Ген десатуразы кислоты жирного ряда из растений

Ген десатуразы кислоты жирного ряда из растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к способу получения ненасыщенных и насыщенных кислот жирного ряда, а также к способу получения триглицеридов с высоким содержанием ненасыщенных или насыщенных кислот жирного ряда.

Изобретение относится также к последовательности нуклеиновых кислот, к конструкту нуклеиновых кислот, к вектору и организмам, содержащим по меньшей мере одну последовательность нуклеиновых кислот, соответственно конструкт нуклеиновых кислот. Кроме того, изобретение относится к насыщенным или ненасыщенным кислотам жирного ряда, а также к триглицеридам с повышенным содержанием ненасыщенных или насыщенных кислот жирного ряда и к их применению.

Кислоты жирного ряда и триглицериды имеют множество возможностей применения в промышленности пищевых продуктов, в промышленности кормов, косметической и в фармацевтической промышленности. В зависимости от того, идет ли речь о свободных насыщенных или ненасыщенных кислотах жирного ряда или о триглицеридах с повышенным содержанием насыщенных или ненасыщенных кислот жирного ряда, они пригодны для различных целей применения. Так, например, полиненасыщенные кислоты жирного ряда добавляются к питанию грудных детей для повышения пищевой ценности. Главным образом различные кислоты жирного ряда и триглицериды получают из микроорганизмов, таких как Mortierella, или из производящих масло растений, таких как соя, рапс, подсолнечник и т.п., при этом они, как правило, получаются в форме триацилглицеридов. Их также получают из животных, например, из рыбы. Свободные жирные кислоты получают предпочтительно омылением.

В зависимоти от цели применения предпочитают масла с насыщенными или ненасыщенными кислотами жирного ряда. Так, например, в питании человека липиды с ненасыщенными жирными кислотами предпочитаются специальным полиненасыщенным жирным кислотам, так как они оказывают положительное влияние на уровень холестерина в крови и вместе с этим на возможность сердечного инфаркта. Они находят применение в различных диетических средствах питания или в медикаментах.

Особенно ценными и имеющими широкое применение ненасыщенными жирными кислотами являются так называемые сопряженные ненасыщенные жирные кислоты, такие как сопряженная линолевая кислота. Для сопряженных кислот жирного ряда можно привести целый ряд положительных эффектов, так например дача сопряженной линолевой кислоты снижает содержание жира в организме человека и животного, соответственно, повышает обмен веществ в теле животных (см. WO 94/16690, WO 96/06605, WO 97/46230, WO 97/46118). Дачей сопряженной линолевой кислоты можно положительно влиять на аллергические заболевания (WO 97/32008) или раковые заболевания (см. публикацию Banni и др., Carcinogenesis, Vol.20, 1999: стр.1019-1024, Thompson и др., Cancer, Res., Vol.57, 1997: стр.5067-5072).

Химическое получение сопряженных кислот жирного ряда, например, календульной кислоты или сопряженной линолевой кислоты описано в US 3356699 и US 4164505. Календульная кислота упомянута в Calendula officinalis (см. Ul'chenko и др., Chemistry of Natural Compounds, 34, 1998, стр.272-274). Сопряженная линолевая кислота имеется, например, в говяжьем мясе (см. публикацию Chin и др., Journal of Food Composition and Analysis, 5, 1992, стр.185-197). Биохимические исследования синтеза календульной кислоты можно найти в публикации Crombie и др., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 15, 1984, стр.953-955 и J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1985, стр.2425-2434.

В прошлом было предпринято много попыток сделать доступными гены вследствие их положительных свойств, которые участвуют в синтезе кислот жирного ряда, соответственно, триглицеридов, для получения масел в различных организмах с измененным содержанием ненасыщенных жирных кислот. Так например, в заявке WO 91/13972 и в ее американском эквиваленте описана Δ-9-десатураза. В заявке WO 93/11245 предлагается Δ-15-десатураза, в WO 94/11516 предлагается Δ-12-десатураза. Δ-6-десатуразы описаны в WO 93/06712 и в WO 96/21022. Другие десатуразы описаны, например, в ЕР-А-0550162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0794250, публикации Stukey и др., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada и др., Nature 347, 1990: 200-203 или же в Huang и др., Lipids 34, 1999: 649-659. Биохимическая характеристика различных десатураз до сих пор проводилась неудовлетворительно, так как ферменты в качестве мембраносвязанных протеинов трудно выделять и характеризовать (см. публикации McKeon и др., Methods в Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang и др., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). В дрожжах было установлено как смещение спектра кислот жирного ряда к ненасыщенным жирным кислотам, так и повышение продуктивности (см. Huang и др., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier и др., Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). Экспрессия различных десатураз в трансгенных растениях, однако, не показала желательного успеха. Было установлено смещение спектра жирных кислот к ненасыщенным жирным кислотам, однако одновременно было установлено, что производительность синтеза трансгенных растений сильно снижается, т.е. по отношению к исходному растению можно было получить только малые количества масел.

Поэтому до сих пор имеется большая потребность в новых генах, которые кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе ненасыщенных кислот жирного ряда и позволяют синтезировать эти и специально сопряженные ненасыщенные кислоты жирного ряда и получать их в техническом масштабе.

Задачей изобретения поэтому является разработка новых десатураз для синтеза ненасыщенных сопряженных кислот жирного ряда.

Эта задача решается выделенной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с десатуразной активностью, выбранной из группы, включающей:

a) последовательность нуклеиновой кислоты с представленной в SEQ ID NO: 1 последовательностью,

b) последовательность нуклеиновой кислоты, получаемая из SEQ ID NO: 1 за счет вырожденности генетического кода,

c) производная представленной в SEQ ID NO: 1 нуклеотидной последовательности, кодирующая полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или с последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 75% гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 2 по всей ее длине, без существенного снижения ферментативного действия полипептида.

Под производным (производными) следует понимать, например, функциональные гомологи кодированного последовательностью SEQ ID NO: 1 фермента или его ферментативной активности, т.е. ферментов, которые катализируют те же ферментативные реакции, что и кодированный последовательностью SEQ ID NO: 1 фермент. Эти гены позволяют получение ненасыщенных сопряженных кислот жирного ряда. Под ненасыщенными кислотами жирного ряда следует понимать ниже моно, или полиненасыщенные кислоты жирного ряда, двойные связи которых могут быть сопряженными или не сопряженными. Приведенная в SEQ ID NO: 1 последовательность кодирует новую, неизвестную десатуразу, которая участвует в синтезе календульной кислоты в Calendula officinalis. Фермент превращает (9Z,12Z)октадекадиен/линолевую кислоту в (8Е,10Е,12Z)октадекаконьютриен/календульную кислоту. Ниже ее обозначают дезатуразой календульной кислоты.

Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению или ее фрагменты могут с успехом применяться для выделения других геномных последовательностей посредством гомогологического скриннинга.

Названные выше производные могут выделяться, например, из других эукариотических организмов, таких как растения, например, из Calendula stellata, Osteospermum spinescens или Osteospermum hyoseroides, водорослей, таких простейших, как Dinoflagellaten или грибов.

Далее под производными, соответственно, функциональными производными приведенной в SEQ ID No.1 последовательности следует понимать, например, аллельные варианты, которые имеют по меньшей мере 75%-ую гомологию на выведенном аминокислотном уровне, предпочтительно по меньшей мере 80% гомологию, особенно предпочтительно по меньшей мере 85% гомологию, и в частности 90% гомологию. Гомология рассчитывается по общему аминокислотному диапазону. Для расчета применяют программу PileUp (см. J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins и др., CABIOS, 5 1989: 151-153). Выведенная из указанной нуклеиновой кислоты аминокислотная последовательность представлена в последовательности SEQ ID No.2. Аллельные варианты охватывают, в частности, функциональные варианты, которые получают делецией, инсерцией или замещением нуклеотидов из представленной в SEQ ID No.1 последовательности, причем ферментативная активность выведенных синтезированных протеинов сохраняется.

Подобные последовательности ДНК могут быть изолированы из приведенной в SEQ ID NO: 1 последовательности ДНК или участков этой последовательности, например, обычными способами гибридизации или техникой PCR (полимеразной цепной реакции) из других, приведенных выше эукариотов. Эти последовательности ДНК гибридизуются при стандартных условиях с названными последовательностями. Для гибридизации применяют предпочтительно короткие участки олигонуклеотидов, например, консервативные участки, которые определяются посредством сравнения с другими генами, кодирующими десатуразу известным специалисту в данной области методом. Для гибридизации могут также применяться более длинные фрагменты нуклеиновых кислот по изобретению или целые последовательности. В зависимости от примененной нуклеиновой кислоты: олигонуклеотид, длинный фрагмен или полная последовательность или в зависимости от того, какой вид нуклеиновой кислоты ДНК или РНК применяется для гибридизации, эти стандартные условия варьируются. Так, например, температура плавления гибридов ДНК: ДНК на прибл. 10°С ниже, чем температура гибридов ДНК: РНК одинаковой длины.

Под стандартными условиями следует понимать в зависимости от нуклеиновой кислоты температуру между 42°С и 58°С в водном буферном растворе с концентрацией между 0,1 до 5×SSC (1×SSC=0,15 М NaCl, 15 мМ цитрата натрия, рН 7,2) или дополнительно в присутствии 50% формамида, например, 42°С в 5×SSC, 50% формамида. Предпочтительно условия гибридизации для гибрида ДНК: ДНК составляют 0,1×SSC с температурой между 20°С до 45°С, предпочтительно между прибл. 30°С до 45°С. Для гибрида ДНК: РНК условия гибридизации составляют 0,1×SSC и с температурой между прибл. 30°С до 55°С, предпочтительно между 45°С до 55°С. Приведенные температурные диапазоны гибридизации являются рассчитанными значениями температуры плавления для нуклеиновой кислоты с длиной в прибл. 100 нуклеотидов и содержанием G+С в 50% в отсутствии формамида. Экспериментальные условия гибридизации ДНК описаны в учебниках по генетике, например, в Sambrook и др., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, и могут рассчитываться по известным специалисту в данной области формулам, например в зависимости от длины нуклеиновых ксилот, вида гибридов или содержания G+С. Дальнейшую информацию по гибридизации специалист может найти в следующих учебниках: Ausubel и др. (eds), 1985, Current Protocols в публикации Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Далее под производными следует понимать гомологи последовательности SEQ ID No.1, например, эукариотные гомологи, сокращенные последовательности, однонитевую ДНК кодирующей или некодирующей ДНК-последовательности или РНК кодирующей или некодирующей ДНК-последовательности.

Кроме того, под гомологами последовательности SEQ ID No.1 следует понимать производные, например такие, как варианты промоторов. Эти варианты могут быть изменены одним или несколькими обменами нуклеотидов посредством инсерции (инсерций) и/или делеции (делеций), без отрицательного воздействия на функциональность, соответственно, эффективность промоторов. Эффективность промоторов может быть повышена изменением их последовательностей или же они могут быть полностью заменены на более эффективные промоторы, также и на чужие по виду организмы.

Под производными также следует понимать предпочтительные варианты, нуклеотидная последовательность которых в диапазоне от -1 до -2000 перед стартовым кодоном изменена таким образом, что изменяется, соответственно, повышается экспрессия генов и/или экспрессия протеинов. Далее под производными следует понимать варианты, которые были изменены на 3'-конце.

Для оптимальной экспрессии гетерологических генов в организме имеет преимущество изменение последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с применяемым в организме специфичным применением кодона. Применение кодона можно легко определять с помощью компьютерной обработки других, известных генов соответствующего организма.

Предпочтительно ген, кодирующий десатуразу календульной кислоты, можно согласно изобретению комбинировать с другими генами биосинтеза кислот жирного ряда.

Под аминокислотными последовательностями по изобретению следует понимать протеины, которые содержат представленную в SEQ ID NO: 2 аминокислотную последовательность или получаемую из нее замещением, инверсией, инсерцией или делецией одного или нескольких сложных эфиров аминокислоты последовательность, при этом сохраняется ферментативная активность представленного в SEQ ID NO: 2 протеина, соответственно незначительно снижается. Под незначительно сниженными в их активности понимаются все ферменты, которые имеют еще по меньшей мере 10%, предпочтительно 20%, особенно предпочтительно 30% ферментативной активности исходного фермента. При этом, например, определенные аминокислоты можно заменить на кислоты с одинаковыми физикохимическими свойствами (объемное наполнение, основность, гидрофобность и т.д.). Например, остатки аргинина заменяются остатками лизина, остатки валина заменяются на остатки изолейцина или остатки аспарагиновой кислоты заменяются остатками глютаминовой кислоты. Одна или несколько аминокислот в их последовательности могут заменяться, добавляться или удаляться, или же несколько таких приемов могут комбинироваться друг с другом.

Под конструктом или фрагментом нуклеиновых кислот по изобретению понимают приведенную в SEQ ID NO: 1 последовательность, являющуюся результатом генетического кода и/или их функциональных или нефункциональных производных, которые функционально связаны с одним или несколькими регуляторными сигналами для повышения экспрессии гена. Например, при таких регуляторных последовательностях речь идет о последовательностях, к которым присоединяются индукторы или репрессоры и таким образом регулируют экспрессию нуклеиновых кислот. Дополнительно к этим новым регуляторным последовательностям или вместо этих последовательностей может еще иметься естественная регуляция этих последовательностей перед собственными структурными генами и, в случае необходимости, она может быть генетически изменена, так что естественная регуляция отключается и экспрессия генов повышается. Генный конструкт может также быть построен более просто, т.е. дополнителеные регуляторные сигналы не инсерированы перед последовательностью или ее производными и естественный промотор с его регуляцией не удален. Вместо этого естественная последовательность мутирована таким образом, что регуляция больше не происходит и экспрессия генов повышается. Эти измененные промоторы могут одни размещаться перед естественным геном для повышения активности. Генный конструкт может, кроме этого, также содержать один или несколько так называемых энхансерных последовательностей, связанных с промотором, которые обеспечивают повышенную экспрессию последовательности нуклеиновых кислот. Также и на 3'-конце ДНК-последовательностей могут быть инсерированы дополнительные последовательности, такие, как другие регуляторные элементы или терминаторы. Ген, кодирующий десатуразу календульной кислоты, может содержаться в генном конструкте в одной или нескольких копиях.

Регуляторные последовательности для способа по изобретению содержатся, например, в таких промоторах, как cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-P_R- или в l-Р_L-промоторе, которые находят применение в грамотрицательных бактериях. Другие предпочтительные регуляторные последовательности содержатся, например, в грамположительных промоторах amy и SPO2, грибковых или дрожжевых промоторах ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH или в растительных промоторах, таких как CaMV/35S [Franck и др., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward и др., Plant.Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos или в Ubiquitin-промоторе. Другими предпочтительными растительными промоторами являются, например, индуцируемый бензенсульфонамидом промотор (см. ЕР 388186), индуцируемый тетрациклином промотор (см. Gatz и др., (1992) Plant J. 2,397-404), индуцируемый абсцизиновой кислотой промотор (см. ЕР335528), соответственно индуцируемый этанолом или циклогексаноном промотор (см. WO 9321334). Другими растительными промоторами являются, например, промотор цитозольной FBPазы из картофеля, промотор ST-LSI из картофеля (см. Stockhaus и др., ЕМВО J. 8 (1989) 2445-245), промотор фосфорибозилпирофосфат амидотрансферазы из Glycine max (см. также Genbank Accession Nummer U87999) или нодий-специфичный промотор, описанный в ЕР 249676. Предпочтительными являются такие растительные промоторы, которые обеспечивают экспрессию в ткани и частях растений, в которых имеет место биосинтез жиров, соответственно, его предварительная стадия. В частности, к ним причисляются промоторы, которые обеспечивают специфичную семенам экспрессию, как например, usp-промотор, der LEB4-промотор, фазеолин-промотор или напин-промотор.

В принципе, для способа по изобретению могут применяться все естественные промоторы с их регуляторными последовательностями, как приведено выше. Сверх этого могут применяться синтетические промоторы.

Во фрагменте нуклеиновой кислоты (генном конструкте, конструкте нуклеиновой кислоты) могут содержаться еще и другие гены, которые должны встраиваться в организм. Эти гены могут находиться под разделенной регуляцией или же под таким же регуляционным регионом, что и ген, кодирующий десатуразу по изобретению. При этих генах речь идет, например, еще о других генах биосинтеза кислот жирного ряда и липидов, которые обеспечивают повышенный синтез. Например, следует назвать гены Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ6-, Δ5-десатуразы, различных гидроксилаз, ацетиленазы, ацил-АСР-тиоэстеразы, β-кетоацил-АСР-синтазы, ацилтрансферазы, такой как диацилглицероацилтрансфераза, глицерол-3-фосфатацилтрансфераза или лизофосфатитацилтрансфераза или β-кетоацил-АСР-редуктаза. Преимущественно применяют гены десатуразы в конструкте нуклеиновых кислот, предпочтительно, гены Δ12-десатуразы.

Для экспрессии фрагмент нуклеиновых кислот инсерируется в организме-хозяине, например, в микроорганизме, в таком как гриб или растение, предпочтительно в вектор, например, плазмиду, фаг или прочую ДНК, который позволяет оптимальную экспрессию генов в хозяине. Подходящие плазмиды имеются, например, в Е.coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, рКС30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-III¹¹³-B1, λgt11 или pBdCl, в стрептомицетах рlJ101, plJ364, plJ702 или plJ361, Bacillus pUB110, pC194 или pBD214, в коринебактериях pSA77 или pAJ667, в грибах pALS1, plL2 или рВВ116, в дрожжах 2μМ, pAG-1, YEp6, YEp13 или pEMBLYe23 или в растениях pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH или pDH51 или в производных вышеприведенных плазмид. Вышеприведенные плазмиды представляют собой лишь малый выбор возможных плазмид. Другие плазмиды известны специалисту в данной области и приведены в книге Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. и др. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018). Пригодные растительные векторы описаны среди прочего в "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), раздел 6/7, стр.71-119.

Под векторами кроме плазмид следует понимать также и все другие, известные специалисту векторы, как например, фаги, вирусы, такие как SV40, CMV, бакуловирус, аденовирус, транспозоны, IS-элементы, фазмиды, фагмиды, космиды, линейные или кольцевые ДНК. Эти векторы могут быть реплицированы автономно в организме-хозяине или же хромосомально. Предпочтительна хромосомальная репликация.

Вектор содержит по меньшей мере одну копию последовательности нуклеиновых кислот по изобретению и/или фрагмента нуклеиновой кислоты.

Для повышения числа генных копий последовательности нуклеиновой кислоты или гомологовые гены могут быть вставлены, например, в один фрагмент нуклеиновой кислоты, соответственно, вектор, который содержит предпочтительно приданные соответствующим генам, регуляторные последовательности генов или аналогично действующую промоторную активность. В частности, применяются такие регуляторные последовательности, которые усиливают экспрессию гена.

Фрагмент нуклеиновой кислоты для экспрессии других генов содержит дополнительно еще 3'- и/или 5'-концевые регуляторные последовательности для усиления экспрессии, которые в зависимости от выбранного организма-хозяина и гена или генов выбираются для оптимальной экспресии.

Эти регуляторные последовательности должны обеспечивать направленную экспрессию генов и протеинов. Это в зависимости от организма-хозяина может означать то, что ген экспримируется и/или сверхэкспримируется после индукции или же сразу.

Регуляторные последовательности, соответственно, факторы могут при этом положительно влиять на экспрессию введенных генов и вследствие этого повышать ее. Так, например, усиление регуляторных элементов может происходить на уровне транскрипции, при этом применяются сильные сигналы транскрипции, такие как промоторы и/или энхансеры. Наряду с этим возможно также усиление трансляции, например, улучшение стабильности матричной РНК.

При еще одной форме выполнения вектора генный конструкт по изобретению может вводиться в организм в форме линейной ДНК и интегрироваться через гетерологическую или гомологическую рекомбинацию в геном организма-хозяина. Эта линейная ДНК может состоять из линеаризованного плазмида или только из фрагмента нуклеиновой кислоты в качестве вектора или последовательности нуклеиновых кислот по изобретению.

Предпочтительным образом последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению вместе с по меньшей мере одним геном-репортером клонируется в конструкт нуклеиновой кислоты, который встраивается в геном. Этот ген-репортер должен обеспечивать возможность легкого детектирования с помощью анализа роста, флуоресценции, хемо- или биолюминесценции или стойкости или же фотометрического измерения. Пригодными в качестве генов-репортеров являются, например, гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, гены гидролазы, гены флуоресцентных протеинов, гены биолюминесценции, гены сахарного или нуклеотидного обмена веществ или гены биосинтеза, такие как Ura3-ген, llv2-ген, ген люциферазы, ген β-галактосидазы, gfp-ген, ген 2-дезоксиглюкоза-6-фосфат-фосфатазы, ген β-глюкуронидазы, ген β-лактамазы, ген неомицинфосфотрансферазы, ген гидромицинфосфотрансферазы или ген стойкости к BASTA (глюфосинату). Эти гены позволяют легкую измеряемость и количественное определение транскрипционной активности и вместе с этим экспрессии генов. Этим могут определяться места геномов, которые проявляют различную продуктивность.

При другой форме выполнения изобретения последовательность нуклеиновых кислот по изобретению также и одна может быть введена в организм.

Если наряду с последовательностью нуклеиновых кислот по изобретению в организм должны вводиться другие гены, то они могут все вместе вводиться геном-репортером в единственном векторе или каждый отдельный ген может вводиться геном-репортером в соответствующем одном векторе, причем различные векторы могут вводиться одновременно или последовательно.

Организм-хозяин получает по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты по изобретению и/или конструкта нуклеиновой кислоты по изобретению.

Введение нуклеиновой кислоты, конструкта нуклеиновой кислоты или вектора по изобретению в организм, например, растения, может в принципе осуществляться всеми известными специалисту в данной области методами.

Для микроорганизмов специалист может найти соответствующий метод в учебниках Sambrook, J. и др. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, F.M.Ausubel и др. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, D.M.Glover и др., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kaiser и др. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press или Guthrie и др. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press.

Перенос чужих генов в геном растения называется трансформацией. При этом используются описанные методы трансформации и регенерации растений из тканей растений или частей растений для трансиентной или стабильной трансформации. Пригодными методами являются трансформация протопластов посредством индуцированного полиэтиленгликолем поглощения ДНК, применение генной-пушки, электропорация, инкубация сухих зародышей в содержащем ДНК растворе, микроинъекция и опосредованный Agrobacterium перенос генов. Приведенные способы описаны, например, в публикациях В. Jenes и др., Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, выпущенном S.D.Kung и R.Wu, Academic Press (1993) 128-143, a также в публикации Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225). Предпочтительно подлежащий экспрессии конструкт клонируется в вектор, который пригоден для трансформации Agrobacterium tumefaciens, например, pBin19 (см. Bevan и др., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Трансформация растений с помощью Agrobacterium tumefaciens описана, например, в публикации Höfgen und Willmitzer Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877.

Трансформированные вектором экспрессии по изобретению агробактерии могут также известным образом применяться для трансформации растений, например, испытательных растений, таких как Arabidopsis или культурных растений, в частности, содержащих масло культурных растений, таких как соя, земляной орех, подсолнечник, клещевина, кукуруза, хлопчатник, лен, рапс, кокосовый орех, масличная пальма, Carthamus tinctorius или бобы какао, например, таким образом, что в поврежденные листья или куски листьев погружают в раствор агробактерии и после этого культивируют в подходящей среде.

Генетически измененные клетки растений можно регенерировать посредством всех известных специалисту методов. Соответствующие методы можно найти в вышеприведенных публикациях S.D.Kung и R.Wu, Potrykus или Höfgen и Willmitzer.

В качестве организмов, соответственно, организмов-хозяев для нуклеиновой кислоты по изобретению, конструкта нуклеиновой кислоты или вектора пригодны в принципе все организмы, которые в состоянии синтезировать кислоты жирного ряда, а именно ненасыщенные кислоты, соответственно, которые пригодны для экспрессии рекомбинантных генов. В качестве примеров следует привести такие растения, как Arabidopsis, Asteraceae, такие, как календула или культурные растения, такие, как соя, земляной орех, подсолнечник, клещевина, кукуруза, хлопчатник, лен, рапс, кокосовый орех, масличная пальма, или бобы какао, такие микроорганизмы, как грибы, например, вида Mortierella, Saprolegnia или Pythium, такие бактерии, как вида Escherichia, дрожжи, такие, как вида Saccharomyces, водоросли или простейшие, такие, как динофлагелаты, такие, как Crypthecodinium. Предпочтительными являются организмы, которые могут синтезировать большое количество масел естественным путем, такие, как грибы, например Mortierella alpina, Pythium insidiosum или такие растения, как соя, рапс, лен, кокосовый орех, масличная пальма, Carthamus tinctorius, клещевина, календула, земляной орех, бобы какао или подсолнечник или дрожжи, такие, как Saccharomyces cerevisiae, особенно предпочтительны соя, рапс, лен, подсолнечник, календула или Saccharomyces cerevisiae. В принципе в качестве организмов-хозяев могут быть также и трансгенные животные, например, Caenorhabditis elegans.

Другим объектом изобретения являются трансгенные растения, которые содержат функциональную или нефункциональную нуклеиновую кислоту или функциональный или нефункциональный конструкт нуклеиновой кислоты. Под понятием "нефункциональные" следует понимать то, что ферментативно активный протеин больше не синтезируется, так как естественный ген инактивирован. Кроме того, под нефункциональными нуклеиновыми кислотами или фрагментами нуклеиновых кислот следут понимать также и так называемую антисмысловую ДНК, которая приводит к трансгенным растениям, которые имеют сниженную ферментативную активность или не имеют ферментативной активности. С помощью антисмысловой техники, особенно если последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению комбинируется с другими генами синтеза кислот жирного ряда в антисмысловой ДНК, можно синтезировать триглицериды с повышенным содержанием насыщенных, соответственно, ненасыщенных кислот жирного ряда. Под трансгенными растениями следует понимать отдельные клетки растений или их культуры в твердой среде или в жидкой культуре, части растений и целые растения.

Применение последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению или конструктов нуклеиновой кислоты по изобретению для получения трансгенных растений является также объектом изобретения.

Другим объектом изобретения является фермент, который превращает кислоту жирного ряда общей формулы I,

имеющую две отделенные друг от друга метиленовой группой двойные связи, в трижды ненасыщенную кислоту жирного ряда общей формулы II

причем три двойных связи кислоты жирного ряда находятся в сопряжении и заместители в соединениях общей формулы I и II имеют следующее значение:

R¹ означает водород, замещенный или незамещенный, ненасыщенный или насыщенный, разветвленный или неразветвленный С₁-С₁₀-алкил-,

R² означает замещенный или незамещенный, насыщенный или ненасыщенный C₁-С₉алкил-.

R³ и R⁴ означают независимо друг от друга водород, замещенный или незамещенный, насыщенный или ненасыщенный, разветвленный или неразветвленный C₁-C₂₂алкилкарбонил - или фосфо-, и

n равно 1 до 14, предпочтительно от 1 до 8, особенно предпочтительно от 4 до 6, очень предпочтително 6.

R¹ означает в соединениях формул I и II водород, замещенный или незамещенный, ненасыщенный или насыщенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀-алкил-, или группу

В качестве алкильных остатков приводятся замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀-алкильные цепи, например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил-2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-октил, н-нонил или н-децил.

Предпочтительными остатками R¹ являются водород и группировка

R² означает в соединениях формул I и II замещенный или незамещенный, ненасыщенный или насыщенный С₁-С₉-алкил-.

В качестве алкильных остатков следует привести замещенные или незамещенные, или ненасыщенные или насыщенные С₁-С₉-алкильные цепи, например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил- 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-октил или н-нонил. Предпочтителен С₁-С₅-алкил. Особенно предпочтителен С₅-алкил.

R³ и R⁴ означают независимо друг от друга водород, замещенный или незамещенный, насыщенный или ненасыщенный, разветвленный или неразветвленный С₁-С₂₂-алкилкарбонил- или фосфо-.

С₁-С₂₂-алкилкарбонилом являются, например, метилкарбонил, этилкарбонил, н-пропилкарбонил, 1-метилэтилкарбонил, н-бутилкарбонил, 1-метилпропилкарбонил, 2-метилпропилкарбонил, 1,1-диметилэтилкарбонил, н-пентилкарбонил, 1-метилбутилкарбонил, 2-метилбутилкарбонил, 3-метилбутилкарбонил, 1,1-диметилпропилкарбонил, 1,2-диметилпропилкарбонил, 2,2-диметилпропилкарбонил, 1-этилпропилкарбонил, н-гексилкарбонил, 1-метилпентилкарбонил, 2-метилпентилкарбонил, 3-метилпентилкарбонил, 4-метилпентилкарбонил, 1,1-диметилбутилкарбонил, 1,2-диметилбутилкарбонил, 1,3-диметилбутилкарбонил, 2,2-диметилбутилкарбонил, 2,3-диметилбутилкарбонил, 3,3-диметилбутилкарбонил, 1-этилбутилкарбонил, 2-этилбутилкарбонил, 1,1,2-триметилпропилкарбонил, 1,2,2-триметилпропилкарбонил, 1-этил 1-метилпропилкарбонил и 1-этил-2-метилпропилкарбонил, гептилкарбонил, нонилкарбонил, децилкарбонил, ундецилкарбонил, н-додецилкарбонил, н-тридецилкарбонил, н-тетрадецилкарбонил, н-пентадецилкарбонил, н-гексадецилкарбонил, н-гептадецилкарбонил, н-октадецилкарбонил, н-нонадецилкарбонил или н-эйкозилкарбонил.

Предпочтительными заместителями для R³ и R⁴ является насыщенный или ненасыщенный С₁₆-С₂₂-алкилкарбонил.

В качестве заместителей приведенных остатков следует привести, например, галоген, такой как фтор или хлор, а также алкил или гидроксил.

При взаимодействии с ферментом по изобретению в кислоту жирного ряда вводится одна двойная связь и одна двойная связь смещается, так что участвующие в реакции три двойных связи находятся в сопряжении. Далее одна двойная связь изомеризуется (из цис в транс).

Фермент (а именно десатураза календульной кислоты) катализирует превращение линолевой кислоты (18:2, 9Z,12Z) в календульную кислоту (18:3, 8E,10E,12Z). Фермент вводит транс-двойную связь в положение С8 и приводит к специфичному смещению цис-двойной связи в положение С9 к транс-двойной связи в положении С 10, причем изомеризация происходит специфично для данного участка. Возможный гипотетический механизм реакции представлен на фиг.1. После депротонирования в С8 линолевой кислоты и перегруппировки радикала по С10 в ходе отщепления воды происходит депротонирование в С11 и вместе с этим образование календульной кислоты. Одновременно связанный Fe IV снижается до Fe III. На Фиг.1 изображен гипотетический механизм для (8,11)-линолеол-десатуразы (десатуразы календульной кислоты), модифицированный согласно публикации Svatos, А и др. (Insect Biochemistry and Molecular Biology 29,1999:225-232) основанный на предложенном механизме катализа для Δ9-десатуразы из клещевины (см. Lindqvist, Y и др., ЕМВО Journal 15, 1996:4081-4092). В качестве субстрата пригодны также 6Z,9Z,12Z, 18:3-жирная кислота и 9Z,12Z,15Z, 18:3-жирная кислота, которые потом превращаются в 6Z,8E,10E,12Z - соответственно 8Е,10Е,12Z,15Z-жирные кислоты.

Другим объектом изобретения является способ получения ненасыщенных кислот жирного ряда, согласно которому по меньшей мере одну вышеописанную последовательность нуклеиновых кислот по изобретению или по меньшей мере один конструкт нуклеиновой кислоты по изобретению вводят в производящий предпочтительно масло организм, этот организм культивируют, содержащееся в нем масло выделяют и высвобождают содержащиеся в масле кислоты жирного ряда.

Объектом изобретения является также способ получения триглицеридов с повышенным содержанием ненасыщенных кислот жирного ряда, при котором по меньшей мере одну вышеприведенную последовательность нуклеиновых кислот по изобретению или по меньшей мере один конструкт нуклеиновой кислоты по изобретению вводят в производящий масло организм, этот организм культивируют и содержащееся в организме масло выделяют.

Оба способа позволяют синтез кислот жирного ряда или триглицеридов с повышенным содержанием ненасыщенных кислот жирного ряда, таких как календульная кислота.

Другим объектом изобретения является способ получения насыщенных кислот жирного ряда, при котором по меньшей мере одну нефункциональную, вышеприведенную последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению или по меньшей мере один конструкт нуклеиновой кислоты по изобретению вводят в производящий масло организм, этот организм культивируют, содержащееся в организме масло выделяют и содержащиеся в масле кислоты жирного ряда высвобождают, а также способ получения триглицеридов с повышенным содержанием насыщенных кислот жирного ряда, при котором по меньшей мере одну нефункциональную, вышеприведенную последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению или по меньшей мере один нефункциональный конструкт ну