промотора.

На фигуре 1D показано проросшее трансгенное семя, экспрессирующее ген GUS. Ген GUS находится под контролем промотора 35S.

На фигуре 2 показано, что бесцветный субстрат β-глюкуронид (100 мкг/мл) приобретает синюю окраску в результате ферментативного превращения его в глюкопиранозидуроновую кислоту и агликон под действием фермента GUS, вырабатываемого в проросших трансгенных семенах.

На фигуре 3 показаны различные стадии прорастания семян Brassica campestris через указанное число дней после начала прорастания.

На фигуре 4 представлен SDS-PAGE-гель прорастающих семян. Образцы отбирали ежедневно, начиная с сухих семян. На окрашенном Кумасси геле отмечены запасные белки и субъединицы фермента rubisco. Как видно из фигуры, продуцируемое за день количество белка rubisco значительно повышается через 3 дня после прорастания.

На фигуре 5 представлен результат Northem-гибридизации с РНК-зондами прорастающих семян. Образцы отбирали ежедневно, начиная с сухих семян.

Определения

В настоящем изобретении большинство терминов имеют те же значения, которые они имеют в области технологии рекомбинантных ДНК, молекулярной биологии и ботаники, особенно в тех областях, что связаны с получением трансгенных растений и генных продуктов. Некоторые термины, однако, применяются в несколько другом виде и более подробно разъясняются ниже.

Термин "семянные растения" означает Spermatophyta - наиболее высокоразвитые растения, отличающиеся наличием сложных структур и полностью развитых органов - корней, стеблей, листьев, цветков и сосудистой системы. Семянные растения подразделяются на 2 класса - покрытосемянных и голосемянных. Покрытосемянные подразделяются на подклассы однодольных и двудольных. В зародыше зрелых семян однодольных имеется только одна семядоля, которая редуцирована до всасывающего органа - щитка. У двудольных в зародыше имеется две семядоли, служащие запасающими органами. Усвоенные вещества, идущие на отложение запасов в семядолях двудольных растений, поступают из материнского растения через сосудистую систему в оболочку семян, а затем в семядоли. Оболочка семян является материнской тканью, которая не имеет симпластических контактов с зародышем. Усвоенные вещества сначала поступают в апоплазматическое пространство, а затем в зародыш, где они распространяются симпластически и утилизируются при синтезе запасных веществ.

Термин "семена двудольных растений" означает семена, получаемые из двудольных растений, содержащие запасы питательных веществ из белков, жиров и углеводов, находящихся в семядолях, в отличие от семян однодольных растений, у которых запасы питательных веществ состоят главным образом из углеводов и содержат лишь небольшое количество других соединений. В настоящем изобретении термин "семена двудольных растений" означает целые семена или их фрагменты или части семян, полученные при измельчении семян, предпочтительно в сухом виде. Следует заметить, что настоящее изобретение касается двудольных растений, тогда как однодольные растения не пригодны для достижения целей настоящего изобретения.

К наиболее предпочтительным родам растений, которые могут применяться для получения генных продуктов, в соответствии со способом настоящего изобретения, относятся двудольные растения с высоким содержанием белка или жира в семенах, но не ограничиваются ими. Типичными примерами являются роды Brassicaceae, Fabaceae и Polygonaceae. Из рода Brassicaceae, например, к ним относятся следующие виды: Brassica napus, Brassica campestris, Camelina sativa, Sinapis alba, из рода Fabaceae - Lupinus angustifolius, Phaseolus vulgaris, Glysine max. Vicia faba, Lens culinaris, Pisum sativum, Vigna mungo и Medicago sativa. Из рода Polygonaceae - виды Polygonum. Подсолнечник Helianthus annuus потенциально тоже полезен из-за высокого содержания жира в семенах.

Выражение по принципу источник - сток означает такую продукционную систему или блок, которая разделяется на 2 отдельные стадии: стадию накопления, на которой происходит запасание белков, углеводов и жиров в семенах, и стадию мобилизации продукции, на которой накопленные запасы, в норме мобилизующиеся для запуска роста растения, вместо этого мобилизуются или переключаются на продукцию одного или нескольких продуктов чужеродных генов при включении системы экспрессии. Стадия накопления включает выращивание трансгенных растений практически совсем без экспрессии генного продукта в поле, тогда как продукция генных продуктов ограничивается проращиванием в закрытом помещении. Это достигается специфичностью систем экспрессии, как описано более подробно в спецификации.

Термин "окружающая среда" означает водный буферный раствор в жидком, полужидком или твердом виде, содержащий вещества, способные запускать, усиливать, задерживать или продлевать самую благоприятную стадию проращивания. "Окружающая среда" может содержать факторы, индуцирующие прорастание, факторы, усиливающие определенные процессы, и/или факторы, ослабляющие некоторые другие процессы, наряду с питательными веществами. "Окружающая среда" может представлять собой влажный отсек или комнату.

Термин "субстрат" означает твердую, полужидкую или жидкую композицию или среду, содержащую, по меньшей мере, одно соединение или вещество, которое можно превратить в другое соединение или вещество с более желательными свойствами с помощью композиций настоящего изобретения, включающих один или несколько искомых генных продуктов в качестве катализаторов.

Выражение "происходящая из семян композиция" означает неочищенную смесь, полученную способом настоящего изобретения из прорастающих семян двудольных растений, которая включает один или несколько синтезированных de novo генных продуктов, экспрессируемых в семядолях прорастающих семян двудольных растений, включая ростки, или секретируемых в среду, окружающую прорастающие семена или ростки. "Происходящая из семян композиция" может использоваться как таковая путем приведения ее в контакт с субстратом. Естественно, происходящая из семян композиция может быть высушена и/или обработана соответствующими методами, а также выделена и/или очищена перед употреблением. Альтернативно в качестве субстрата может применяться реагент, содержащий одно или несколько соединений, способных модифицировать один или несколько генных продуктов в этой композиции. Например, можно добавлять замещающие реагенты или модифицировать профили укладки генных продуктов либо удалять или добавлять фрагменты или части для того, чтобы получить более стабильный продукт. "Происходящие из семян композиции" можно формулировать, то есть добавлять соответствующие добавки типа средств, способствующих грануляции, наполнителей, смазывающих веществ и т.д. Происходящие из прорастающих семян композиции настоящего изобретения также можно добавлять в корма животным для улучшения их переваривания.

Выражение "практически стерильная продукционная система типа источник - сток" означает, что семена двудольных растений можно стерилизировать с поверхности такими способами, как облучение или химическая стерилизация. Проращивание может проводиться в или на предварительно стерилизованной среде, с помощью методов, применяемых при асептической работе и/или при работе в стерильных или сверхчистых условиях. Тот факт, что все производство может проводиться в стерильных условиях, означает, что устраняются главные причины гибели или непрорастания семян - грибковое или бактериальное заражение семян. Более того, и конечный продукт становится практически свободным от заражения и не поддается деградации со стороны примесей, обладающих протеолитической активностью. Таким образом, предложенная продукционная система особенно подходит для получения фармацевтических продуктов, требующих высоких стандартов гигиены.

Выражение "проращивание трансгенных семян двудольных растений" означает создание условий, способствующих прорастанию. Необязательно он включает хранение, сушку, стерилизацию, добавление воды, обеспечение семян индуцирующими факторами, усиливающими и/или ослабляющими факторами, а также дополнительное питание. К вспомогательным средствам относятся как физические, так и химические средства. Например, дополнительное питание включает источники N и/или С, витамины, минералы, микроэлементы и т.п. Факторы роста, факторы прорастания, индукторы, факторы, усиливающие одни и ослабляющие другие процессы во время синтеза de novo, к ним относятся, к примеру, такие гормоны растений, как ауксин и цитокинин. К физическим средствам относятся, к примеру, кратковременное или продолжительное освещение, стерилизация и/или нагрев.

Термин "экспрессионная система" означает конструкцию из ДНК, включающую одну или несколько последовательностей ДНК, кодирующих один или несколько искомых генных продуктов, которая функционально соединена с регулирующими экспрессию последовательностями - энхансерами, промоторами и/или терминаторами. Экспрессионная система предпочтительно индуцируется или может быть индуцирована при прорастании семян, но она практически не проявляется или может не проявляться, когда двудольные растения размножают и выращивают в полевых условиях. Предпочтительно регуляторные последовательности содержат промотор, который можно назвать промотором "camera obscura", то есть промотор, активизирующийся при прорастании, когда семена хранятся без освещения в темной комнате. Это не исключает применение освещения. Наоборот, подвергая продукционную систему типа "источник - сток" вспышкам света, можно усиливать выход искомого генного продукта посредством индукции и повышения активности специфических промоторов.

В экспрессионных системах используют такие регуляторные последовательности, которые особенно активны при временном синтезе de novo белков, накапливающихся в семядолях при прорастании.

Индуцибельные экспрессионные системы содержат индуцибельные регуляторные последовательности, отобранные из регуляторных последовательностей тех генов, которые кодируют белки, временно синтезируемые de novo при прорастании и накапливающиеся в семядолях и эндосперме растения.

Такие экспрессионные системы получают путем селекции соответствующих регуляторных последовательностей. Селекционный метод включает следующие стадии:

(a) выделение тотальной РНК из семядолей и/или листьев двудольного растения;

(b) получение кДНК на основе РНК путем амплификации с помощью одного праймера, специфичного к данному растению, и второго праймера, специфичного к тому белку, который синтезируется de novo при прорастании и накапливается в семядолях или эндосперме растения;

(c) сбор и рассев клонов, содержащих кДНК;

(d) сравнение результатов с клонами, полученными из выделенной из листьев РНК;

(е) выделение клонов, содержащих кДНК, проявляющую высокую активность при прорастании семян двудольного растения.

Термин "генный продукт" в настоящем изобретении означает белки и полипептиды, включая структурные белки и/или ферменты. Обычно "генным продуктом" является пептид, содержащий, по меньшей мере, 2 аминокислоты, соединенные пептидной связью. Пептиды, содержащие 2-10 аминокислот, называют олигопептидами, а пептиды, содержащие более 10 аминокислот, называют полипептидами. Полипептид может представлять собой цепь полиаминокислоты, например, цепь полилизина, состоящую только из молекул лизина, но может представлять собой и белок, белковый комплекс, либо часть или фрагмент белка.

Как сказано в предыдущем абзаце, термин "генный продукт" также может означать продукты на основе нуклеотидов типа мРНК. Этот термин также охватывает и другие желательные биохимические соединения или вещества, получаемые, к примеру, путем биотрансформации, когда один или несколько генных продуктов, находящихся в происходящих из семян композициях настоящего изобретения, действуют как катализаторы при контакте с субстратом, включающим соединение или вещество, которое может быть превращено в требуемый продукт или трансформировать генный продукт должным образом.

С другой стороны, "производные генных продуктов" получают путем биотрансформации, при которой один или несколько исходных "генных продуктов" настоящего изобретения подвергаются модификации при реакции с реагентом, входящим в состав субстрата. Генные продукты можно сделать более стабильными или более активными, изменяя их вторичную и/или третичную структуру, например, путем разворачивания или сворачивания аминокислотной цепи, удаления или добавления фрагментов, комплексирования, добавления структур или замещающих групп к этим генным продуктам. Такие "производные генных продуктов" покрываются термином "генные продукты" настоящего изобретения. Обычно генные продукты, полученные способом настоящего изобретения, являются гетерологичными чужеродными белками. Это значит, что "генные продукты" не вырабатываются растениями дикого типа. Другими словами, они не являются своими для этих растений. Естественно, собственные продукты семян тоже можно получать способом настоящего изобретения. При этом особенно удобно повысить продукцию определенных, фармацевтически полезных, гомологичных, собственных продуктов данного растения.

Выражение "выделить с или без дальнейшей обработки генного продукта, экспрессированного в прорастающих трансгенных семенах двудольных растений" означает, что семядоли и ростки можно получить в целом виде, выделяя их из окружающей жидкой среды с дальнейшей обработкой или без нее. В качестве альтернативны можно выделить вмещающую их среду. Сохранность "происходящих из семян композиций" можно улучшить посредством высушивания, экстрагирования, фильтрования, измельчения и т.д. Многие из этих способов применяются одновременно для прекращения прорастания. Нагревание, сушка, измельчение, отделение, экстрагирование, выжимание и фильтрование обычно применяются для прекращения прорастания до того, как скорость синтеза de novo и/или концентрация требуемых генных продуктов начинает снижаться. Прекращение прорастания важно потому, что если оно продолжается слишком долго, то искомые, синтезированные de novo, белки начинают использоваться для выработки других веществ, необходимых растущему растению.

Запасные вещества, накопленные в прорастающих семенах двудольных растений, в число которых входят свободные аминокислоты и другие биохимические субстраты, составляют модуль возобновляемых источников сырья, тогда как экспрессия требуемого трансгена путем регуляции транскрипции, функционирующая в семядолях при прорастании и последующем росте, образует модуль продукции (стока). Таким образом, настоящее изобретение прежде всего касается продукционной системы, состоящей из двух модулей - источника и стока, то есть двух раздельных стадий: стадии накопления сырья и стадии продукции, на которой источник сырья используется для синтеза de novo генных продуктов и их производных, или продуктов, модифицируемых генным продуктом из источника сырья, полученного на первой стадии экспрессионной системы.

Цель настоящего изобретения заключается в разработке нового способа получения генных продуктов в семенах двудольных растений на основе продукционной системы типа источник - сток. Продукционная система включает две отдельные стадии. На первой стадии используются универсальные возобновляемые источники сырья - белки и жиры, которые накапливаются в виде запасных веществ при выращивании двудольных растений и необязательно могут быть собраны в виде семян. Другая стадия включает мобилизацию запасных веществ в прорастающих трансгенных растениях для продукции одного или нескольких генных продуктов путем синтеза de novo требуемых генных продуктов с добавлением или без добавления дополнительных факторов питания и обеспечения физических и/или химических средств, а также генной инженерии для индукции прорастания и усиления и/или ослабления процессов синтеза de novo, включая транскрипцию, экспрессию и/или секрецию.

В настоящем изобретении на первой стадии используются универсальные запасные вещества - белки, жиры и/или углеводы, которые имеются в двудольных растениях, но отсутствуют у однодольных, у которых запасные вещества состоят в основном из двух родственных форм крахмала - амилозы и амилопектина. У однодольных растений крахмал мобилизуется под действием амилаз во время прорастания и последующего роста молодого растения. При этом образуется сахароза, которая используется как источник энергии и соединений углерода, но исходных материалов для синтеза de novo, особенно белков, у них намного меньше, чем у двудольных растений, вследствие чего прорастающие семена двудольных образуют несравненно лучшую продукционную систему типа источник - сток.

В настоящем изобретении семена трансгенных двудольных растений собирают с поля, транспортируют и хранят как обычно. Жизнеспособность семян при хранении можно поддерживать в течение длительного времени, обычно несколько лет. Температура и влажность семян являются главными факторами, определяющими жизнеспособность семян при хранении. Обычно семена хранят при температуре 0-5°С. В норме влажность семян при хранении составляет 4-10%. Если влажность семян составляет меньше 20%, они будут дышать и выделять тепло. При плохой вентиляции семена могут погибнуть от выделяемого тепла. Если влажность семян больше 20%, то это может вызвать их порчу из-за роста микроорганизмов.

Высыхание при созревании является нормальным процессом в развитии семян, при котором семена переходят в состояние метаболического покоя. Однако семена многих видов способны к прорастанию без высыхания. Семена помидоров прорастают, если их вынуть из созревающего плода и поместить в воду. У некоторых других видов, включая Brassica campestris, запасы крахмала быстро уменьшаются, а концентрация некоторых сахаров и олигосахаридов повышается при высыхании семян. К тому же некоторые гидрофильные белки сильно экспрессируются при высыхании семян. Они обладают способностью притягивать воду и, по-видимому, играют важную роль в защите от вредных эффектов высыхания. Зрелые сухие семена сохраняют способность к прорастанию при хранении от нескольких дней до многих лет. Как неочищенный исходный материал без добавок семена двудольных растений могут стабильно храниться в течение нескольких лет.

У двудольных растений основным видом запасных липидов являются триацилглицерины, хранящиеся в субклеточных органеллах в виде жировых включений. Содержание жира в семенах может достигать 64% у клещевины и 48% у рапса. Запасные жиры синтезируются из сахарозы, поступающей в развивающиеся семена. В цитозоле сахароза подвергается превращению до гексозофосфосфата, который переносится в пластиды или превращается в глицерол-3-фосфат (остов глицерина). В пластидах из гексозофосфосфата, малата и ацетата синтезируются жирные кислоты. В эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) остов глицерина подвергается этерификации с образованием триацилглицеринов.

У двудольных растений основным видом аминокислот, переносимых по флоэме, являются глутамин и аспарагин. В оболочке семян перед переносом в семядоли часть глутамина и аспарагина превращается в другие аминокислоты. В семядолях аминокислоты используются для синтеза запасных белков, которые хранятся в белковых включениях. На ранних стадиях развития семян клетки семядолей содержат одну или две большие вакуоли, которые потом заполняются запасными белками и постепенно фрагментируют, образуя отдельные небольшие белковые включения. Обычно семена двудольных растений содержат два или больше различных запасных белков. Например, Brassica campestris в целом содержит 24% белка, в состав которого входят 2S-альбумин, напин, 11S-глобулин и круциферин. Напин составляет 20%, а круциферин - 60% от общего содержания белка в семенах. В настоящем изобретении целесообразно использовать гены, кодирующие эти белки.

В общем случае запасные белки кодируются мультигенными семействами. Общей чертой белков просвета эндоплазматического ретикулума эукариот является наличие консервативного карбоксиконцевого тетрапептида KDEL, который служит сигналом удержания в ЭР и всегда находится последним на С-конце. Нет никаких данных, что может понадобиться больше 4 концевых аминокислот (Pelham H.R.B., TIBS 15: 483-486, 1990), хотя и были утверждения, что для эффективного удержания может иметь значение состав кислотных остатков среди последних 20 аминокислот (Wandelt C.I. et al. Plant J., 2: 181-192, 1992). Предполагается, что механизм удержания скорее всего опосредован рецепторами и включает связывание сигнала KDEL с мембранным рецептором и быстрый возврат комплекса сигнал-рецептор в ЭР, где он высвобождается в виде везикулы (Pelham H.R.B., TIBS 15: 483-486, 1990).

Генетически модифицированные белки не всегда находятся в своем естественном клеточном компартменте. Например, при экспрессии в трансгенном табаке обогащенный Met фазеолин обнаруживается только в ЭР (эндоплазматическом ретикулуме), цистернах Гольджи и везикулах Гольджи. В норме фазеолин накапливается в матриксе запасающих белок вакуолей растущих семян табака. Эти данные означают, что обогащенный Met фазеолин подвергается деградации в везикулах Гольджи или сразу после попадания в запасающие белок вакуоли (Hoffinan L.M. et al. Plant Mol. Biol, 11: 717-730, 1988). Сообщалось о высоком уровне аккумуляции запасного белка семян Vicia faba вицилина, содержащего дополнительную последовательность KDEL на С-конце, в табаке и люцерне (Wandelt C.I. et al.. Plant J., 2: 181-192, 1992). При применении конструкций с модифицированными генами, слитыми с промотором 35S вируса мозаичности цветной капусты, белок накапливается в ЭР листьев трансгенных растений. Соответственно представляется вероятным, что при образовании генетически модифицированных запасных белков удержание в ЭР предотвращает их деградацию и что ДНК-конструкции с промотором 35S вируса мозаичности цветной капусты можно применить в настоящем изобретении.

Круциферин - гексамер из 6 субъединиц, каждая из которых состоит из одной цепи, кодируемой одним геном (Rodin J. & Rask L., Physiol. Plant. 79: 421-426, 1990). Например, у Brassica napus гены круциферина гомологичны примерно на 60%. Напин - второй по значению белок семян у Brassica napus. Как и субъединицы круциферина, являющиеся продуктами отдельных генов, напин состоит из двух разных полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Круциферин и напин синтезируются на мембране ЭР в виде предшественников, содержащих адресный сигнал ЭР (Ericson M.L. et al., J. Biol. Chem., 261: 14576-14581, 1986).

Как указано выше, круциферин и напин содержат адресный сигнал ЭР на N-концах. Белки поступают в ЭР в развернутом виде и сигнальная последовательность отщепляется вскоре после попадания в ЭР. В последние годы стало ясно, что не все белки, попадающие в ЭР, подвергаются дальнейшему процессингу и поступают в вакуоли. В просвете ЭР постоянно имеется большое число белков, способствующих созреванию секреторных белков на начальных стадиях. Многие из этих белков также описаны у млекопитающих (Pelham H.R.B., TIBS 15: 483-486, 1990), значит, гликозилирование генных продуктов, особенно белков протекает сходным образом у млекопитающих и у растений. Например, было показано, что у растений ауксин-связывающий белок остается в ЭР (Inohara N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3564-3568, 1989).

Обычно при прорастании первыми появляются протеиназы из группы SH-зависимых протеиназ, которые действуют на нерастворимые нативные запасные белки. У Vigna mungo синтез SH-зависимой протеиназы в семядолях начинается сразу после вымачивания и усиливается до 4-го дня, после чего снижается (Okamoto Т. & Minamikawa Т., Plant Physiol., 152 (6). 675-682, 1998). Короткие пептиды, образующиеся в результате эндопептидазной активности, отщепляются от нативных белков, что в свою очередь повышает их подверженность действию других протеиназ.

Протеиназы второй группы неактивны в отношении нативных запасных белков, но гидролизируют короткие пептиды до олигопептидов. В то же самое время активируются карбоксипептидазы и из пептидов отщепляются аминокислоты. Этот протеолиз происходит в белковых включениях, из которых олигопептиды и аминокислоты выходят в цитозоль, где олигопептиды подвергаются дальнейшей деградации до аминокислот под действием амино-, ди- или трипептидаз. Аминокислоты, высвобождаемые из запасающих органов, подвергаются дальнейшему метаболизму с образованием главных транспортных форм аминокислот - аспарагина и глутамина. Запасные белки являются источником аминокислот для синтезируемых de novo белков во время прорастания.

Вторая стадия способа настоящего изобретения заключается в прорастании семян, при котором сырьевые материалы, накопленные при выращивании в запасных веществах семян двудольных растений, мобилизуются для выработки требуемых генных продуктов. Продолжительность прорастания относительно коротка, а затраты низкие. Объем продукции практически неограничен, так как сырьевые материалы получают из возобновляемых источников, а необходимая энергия поступает от солнца.

В настоящем изобретении прорастание означает этап развития семян двудольных растений, начиная с поглощения воды, усиление дыхания и синтез макромолекул, мобилизация запасных веществ и субклеточные структурные изменения. Прорастание в физиологическом смысле - это короткий этап, который завершается началом удлинения зародышевой оси. В настоящем изобретении прорастание также включает фазу роста после начала удлинения зародышевой оси. Семена обычно поглощают воду в количестве, в два-три раза превышающем их сухой вес, но на более поздней стадии развития ростков требуется большее количество воды. Прорастание включает множество явлений, таких как усиление дыхания, синтез макромолекул и субклеточные структурные изменения. Прорастание в общем завершается удлинением корешка, которое происходит путем увеличения размера клеток без деления. Выделяют 2 типа ростков, отличающихся судьбой семядолей после прорастания. В подземном типе прорастания семядоли не выходят из-под земли при появлении ростков. Гипокотиль остается коротким, а эпикотиль удлиняется и выпускает первые настоящие листья из-под земли. В надземном типе прорастания семядоли выносятся на поверхность растущим гипокотилем. Семядоли обычно становятся фотосинтетически активными до появления настоящих листьев.

При прорастании семян в природе или в поле запасные вещества семядолей обычно используются для запуска физиологической активности после стадии покоя в виде сухих семян. Жизненные функции быстро усиливаются, включая экспрессию генов. Из запасных веществ семядолей высвобождаются значительные количества аминокислот и других биологических соединений при прорастании, которые затем идут на рост.

Стерилизованные с поверхности семена также способны к прорастанию при инкубации в воде или водном растворе, содержащем соединения, способствующие выработке требуемого генного продукта. Во время прорастания активируется экспрессия генов для получения нужного генного продукта. Для проращивания семена сначала вымачивают до содержания влаги в 40-50%, выдерживая их в чанах с водой, в которых поддерживают температуру согласно типу семян и организуют аэрацию сжатым воздухом. После вымачивания семена для проращивания обычно переносят в камеры с влажностью 100%. В типичных случаях поддерживается температура 10-30°С при продолжительности инкубации от 2 до 10 дней, предпочтительно от 3 до 6 дней, и наиболее предпочтительно от 4 до 5 дней.

В настоящем изобретении прорастающие семена двудольных растений содержат трансгенные семядоли, то есть семядоли двудольных растений, стабильно трансформированные последовательностью ДНК, кодирующей требуемый генный продукт. Семядоли являются составной частью зародыша и служат запасающим органом. Семядоли имеют относительно простую физиологическую структуру и набор клеточных типов. После прорастания начинается мобилизация большей части запасных веществ семядолей. Три основных вида запасных веществ в семядолях - белки, жиры и углеводы - подвергаются ферментативным превращениям в подвижные формы во время роста ростков. Запасные белки расщепляются постепенно целым рядом протеиназ, экспрессируемых в клетках семядолей. Протеиназы синтезируются de novo структурными генами, которые регулируются промоторными участками, функционирующими в семядолях.

При прорастании и последующем росте ростков мобилизация запасных липидов начинается с ли