Экстракт "фукус" для лечения воспалительных заболеваний пародонта

Экстракт "фукус" для лечения воспалительных заболеваний пародонта

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии, и может быть использовано для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта. Для лечения воспалительных заболеваний пародонта применяют различные растворы антисептиков и фитопрепараты.

Недостатком применения антисептиков является развитие дисбактериоза после из применения, недостатком же при использовании фитопрепаратов для лечения воспалительных заболеваний пародонта является малая эффективность.

Целью изобретения является устранение данных недостатков и установление стойкой ремиссии. Использовался 1% раствор экстракта «Фукус».

Результаты медико-биологических испытаний продукции из фукоидов.

Объектами исследования являлись препараты из водорослей Ascophyllum nodosum и Fucus vesiculosus.

Цель работы состояла в медико-биологическом изучении биологически активных водорослевых добавок: оценке общетоксического действия, изучении аллергенного и антимикробного действия, эффективности препаратов.

Показано, что исследованные препараты не оказывают общетоксического, иммунотоксического и аллергенного действия, оказывают прямое антимикробное действие в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus и выраженное защитное действие на моделях вторичного иммунодефицита различного генеза. Все исследованные препараты обладают антиоксидантной активностью, снижая количество продуктов перекисного окисления липидов.

Оценка токсических свойств БАД из фукоидов в остром и подостром экспериментах.

Изучение острой токсичности БАД.

Изучение острой токсичности препаратов проводили на самцах двухмесячного возраста белых беспородных мышей массой 18-20 г. Животные находились на стационарном рационе и содержались согласно санитарным правилам. Введение препаратов осуществлялось согласно санитарным правилам. Введение препаратов осуществлялось в утреннее время суток. Острая токсичность исследовалась при 2 путях введения - пероральном и внутрибрюшинном. Перед пероральным введением животных отсаживали на 40 минут в пустую клетку. Препараты изучались в диапозоне 4-5 доз, достаточных для расчета среднесмертельных доз. В каждой группе было по 6 животных. Вычисление LD₅₀ проводилось по Керберу. При исследовании крупок препаратов тестировали надосадочную жидкость, которую готовили следующим образом: размельченное вещество замачивали в воде (100 г/л), настаивали в течение суток при 37°С и затем процеживали (Методические рекомендации МЗ РФ от 20.04.98 г.).

Общая продолжительность наблюдения за экспериментальными животными составляла 14 дней, причем в первый день животные находились под непрерывным наблюдением. Регулярно фиксировали общее состояние мышей, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, реакцию на тактильные, болевые, звуковые раздражители, состояние волосяного покрова, потребление корма и воды и другие показатели, свидетельствующие о токсическом действии препаратов.

В ходе исследования получены среднесмертельные дозы для препаратов (табл.1). Полученные результаты позволяют отнести изученные препараты к малотоксичным.

Изучение подострой токсичности БАД.

Исследование проводили на морских свинках массой 280-300 г, самцах. Животные были распределены по следующим группам: первую группу составляли животные, которым ежедневно в течение месяца вводили перорально с помощью металлического зонда разведенный 1/4 водный концентрат Ascophyllum nodosum в объеме 1,6 мл; вторую группу составляли животные, которым ежедневно в течение месяца вводили разведенный 1/4 водный концентрат Fucus vesiculosus в объеме 1,6 мл; третью группу составляли животные, которым ежедневно в течение месяца вводили экстракт из крупки Ascophyllum nodosum в объеме 1,6 мл; четвертую группу составляли животные, которым ежедневно в течение месяца вводили экстракт из крупки Fucus vesiculosus в объеме 1,6 мл; пятую группу составляли контрольные животные, которым в том же объеме вводили воду.

В ходе эксперимента у животных оценивали общее состояние, поведение, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек, потребление корма и воды. Животных регулярно взвешивали. Функциональное состояние органов и систем оценивали по определению маркетных показателей - активности аминотрансфераз и щелочной фосфотазы, содержанию мочевины, креатинина, показателей периферической крови.

Для определения указанных показателей кровь у морских свинок бралась из полости сердца в объеме 4,0-5,0 мл.

Подсчет форменных элементов крови производили на гематологическом анализаторе АВХ Микрос ОТ (Франция).

Биохимические показатели определяли на биохимическом автомате Техникой «Axon» с использованием следующих методов и наборов:

- мочевина - уреазный, экзиматический, наборы фирмы «Hyman»;

- креатинин - модифицированный метод Яффе без депротеинизации, реактивы фирмы «Техникон»;

- аминотрансферазы - оптимизированный экзиматический, кинетический, реактивы фирмы «Витал Диагностикс», Санкт-Петербург;

- щелочная фосфатаза - кинетический, реактивы фирмы «Biosystems».

После окончания подострого эксперимента проведена эвтаназия животных передозировкой диэтилового эфира для патоморфологического исследования внутренних органов и тканей.

Вскрытие животных проводили сразу же после их гибели по полной патологоанатомической схеме, что исключало возможный аутолиз тканей, что позволяло проводить дополнительные исследования. На каждое животное составляли полный протокол вскрытия с характеристикой патологоанатомических признаков во всех органах и системах организма.

Морфометрическую оценку параметров массы тела и органов животных проводили с помощью электронных весов «Сарториус» (Германия) с последующим вычислением коэффициентов массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологического исследования образцы свежей ткани подвергали криостатированию с получением срезов в 5-7 мкм или фиксированию их в 10% нейтрализованном растворе формалина для получения в последующем парафиновых срезов толщиной в 2-5 мкм. Обезвоживание, обезжиривание и проводку тканей с их уплотнением в парафинах с различной температурой плавления (37-57°С) проводили в микропроцессорном автоклаве «Сакура» (Япония) по заранее составленной программе; заливку тканей - парафин с воском и формирование тканевых блоков - ручным способом. После депарафинирования срезов их окрашивали гематоксинэозином и другими азокрасителями, заключали под покровные стекла и готовили для визуального просмотра постоянные микропрепараты.

Микроскопию проводили на микроскопе «Люмам», Санкт-Петербург.

Полученные в каждом наблюдении комплексные патоморфологические данные от получавших БАД морских свинок сравнивали с данными контрольных животных.

Статистическую обработку всех полученных результатов проводили по Стьюденту с помощью компьютера IBM РС/АТ-486.

Показано, что при введении препаратов в течение 30 дней не выявлено существенных изменений в поведении и внешнем виде животных. Они имели гладкий шерстный покров, охотно поедали корм, сохраняли обычную двигательную активность.

Масса тела морских свинок во всех подопытных группах, получавших исследуемые препараты в течение подострого опыта, не отличалась от контроля (табл.1).

Данные клинического анализа крови (табл.2) показали отсутствие статистически значимых различий между группами животных, получавших БАД, и контрольной.

Уровни содержания мочевины и креатинина в сыворотке крови животных, получавших БАД, не отличались от соответствующих показателей в контроле (табл.3).

Для выявления возможного повреждающего действия БАД на печень исследовали активность аспартат- и аланинаминотрансферазы и щелочной фосфотазы сыворотки крови.

Изменение активности этих ферментов не выходило за пределы физиологической нормы для данного вида лабораторных животных. Активность аминотрансфераз и щелочной фосфотазы у подопытных и контрольных животных существенно не отличалась (табл.4).

Патоморфологическое исследование морских свинок, подвергавшихся воздействию БАД:

1) Макроскопическое исследование

Кожные покровы и видимые слизистые как у контрольных, так и у подопытных животных чистые. Подкожно-жировая клетчатка развита умеренно. Органы грудной и брюшной полостей расположены правильно. Полости свободны от жидкости и спаек.

Печень плотная с гладкой поверхностью, на разрезе красно-коричневого цвета. У отдельных животных имеет место полнокровие сосудов печени.

У большинства животных в респираторном отделе легких не было обнаружено признаков отека и воспалительной реакции.

Легкие воздушные, серо-розового цвета.

Сердце округлой формы, хорошо сокращено. Створки клапанов тонкие, полупрозрачные. Под эпикардом обычный рисунок расположения коронарных сосудов.

Макроскопически не отмечено патологических изменений слизистой желудка и тонкого кишечника.

Почки на разрезе умеренно кровенаполненные с четким делением на слои. Капсула снимается легко, под ней гладкая поверхность.

Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серо-красного цвета, изменений в строении селезенки в сравнении с контролем не выявлено.

Коэффициенты массы внутренних органов представлены в табл.5, из которой видно, что данные показатели у всех подопытных групп не отличались от контрольной группы, что указывает на отсутствие токсического воздействия препаратов на органы лабораторных животных.

2) Микроскопическое исследование.

Контрольная группа.

В печени дольки плотно прилежат друг к другу, окружены триадами сосудов. Гепатоциты овальной формы с четкой структурой расположены радиально вдоль кровенаполненных синусоидных капилляров. Стенки центральных вен тонкие, просвет их содержит небольшие скопления клеток крови.

В корковом слое почек почечные тельца в окружении петель выносящих канальцев нефронов. Капсула клубочков тонкая, капиллярные петли окружены тонким слоем мезангиальных клеток. Строение стенок канальцев соответствует отделам нефрона.

Группы, получавшие препараты из Ascophyllum nodosum.

Гепатоны печени состоят из радиально расположенных балок гепатоцитов вокруг синусоидных капилляров. Отсутствуют нарушения гистоархитектоники печеночной ткани. В клетках печеночной паренхимы отсутствуют признаки белковой, вакуолярной и жировой дистрофии.

В почках в корковом слое клубочки с сохранной структурой капиллярных петель, тонкой капсулой. Стенки канальцев нефрона имеют строение, соответствующее его отделам, просветы их свободные.

Изучение строения и состояния слизистой оболочки желудка и тонкого кишечника показало отсутствие патологических изменений в этих отделах. Слизистая оболочка желудка выстлана однослойным цилиндрическим эпителием, над которым в полости желудка находилось небольшое количество слизи с остатками слущенных клеток, количество которых свидетельствует о нормальной интенсивности десквамативных процессов. Признаки дистрофии или атрофии эпителия отсутствуют. Слизистая тонкого кишечника представлена обычными клеточными структурами - бокаловидными и всасывающими клетками. Ворсинчатый отдел эпителия не изменен.

Фолликулы белой пульпы селезенки обычной величины. Соотношение белой и красной пульпы соответствует норме.

По данным патоморфологического изучения различий между группами, получавшими водный концентрат и крупку, не обнаружено.

Группы, получавшие препараты из Fucus vesiculosus.

В печени гепатоциты правильной овальной формы. Клетки с гомогенной цитоплазмой, четким ядром, центральные вены полнокровные, строма развита слабо.

Строение и состояние слизистой оболочки желудка и тонкого кишечника не отличаются от контрольной группы животных. Отсутствуют признаки дистрофии или атрофии цилиндрического эпителия.

В почках капсулы клубочков тонкостенные, капиллярные петли клубочков имеют тонкие стенки, окружены умеренно развитым слоем мезангиальных клеток. Стенки канальцев выстланы эпителием типичной структуры, просветы канальцев свободны.

По данным патоморфологического изучения различий между группами, получавшими водный концентрат и крупку, не обнаружено.

Таким образом, данные макро- и микроскопических исследований, относительные коэффициенты массы внутренних органов свидетельствуют об отсутствии токсического действия всех тестируемых препаратов на организм лабораторных животных.

Заключение.

Результаты изучения общетоксических свойств препаратов в острых опытах при однократном парентеральном и пероральном введениях не выявили признаков токсического действия на организм лабораторных животных. На основании определения среднесмертельных доз препараты можно отнести к классу малотоксичных соединений. Многократное пероральное введение БАД не сказывалось на общем состоянии, массе тела, поведении животных, а также не оказывало воздействия на функциональную активность органов и систем.

Клинические, биохимические и патоморфологические исследования не выявили токсического воздействия тестируемых препаратов на организм лабораторных животных при многократном пероральном введении.

Изучение аллергенного действия БАД.

Оценку аллергенного действия БАД проводили на самках морских свинок массой 250-300 г в реакции с системной активной анафилаксией. БАД вводили энтерально десятикратно в дозе 1,6 мл при разведении раствора 1/4. Через 21 день после введения проводили разрешающую инъекцию: одной группе животных (20 свинок) энтерально в дозе двукратной сенсибилизирующей, а другой группе - внутрисердечно в дозе, равной сенсибилизирующей. Предварительно на интактных животных была оттестирована разрешающая доза, которая не вызывала токсических реакций у данных животных. Интенсивность анафилактических реакций оценивали по 4-х бальной шкале по методу Weigle с вычислением анафилактического индекса /26/.

В течение эксперимента на 7, 14, 21 дни производили забор крови для выявления сенсибилизации животных реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК). Реакцию проводили с сыворотками крови морских свинок, получавших препарат, как описано выше. После получения сыворотки немедленно замораживали и хранили при -20°С до момента постановки опыта. Тучные клетки крыс получали по методу /27/. При постановке реакции предварительно была выбрана доза препарата, не превышающая неспецифической деструкции клеток. Реакцию проводили с цельными сыворотками. Все ингредиенты использовали в объеме 300 мкл. Перед тестированием ставили следующие контроли: 1) взвесь тучных клеток + разбавитель; 2) взвесь тучных клеток + нормальная сыворотка крови от морских свинок, полученная до иммунизации препаратом; 3) взвесь тучных клеток + тест-аллерген. Клетки использовали в эксперименте, если в каждом из контролей дегрануляция не превышала 5%.

Результаты изучения аллергенной активности по данным системной активной анафилаксии не выявили у исследованных препаратов сенсибилизирующего действия. Значения анафилактического индекса не превышали 0,5, что выгодно отличает данную группу препаратов от многих известных лекарственных препаратов, являющихся сильными аллергенами. Отсутствие сенсибилизирующего действия препаратов также показано в реакции непрямой деструкции тучных клеток (табл.10).

Как видно из представленных данных, введение препаратов не вызывало продукции иммуноглобулинов класса Е, ответственных за проявление аллергенных реакций немедленного типа.

1.3.2.3. Изучение иммунотоксических и иммуномодулирующих свойств БАД.

Изучение иммунотоксических свойств.

Изучение влияния БАД на массу и клеточность органов иммунной системы.

Определение влияния БАД на массу и клеточность органов иммунной системы проводили на мышах линии СВА. Препараты вводили ежедневно на протяжении 15 дней перорально в дозе 1/2 МПД, составляющей для водного концентрата Ascophyllum nodosum 7810 мг/кг, для крупки - 1000 мг/кг, для водного концентрата Fucus vesiculosus - 3500 мг/кг, для крупки - 1000 мг/кг. Исследования проводили через 3 дня после завершения курса лечения.

Контрольным животным вводили воду.

По завершении эксперимента животных забивали и выделяли тимус, селезенку и лимфоузлы. Клетки из органов выделяли и определяли их количество общепринятыми методами.

Как видно из приведенных в табл.11 данных, все препараты не оказывали токсического действия на центральные и периферические органы иммунной системы. Отменено незначительное увеличение массы и клеточности селезенки сравнены с контролем у групп животных, получавших препараты крупок.

Определение титра гемагглютининов в сыворотке крови.

Оценка влияния препаратов на гуморальное звено иммунного ответа проводилось по определению уровня гемагглютининов к различным антигенам (эритроциты барана и овальбумин) и определению количества антител класса IgM.

Для изучения влияния ЗАД на гуморальный иммунный ответ к эритроцитам барана и овальбумину использовали реакцию гемаглютинации с сыворотками крови от мышей линии СЗА, которым в течение 15 дней вводили препараты в дозе 0,5 МИД. В качестве антигенов использовали эритроциты барана (в дозе 10⁸ клеток/мышь) и овальбумин (в дозе 2 мг белка/кг), которые вводили на 15 сутки внутривенно. Отбор крови производили еженедельно на протяжении 4 недель. Контрольным животным вводили соответствующее количестве физраствора.

Для определения антител класса IgG к корпускулярному антигену (ЭБ) использовали реакцию гемагглютинации. Для определения антител к водорастворимому антигену овальбумину использовали твердофазный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах «Дайнатек» с проявлением сорбированных антител конъюгатом антимышиных антител с пероксидазой.

Результаты исследований приведены в табл.12. Отмечено достоверное увеличение синтеза гемагглютининов при введении водного концентрата Fucus vesiculosus на 14-21 сутки. Введение водного концентрата Ascophyllum nodosum вызывало слабую стимуляцию синтеза антител на 21 сутки по сравнению с контролем.

Исследование уровня антител к водорастворимому антигену при введении препарата не выявило влияния БАД на гуморальный иммунный ответ.

Определение влияния БАД на синтез антител класса IgM.

Определение влияния БАД на количество антител класса IgM проводили в реакции Эрие и Иордана /28/, рассчитывая количество антител - образующих клеток (АОК) к ЭБ в селезенке мышей линии СВА. Схема введения препаратов приведена в предыдущем разделе за исключением того, что определение АСК проводили на 5 сутки. Контрольным животным вводили соответствующее количество физраствора. Результаты эксперимента приведены в табл.13. Установлено, что многократное введение водного концентрата Fucus vesiculosus и экстракта из крупки Fucus vesiculosus несколько увеличивает количество АОК, однако достоверных различий не выявлено. Остальные препараты не изменяют количества АОК, секретирующих антитела класса IgM.

Оценка действия БАД на клеточный иммунитет.

Влияние препаратов на гиперчувствительность замедленного типа к ЭБ.

Способность БАД модулировать гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) к Т-зависимому антигену изучали на мышах линии СВА, иммунизированных внутривенно ЭБ в дозе 10 клеток/мышь. Препараты вводили перорально в дозе 0,5 МПД на протяжении 15 дней. Через 5 дней определяли уровень сенсибилизации животных, вводя разрешающую дозу ЭБ (10 клеток/мышь) в 50 мкл физиологического раствора в подушечку одной из задних лап мышей. В другую лапу, служившую контрольной, вводили равный объем физраствора. Контрольным животным в течение 15 дней вводили физраствор. Местную воспалительную реакцию учитывали через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена, определяя разницу масс опытной контрольной лапы и вычисляя затем индекс реакции /29/.

Иммуномодулирующую способность препаратов оценивали, сравнивая индивидуальные показатели индекса реакции животных контрольной и опытной групп.

Как видно из представленных в табл.14 данных, для всех исследованных препаратов не было выявлено угнетающего действия на функциональную активность Т-лимфоцитов.

Влияние БАД на функциональную активность Т-лимфоцитов.

Оценку возможного действия БАД на продукцию Т-лимфоцитами фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов /30/, проводили на мышах линии СВА, которым вводили препараты перорально в дозе 1/4 МПД на протяжении 15 дней, затем однократно внутрибрюшинно вводили ПАФ, содержащий 1250 мкг микобактерий в 1 мл. Через 6 дней после введения 0,4 мл ПАФ от мышей отбирали кровь, используя в качестве антикоагулянта гепарин. Реакцию проводили в 5-ти канальных капиллярах, добавляя в кровь раствор туберкулина 20 и 40 мкг/мл. В контрольные капилляры добавляли раствор Хенкса, не содержащий антиген (туберкулин). Продуцентами фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов в данном варианте реакции, служили лимфоциты крови, а мигрирующими клетками были моноциты и нейтрофилы. Учет результатов реакции проводили, микроскопируя капилляр после 24 часовой инкубации при 37°С во влажной камере. Миграцию лейкоцитов измеряли с помощью микрометрической линейки. Далее вычисляли показатель угнетения: миграции (ПУМ).

Данные, представленные в табл.15, свидетельствуют о некотором стимулировании функциональной активности Т-лимфоцитов препаратами из Fucus vesiculosus. Все препараты не угнетали продукцию данного лимфоцита Т-лимфоцитами.

Определение функциональной активности макрофагов.

Изучение влияния исследуемых препаратов на функциональную активность макрофагов проводили по тестам определения активности маркерного фермента макрофагов - 5'-нуклеотидазы, фермента пуринового метаболизма. Также была изучена активность макрофагов по способности к поглощению красителя - нейтрального красного. Исследовано также влияние препаратов на активность кислородозависимой антиинфекционной системы фагоцитоза в тесте восстановления нитросинего тетразолия (ИСТ). Методы исследования представлены в соответствующих разделах.

Метод определения фагоцитарной активности макрофагов основан на определении оптической плотности лизата фагоцитов, поглотивших частицы красителя нейтрального красного /31/. Эксперименты проводили на мышах линии СЗА нормальных и иммунокомпроментированных. Для создания иммунодепрессии животным вводили азатиоприн по схеме 25 мг/кг перорально трехкратно, 50 мг/кг внутрибрюшинно однократно. Для получения суспензии •макрофагов животным внутрибрюшинно вводили среду 199, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

Изучение протективного действия препаратов проводили в следующих группах:

1 - интактные животные;

2 - животные, получавшие препараты в течение 15 суток;

3 - животные, получавшие азатиоприн;

4 - животные, получавшие азатиоприн и исследуемые препараты.

Результаты изучения фагоцитарной активности макрофагов с использованием нейтрального красного при многократном введении исследуемых препаратов показали, что все исследуемые препараты в разной степени способствуют активации фагоцитоза у животных на фоне иммунодепрессии. Наиболее выраженное активизирующее действие на поглотительную способность макрофагов оказали препараты из Fucus vesiculosus. Данные препараты оказывали также стимулирующее действие и на интактных животных.

Для более углубленного изучения влияния препаратов на функциональную активность макрофагов была использована активность эктоплазматического фермента 5''-нуклеотидазы. Известно, что активность данного фермента снижается на этапах активации макрофагов. Активность фермента определяли в сыворотке крови мышей линии СВА, которым в течение 15 дней вводили перорально исследуемые препараты. Активность фермента определяли спектрофотометрически с использованием в качестве субстратов АМФ и глицерофосфата.

Как видно из табл.17, стимулирующим действием на активность макрофагов обладают препараты из Fucus vesiculosus. Препараты из Ascophyllum nodosum влияют на активность макрофагов. Таким образом, все исследованные препараты не оказывают иммунотоксического действия.

Исследования действия БАД на кислородозависимые антиинфекционные системы фагоцитов проводили на мышах линии СВА, которым перорально в течение 15 дней вводили препараты в дозе МПД по 0,5 мл. Контролем служили животные, получавшие в том же объеме физраствор. Гепаринизированную кровь в опытных и контрольных пробах смешивали с НСТ, инкубировали при 37°С, затем к части опытных и контрольных проб добавляли опсонизированный зимозан (стимулированный вариант). В результате восстановления НСТ переходит в нерастворимый диформазан, который и определяется спектрофотометрически в ДНФ при 670 нм.

Анализируя результаты действия препаратов на факторы естественной резистентности, можно заключить, что водный концентрат из Fucus vesiculosus повышает фагоцитарную активность. Препараты из Ascophyllum nodosum не оказывают подавляющего действия на неспецифические факторы защиты.

Заключение.

Результаты исследований массы и клеточности центральных и периферических органов иммунной системы, гуморального иммунного ответа к различным антигенам, функциональной активности Т-лимфоцитов и макрофагов и факторов неспецифической резистентности организма лабораторных животных не выявили иммунотоксического действия ни у одного из исследованных препаратов. Препараты не подавляли, а в ряде случаев стимулировали макрофагальное звено иммунитета.

Исследования иммуномодулирующей активности препаратов на интактных и иммунодепрессированных животных позволило отобрать два препарата, обладающие иммуностимулирующей активностью - препараты из Fucus vesiculosus (водный концентрат и крупка), которые оказывали некоторое стимулирующее действие па гуморальный иммунитет и клеточно-посредованные реакции и значительно усиливали макрофагальное звено иммунитета, повышая функциональную активность макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов, стимулируя кислородозависимые антиинфекционные системы фагоцитов как у интактных животных, так и у животных на фоне иммунодепрессии.

1.3.2.4. Изучение антимикробного действия БАД.

Исследованы водные концентраты из Ascophyllum nodosum и Fucus vesiculosus. Исследования проводили согласно Государственной фармакопеи СССР с использованием следующих тест-микроорганизмов Escherichia coli ATCC 32218, Bacillus subtilis ATCC 6533, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Candida albicans №1080/330 на стандартных средах (мясо-пептонный агар и среда Сабуро) методом диффузии в агар.

Определения проводили путем сравнения наличия или отсутствия зон угнетения роста микроорганизмов при испытаниях разведений препаратов и контроля, в качестве которого использовали препарат Катапол. Испытания проводились в трех повторностях.

Показано, что наиболее выраженным прямым антимикробным действием обладает водный концентрат Fucus vesiculosus. Так, минимальная подавляющая концентрация (МПК) в отношении культуры Staphylococcus aureus составляет 0,3 мг/мл, а в отношении Е.coli - 0,6 мг/мл. Несколько менее выраженной антимикробной активностью обладает препарат из Ascophyllum nodosum. Его МПК в отношении стафилококка - 0,6 мг/мл, а в отношении кишечной палочки - 2,5 мг/мл.

Исследованные препараты не угнетают рост культур Pseudomonas aeruginosa АТСС, Candida albicans.

1.3.2.5. Изучение защитного действия БАД на модели инфекционного процесса.

Использована модель острого стафилококкового сепсиса, которую воспроизводили на белых беспородных мышах введением внутрибрюшинно культуры Staphylococcus aureus в дозе 2 млрд. микробных тел на мышь. Препарат вводили за 6 дней до введения культуры и еще 2 дня после введения культуры перорально.

Эффективность БАД оценивали по продолжительности жизни и обсемененности стафилококком почечной ткани. Контрольным животным препарат не вводили. Вторым контролем служила группа животных, которым вводили тетрациклин.

Показано, что комбинированное введение препаратов из Fucus vesiculosus и тетрациклина позволило значительно увеличить продолжительность жизни животных. Комбинированное введение препаратов Fucus vesiculosus и антибиотика приводило в ряде случаев к заметной санации почечной ткани у животных со стафилококковым сепсисом (табл.19). Несколько меньшим защитным эффектом обладали препараты из Ascophyllum nodosum. Полученные данные свидетельствуют о способности исследованных препаратов в разной степени потенцировать активность антибиотика.

Оценка антиоксидантного действия.

Оценку влияния исследуемых образцов БАД на показатели окислительно-антиокислительной системы проводили на мышах, которым ежедневно перорально сводили исследуемые растворы препаратов в дозе 1/2 МПД. Модель нарушения перекисного окисления липидов воспроизводили введением внутримышечно по 0,25 мл масляного 7% раствора четыреххлористого углерода. В ходе опыта определяли содержание малонового диальдегида, диеновых конъюгатов поленасыщенных жирных кислот и гидроперекисей липидов в гомогенатах печени /32/.

Для определения содержания диеновых конъюгатов гомогенат печени мышей в буферном растворе экстрагировали смесью гептана и изопропилового спирта в соотношении 1:1. Затем аликвоты спиртовой фазы смешивали с этиловым спиртом в соотношении 1:10. Оптическую плотность растворов измеряли при 233 нм. Содержание диеновых конъюгатов в пробах рассчитывали исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных дионов полинасыщенных высших жирных кислот, равного 2,2×10⁵ л/(моль×см). Полученные результаты выражали в нмоль/г ткани (табл.20).

Для определения содержания гидроперекисей липидов гомогенат печени мышей в буферном растворе центрифугировали и добавляли к супернатанту этанол, соляную кислоту и 5% раствор соли Мора. Через 30 с добавляли 20% раствор тиоцианата аммония. Оптическую плотность измеряли в течение 10 мин при 480 нм. Содержание гидроперекисей в пробах рассчитывали, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для роданистого железа, разного 6300 л/(моль×см). Полученные результаты выражали в мкмоль/г ткани (табл.20).

Для определения содержания радонового диальдегида к гомогенату печени мышей в трис-буфере добавляли 17% раствор ТХУ и центрифугировали. К супернатанту добавляли 0,8% раствор тиобарбитуровой кислоты и пробы помещали на 10 мин на кипящую водяную баню. После развития розовой окраски пробы охлаждали до комнатной температуры и измеряли оптическую плотность при 532 нм. Количество малонового диальдегида рассчитывали, используя величину молярного коэффициента экстинкции триметинового комплекса, образующегося при взаимодействии диальдегида с тиобарбитуровой кислотой, равную 1,56×10³ л/(моль×см). Полученные результаты выражали в нмоль/г ткани (табл.20).

В результате проведенных исследований (табл.20) показано, что введение препаратов в разной степени снижает уровни диеновых конъюгатов, гидроперекисей и малонового диальдегида. Наиболее ярко выражено снижение диеновых конъюгатов, появляющихся на начальных этапах перекисного окисления и малонового диальдегида (конечного продукта) для препаратов Fucus vesiculosus. Это, по-видимому, может явиться основанием для их использования в качестве антиоксидантов.

Изучение защитного действия БАД.

Изучено влияние фукоидов на выживаемость мышей на моделях фармакологической, бактериальной к радиационной иммунодепрессии.

Фармакологическую иммунодепрессию осуществляли азатиоприном по схеме: 25 мг/кг перорально трехкратно, 50 мг/кг внутрибрюшинно однократно. Затем животным ежедневно перорально вводили исследуемые препараты в дозе 0,5 МПД. Наблюдение вели в течение двух недель.

Бактериальную иммунодепрессию воспроизводили на мышах линии СВА введением внутрибрюшинно культуры Staphylococcus aureus в дозе 2 млрд. микробных тел на мышь. Препараты в дозе 0,5 МПД вводили за 8 дней до введения культуры и еще 7 дней после введения культуры перорально.

Опыты по защитному действию БАД при радиационной иммунодепрессии проводили на мышах СВА, облученных дозой 600 р на аппарате РУМ-1 7. Препараты вводили, как описано выше, за 2 дня до облучения и далее ежедневно.

Как видно из табл.21, все исследуемые препараты в разной степени оказывают защитное действие на организм животных с иммунодепрессией различного генеза, наибольшее защитное действие оказывали препараты из Fucus vesiculosus, что свидетельствует о возможности использования этих препаратов в комплексной терапии иммунодефицитов различной природы.

1.3.2.7. Выводы.

1. Все исследованные препараты не оказывают токсического действия на организм лабораторных животных в острых опытах и относятся к классу малотоксичных веществ.

2. Общетоксические свойства препаратов при многократном введении в хроническом эксперименте отсутствуют. Препараты хорошо переносятся животными и не вызывают нарушений функционального состояния.

3. Препараты не оказывают иммунотоксического и аллергенного действия.

4. Препараты из Fucus vesiculosus оказывают выраженное иммуностимулирующее действие, повышая функциональную активность макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов.

5. Исследованные препараты оказывают защитное действие на организм животных с моделированной иммунодепрессией различного генеза, причем защитное действие препаратов из Fucus vesiculosus выражено сильнее.

6. Исследованные препараты в разной степени обладают прямым антимикробным действием в отношении Escherichia coli и Staphilococcus.

7. Исследованные препараты оказывают выраженное антиоксидантное действие у животных на модели нарушения перекисного окисления липидов.

1.3.3. Результаты микробиологических испытаний продукции из фукоидов.

Целью данных исследований является определение сроков хранения продукции из фукоидов.

Образцы продукции из Fucus vesiculosus были получены 20 марта, а из Ascophyllum nodosum - 26 марта 2001 года. Микробиологические исследования образцов выполнены декабря 2001 г., т.е. после девяти месяцев хранения при комнатной температуре.

Представленные копии протоколов испытании показывают, что образцы продукции являются благополучными и вполне соответствуют требованиям СанП и Н 2.3.2.560-96 /33/ пп.6.10.1.4 БАД - источники преимущественно пищевых волокон, пп.6.10.1.6. БАД - источники преимущественно макро- и микроэлементов и п.6.10.2. - источники физиологически активных веществ (парафармацевтики) (табл.22).

1.3.4. Обоснование использования продукции из фукоидов в качестве БАДов.

Согласно закону РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 2.01.2000 г. /5/ пищевые добавки и биологически активные добавки (БАД) относятся к пищевым продуктам. Этим двум видам пищевой продукции закон дает следующее определение:

- пищевые добавки природные или искусственные вещества и их соединения, специально вводимые в пищевые продукты в процессе их изготовления в целях придания пищевым продуктам определенных свойств и (или) сохранения качества пищевых продуктов;

- биологически активные добавки - природные (идентичные природным) биологически активные вещества, предназначенные для употребления одновременно с пищей или введения в состав пищевых продуктов.

Мы применяли раствор экстракта «Фукус» при лечении воспалительных заболеваний пародонта.

Экстракт «Фукус» (ТУ 9284-001-00472035-2001) пищевой (далее по тексту - экстракт), получаемый из морских бурых водорослей Ascophyllum nodosum и Fucus vesiculosus. Экстракт получают экстрагированием воздушно-сухих водорослей этиловым спиртом с последующим удалением экстрагена.

Экстракт содержит полисахариды, маннит, кальций, магний, калий, натрий, цинк, микроэлементы, йод. Предназначен для использования в качестве БАД к пище для восполнения пищевого рациона йодом, углеводами, макро- и микроэлементами. Его употребление показано при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, атеросклерозе, при пониженной работоспособности и ослабленном иммунитете, а также при неблагоприятных факторах.

Технические требования.

1. Экстракт "Фукус" пищевой (далее экстракт) должен соответствовать настоящим техническим условиям и вырабатываться по действующей технической инструкции с соблюдением санитарных норм и правил, утвержденных в установленном порядке.

2. Сырьем для изготовления экстракта служат морские бурые водоросли Fucus vesiculosus и Ascophyllum nodosum.

3. Характеристики.

По органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям экстракт должен соответствовать требованиям, указанным в табл.1, 2.

Требования к сырью и м