Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты

Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и состоит в совершенствовании технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой рибонуклеиновой кислоты, находящего применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний: тапеторетинальных абиотрофий; нервно-мышечных заболеваний: болезни Шегрена и др.

Известен способ получения рибонуклеотидов [Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 - Jun. 154, 1982] путем гидролиза раствора дрожжевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) панкреатической рибонуклеазой. В этом способе раствор гидролизованной дрожжевой рибонуклеиновой кислоты центрифугируют, разделяют на фракции на колонке с сефадексом G 25 и лиофилизируют. Недостатком данного способа являются невысокий выход продукта и наличие большого количества высокомолекулярной РНК.

Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому эффекту является способ [Fux В.В., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture ofribonu-cleotides. USA Patent Number 5064758 Nov. 12, 1991], который выбран за прототип. Согласно этому способу проводят гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой при температуре 62-65°C в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этанол, отделяют осадок фильтрованием, а фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 45-51%.

Задачей изобретения является увеличение выхода продукта. Поставленная задача решается тем, что гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой проводят при температуре 62-65°С в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этиловый спирт в количестве 15-30% по объему, отделяют осадок фильтрованием, к фильтрату добавляют миндальную кислоту до концентрации 0,10-0,12 мг/л. Миндальная кислота добавляется в качестве ингибитора рибонуклеаз. Способностью ингибировать рибонуклеазы обладает достаточно большой ряд веществ [McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436], но преимуществом миндальной кислоты является то, что она не ухудшает качество готового продукта, так как сама является лекарственным препаратом [Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988]. Применение миндальной кислоты имеет следствием унификацию целевого продукта, что обеспечивается ингибированием посторонней рибонуклеазной активности. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0°-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов, осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 57-63%.

Проведение способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по прототипу)

70 г дрожжевой РНК растворяют в 430 мл дистиллированной воды и доводят рН до 5,1 2н. раствором гидроксида натрия. Добавляют 140 мг панкреатической рибонуклеазы и гидролизуют в течение 5 ч при температуре 65°С. Общий объем гидролизата 465 мл. Гидролизат охлаждают до температуры 25-35°С, добавляют 120 мл этанола, осадок отделяют на фильтре, а фильтрат подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану с диаметром пор 100 Å при давлении 0,4 МПа и температуре 30°С. Получают 360 мл пермеата. К ретанту добавляют дважды по 70 мл воды и дополнительно получают еще 140 мл пермеата. В объединенный пермеат объемом 500 мл добавляют 5 л этилового спирта (10-кратный объем). Суспензию охлаждают до 0-4°С, выдерживают при такой температуре в течение 4 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 0,36 л этилового спирта и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 36 г сухой смеси.

36 г сухой смеси олигопуклеотидов и 6 г хлористого натрия растворяют в 958 г дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор желтого цвета фильтруют через фильтр с величиной пор 2000 Å при давлении 98 кПа. Раствор рибонуклеотидов в стерильных условиях разливают в ампулы из нейтрального стекла по 3 мл и подвергают обработке в автоклаве при 119°С в течение 34 мин. Концентрация нуклеотидов в препарате 3,3%. Проведение всех указанных операций обеспечивает получение нетоксичного, стерильного, апирогенного препарата с выходом 51%.

Удельное поглощение E_см=240 при λ=260 нм и рН 2.

Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:

А 260/230	3,15
А 260/280	1,60

Состав препарата, вес.%:

нуклеозиды	1,5
мононуклеотиды	25,6
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100%	72,9

Пример 2

Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,056 мг миндальной кислоты (концентрация 0,10 мг/л).

Выход продукта составляет 57%.

Удельное поглощение E_см=240 при λ=260 нм и рН 2.

Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:

А 260/230	3,85
А 260/280	1,69

Состав препарата, вес.% :

мононуклеотиды	24,1
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100%	75,9

Пример 3

Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,07 мг миндальной кислоты (концентрация 0,12 мг/л).

Выход препарата составляет 63%.

Удельное поглощение E_см=240 при λ=260 нм и рН 2.

Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:

А 260/230	3,9
А 260/280	1,62

Состав препарата, вес.% :

мононуклеотиды	15,6
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100%	84,4

Разработанный метод предназначен для промышленного применения. Преимущество предлагаемого способа получения панкреатического гидролизата РНК заключается в увеличении выхода продукта в 1,2 раза при сохранении его нетоксичности и апирогенности.

Литература:

1. Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of luecocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 -Jun. 154, 1982.

2. Fux B.B., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture of ribonucleotides. USA Patent Number 5064758 -Nov. 12, 1991.

3. McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436.

4. Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988.

Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты, включающий гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой, добавление этилового спирта, отделение осадка фильтрованием, разделение смеси олигонуклеотидов ультрафильтрацией через мембрану с величиной пор 50-150 Å, осаждение олигонуклеотидов этиловым спиртом, приготовление раствора сухой смеси олигонуклеотидов в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия, фильтрацию и стерилизацию полученного раствора, отличающийся тем, что перед проведением ультрафильтрации к фильтрату добавляют миндальную кислоту до ее конечной концентрации в фильтрате 0,10-0,12 мг/л.