Способ снижения доступности питательного вещества, способ подавления аппетита

Способ снижения доступности питательного вещества, способ подавления аппетита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на выдачу патента США No.60/256216, озаглавленной "Пептид YY и агонисты пептида YY для лечения ожирения, диабета и других метаболических расстройств", поданной 15 декабря 2000 г., содержание которой включено в данное описание в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения метаболических состояний или расстройств, в частности таких, которые можно облегчить путем снижения доступности калорийных веществ, например для лечения диабета, ожирения, расстройств питания, синдрома инсулиновой резистентности (синдрома Х), непереносимости глюкозы, дислипедимии и сердечно-сосудистых заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКА

Ряд родственных гормонов составляют семейство панкреатического полипептида (PP). Панкреатический полипептид был открыт в виде примеси в экстрактах инсулина и был назван, прежде всего, по органу своего происхождения, а не по функциональному значению (Kimmel, Pollock et al. Endocrinology 83: 1323-30, 1968). PP является 36-аминокислотным пептидом [SEQ ID NO: 1], содержащим характерные структурные мотивы. Позже родственный пептид был открыт в экстрактах кишечника и назван пептидом YY (PYY) из-за наличия N- и C-концевых тирозинов (Tatemoto. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2514-8, 1982) [SEQ ID NO: 2]. Позднее в экстрактах головного мозга был обнаружен третий родственный пептид и назван нейропептидом Y (NPY) (Tatemoto. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5485-9, 1982; Tatemoto, Carlquist et al. Nature 296: 659-60, 1982) [SEQ ID NO: 4].

Сообщалось, что три указанных пептида вызывают различные биологические эффекты. Эффекты PP включают ингибирование секреции поджелудочной железы и релаксацию желчного пузыря. При центральном введении PP вызывает умеренное увеличение потребления пищи, которое может быть опосредовано рецепторами, локализованными в гипоталамусе и стволе головного мозга (обзор (Gehlert. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22, 1998)).

Высвобождение PYY [SEQ ID NO: 2] происходит после приема пищи. Альтернативной молекулярной формой PYY является PYY[3-36] [SEQ ID NO: 3] (Eberlein, Eysselein et al. Peptides 10: 797-803, 1989) (Grandt, Schimiczek et al. Regul. Pept. 51: 151-9, 1994). Данный фрагмент составляет примерно от 40% суммарной PYY-подобной иммунореактивности в кишечных экстрактах человека и собаки и примерно 36% суммарной иммунореактивности PYY в плазме в состоянии голода до немногим более 50% после приема пищи. По-видимому, он является продуктом расщепления PYY дипептидилпептидазой-IV (DPP4). По имеющимся сообщениям PYY[3-36] представляет собой избирательный лиганд рецепторов Y2 и Y5, которые, по-видимому, являются фармакологически уникальными в отношении предпочтения укороченных на N-конце (т.е. C-концевых фрагментов) аналогов NPY. По имеющимся сообщениям при периферическом введении PYY снижает секрецию желудочной кислоты, моторику желудка, экзокринную секрецию поджелудочной железы (Yoshinaga, Mochizuki et al. Am. J. Physiol. 263: G695-701, 1992), (Guan, Maouyo et al. Endocrinology 128: 911-6, 1991), (Pappas, Debas et al. Gastroenterology 91: 1386-9, 1986), сокращение желчного пузыря и моторику кишечника (Savage, Adrian et al. Gut 28: 166-70, 1987). Влияние центральной инъекции PYY на опорожнение желудка, моторику желудка и секрецию желудочной кислоты, которое наблюдается после прямой инъекции в задний мозг/ствол головного мозга или вокруг указанного места (Chen and Rogers. Am. J. Physiol. 269: R787-R792, 1995), (Chen, Rogers et al. Regul. Pept. 61: 95-98, 1996), (Yang and Tache. Am. J. Physiol. 268: G943-8, 1995), (Chen, Stephens et al. Neurogastroenterol. Motil. 9: 109-116, 1997), может отличаться от влияния, наблюдаемого при периферической инъекции. Например, при центральном введении PYY оказывает некоторые воздействия, противоположные воздействиям, приведенным в данном описании в случае периферической инъекции PYY[3-36], при котором происходило не ингибирование, а стимуляция секреции желудочной кислоты. Моторика желудка подавлялась только вместе со стимуляцией TRH, но не подавлялась при отдельном введении, и в действительности стимулировалась при высоких дозах, предположительно благодаря взаимодействию с рецепторами PP. Показано, что PYY стимулирует потребление пищи и воды после центрального введения (Morley, Levine et al. Brain Res. 341: 200-203, 1985), (Corp, Melville et al. Am. J. Physiol. 259: R 317-23, 1990).

Подобным образом одним из центральных воздействий NPY [SEQ ID NO: 4] в самых ранних сообщениях было увеличение потребления пищи, в частности при воздействии на гипоталамус (Stanley, Daniel et al. Peptides 6: 1205-11, 1985). Сообщается, что PYY и PP имитируют указанные воздействия и что PYY является более эффективным или эффективным так же, как NPY (Morley, J.E., Levine, A.S., Grace, M., and Kneip, J. Brain Res. 341: 200-203, 1985), (Kanatani, Mashiko et al. Endocrinology 141: 1011-6, 2000), (Nakajima, Inui et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 268: 1010-4, 1994). Несколькими группами обнаружено, что значение индуцированного NPY потребления пищи выше, чем потребление, индуцированное каким-либо ранее тестированным фармакологическим средством, а также чрезвычайно долго продолжается. Индуцированная NPY стимуляция потребления пищи воспроизведена у ряда видов. Из трех основных питательных макроэлементов (жиры, белки и углеводы) предпочтительно стимулировалось поглощение углеводов. Не наблюдалось толерантности по отношению к возбуждающему аппетит воздействию NPY, и в том случае, когда введение пептида повторялось в течение 10 дней, наблюдалось заметное увеличение скорости прироста массы. После голодания концентрация NPY в гипоталамическом PVN увеличивалась с течением времени и быстро возвращалась к контрольным уровням после приема пищи.

Фармакологические исследования и попытки клонирования выявили ряд рецепторов пептидов семейства PP, имеющих семь трансмембранных доменов, и указанным рецепторам даны названия от Y1 до Y6 (и предполагаемый рецептор, предпочтительно взаимодействующий с PYY, или Y7). Обычные ответы по передаче сигнала указанных рецепторов сходны с ответами других рецепторов, связанных с G_i/G_o, а именно - ингибирование аденилатциклазы. Даже при достаточно низкой гомологии последовательностей среди рецепторов, несомненно, что существует сходство в образовании кластеров аминокислотной последовательности между рецепторами Y1, Y4 и Y6, тогда как Y2 и Y5 имеют характеристики других семейств. Другие сайты связывания идентифицировали на основании порядка ранжирования эффективности различных пептидов. Рецептор, предпочтительно взаимодействующий с NPY, который не был клонирован, назван Y3, а также показано, что существует рецептор, предпочтительно взаимодействующий с PYY (предполагаемый Y7) (обзор в (Michel, Beck-Sickinger et al. Pharmacol. Rev. 50: 143-50, 1998), (Gehlert, D.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22, 1998)).

Предполагалось, что рецепторы Y5 и Y1 являются первичными медиаторами ответа, проявляющегося в виде потребления пищи (Marsh, Hollopeter et al. Nat. Med. 4: 718-21, 1998), (Kanatani, A., Mashiko, S., Murai, N., Sugimoto, N., Ito, J., Fukuroda, T., Fukami, T., Morin, N., MacNeil, D.J., Van der Ploeg, L.H., Saga, Y., Nishimura, S., and Ihara, M. Endocrinology 141: 1011-6, 2000). Преобладающей идей была идея о том, что эндогенный NPY через указанные рецепторы усиливает поведение, связанное с потреблением пищи. Предлагаемая терапия при ожирении неизменно была направлена на антагонизм рецепторов NPY, тогда как терапия в случае лечения анорексии была обращена к агонистам указанного семейства лигандов (смотри, например, патенты США No.5939462; 6013622 и 4891357). В общем, сообщалось, что PYY и NPY являются равносильными и в равной мере эффективными во всех проводимых анализах рецепторов Y1, Y5 (и Y2) (Gehlert, D.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22, 1998).

Основной характеристикой предполагаемых рецепторов Y3 является то, что они узнают NPY, тогда как PYY является, по меньшей мере, на порядок значений менее эффективным. Рецептор Y3 представляет собой рецептор с единственным сайтом связывания, который проявляет предпочтение по отношению к NPY.

Существует дополнительный сайт связывания/рецептор, который проявляет предпочтение по отношению к PYY, названный PYY-предпочитающим рецептором, который в данном описании упоминается как рецептор(ры) Y7. Имеются сообщения о различных порядках ранжирования связывания с указанным рецептором или классом рецепторов, что свидетельствует о том, что в данном семействе может существовать более одного рецептора. В большинстве случаев это наименование использовали для описания рецептора в том случае, когда PYY был в три-пять раз более эффективным, чем NPY. Рекомендации Международного союза в области фармакологии относительно номенклатуры рецепторов NPY, PYY и PP состоят в том, чтобы термин PYY-предпочитающий рецептор не использовали в том случае, если не наблюдается различие в эффективности между PYY и NPY, составляющее, по меньшей мере, двадцать раз. (Michel, M.C., Beck-Sickinger, A., Cox, H., Doods, H.N., Herzog, H., Larhammar, D., Quirion, R., Schwartz, T., and Westfall, T. Pharmacol. Rev. 50: 143-50, 1998). Однако в целях данного описания ссылка на рецептор Y7 или фармакологию PYY-предпочитающего рецептора означает, рецептор обладает некоторой степенью предпочтения для PYY по сравнению с NPY.

Ожирение и связанные с ним расстройства широко распространены и представляют собой очень серьезные проблемы для здравоохранения в Соединенных Штатах и во всем мире. Высокая степень ожирения тела является самым мощным известным фактором риска развития сахарного диабета типа 2 и является высоким фактором риска развития сердечно-сосудистого заболевания. Ожирение является общепризнанным фактором риска в случае гипертензии, атеросклероза, застойной сердечной недостаточности, удара, заболевания желчного пузыря, остеоартрита, апноэ во сне, репродуктивных расстройств, таких как синдром поликистозного яичника, злокачественные опухоли молочной железы, простаты и ободочной кишки и повышенная частота возникновения осложнений при общей анестезии (смотри, например, (Kopelman. Nature 404: 635-43, 2000)). Ожирение снижает продолжительность жизни и влечет за собой серьезный риск сочетания вышеприведенных заболеваний, а также таких заболеваний, как инфекции, варикозные вены, акантокератодермия, экзема, непереносимость физической нагрузки, резистентность к инсулину, гипертензия, гиперхолестеринемия, желчно-каменная болезнь, повреждение опорно-двигательного аппарата и тромбоэмболическое заболевание (Rissanen, Heliovaara et al. BMJ 301: 835-7, 1990).

Ожирение также является фактором риска для группы состояний, называемых синдромом инсулиновой резистентности или "синдромом X". Недавние оценки расходов на лечение ожирения и связанных расстройств составляют 150 миллиардов долларов во всем мире. Предполагается, что патогенез ожирения является многофакторным, но основная проблема состоит в том, что у субъектов с ожирением не достигается баланса между доступностью питательных веществ и затратами энергии до тех пор, пока существует избыток жировой ткани. Ожирение в настоящее время является плохо поддающимся лечению, хроническим, по существу трудноизлечимым метаболическим расстройством. Терапевтическое лекарственное средство, применимое для снижения массы людей с ожирением, может оказывать мощное целебное действие на их здоровье.

Все документы, которые упоминаются в данном описании, включены в данную заявку в виде ссылки, как будто полностью указаны в данном описании.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В противоположность сообщениям об активностях, проявляемых представителями семейства панкреатического полипептида при центральном введении, было обнаружено, что при периферическом введении агонисты PYY и PYY снижают доступность питательных веществ и применимы для лечения ожирения и родственных расстройств. В данной изобретении представлены композиции PYY и агонистов PYY и их применения для модулирования доступности питательных веществ у пациента для лечения метаболических расстройств, которые можно излечить путем снижения доступности питательных веществ. Указанные способы будут применимы, например, при лечении ожирения, диабета, включая, но не ограничивая указанным, диабет типа 2 или инсулиннезависимый диабет, расстройства питания, синдром инсулиновой резистентности и сердечно-сосудистое заболевание.

Термин "PYY" означает полипептид пептида YY, получаемый или производимый из любого вида. Таким образом, термин "PYY" включает как полноразмерный 36-аминокислотный пептид человека, указанный в SEQ ID NO: 2, так и видовые варианты PYY, включая, например, PYY мыши, хомячка, цыпленка, крупного рогатого скота, крысы и собаки. "Агонист PYY" означает любое соединение, которое вызывает эффект PYY, снижая доступность питательного вещества, например соединение (1), обладающее активностью в анализах поглощения пищи, опустошения желудка, секреции поджелудочной железы или потери массы, приведенных в данном описании в примерах 1, 2, 5 или 6, и (2), которое специфично связывается в анализе рецептора Y (пример 10) или в анализе конкурентного связывания с меченым PYY или PYY[3-36] из некоторых тканей, имеющих избыточное количество рецепторов Y, включая, например, area postrema (пример 9), при этом агонист PYY не является панкреатическим полипептидом. Предпочтительно агонисты PYY могут связываться в таких анализах с аффинностью, превышающей 1 мкМ, и более предпочтительно с аффинностью, превышающей 1-5 нМ.

Такие агонисты могут содержать полипептид, имеющий функциональный домен PYY, активный фрагмент PYY или химическую или малую молекулу. Агонисты PYY могут быть пептидными или непептидными соединениями и включают "агонистические аналоги PYY", и этот термин относится к любому соединению, сходному по структуре с PYY, которое обладает активностью обычно посредством связывания или другого прямого или непрямого взаимодействия с рецептором PYY или другим рецептором или рецепторами, с которыми может взаимодействовать сам PYY, вызывая биологический ответ. Такие соединения включают производные PYY, удлиненные молекулы PYY, имеющие более 36 аминокислот, укороченные молекулы PYY, имеющие менее 36 аминокислот, и замещенные молекулы PYY, имеющие одну или несколько других аминокислот, или любую комбинацию соединений, перечисленных выше. Такие соединения также могут быть модифицированы посредством такого способа, как амидирование, гликозилирование, ацилирование, сульфатирование, фосфорилирование, ацетилирование и циклизация.

Одним из таких агонистических аналогов PYY является PYY[3-36], идентифицированный в данном описании в виде SEQ ID NO: 3. Полипептиды с числами в скобках относятся к укороченным полипептидам, имеющим последовательность полноразмерного пептида на протяжении положений аминокислот, указанных в скобках. Таким образом, PYY[3-36] имеет последовательность, идентичную PYY на протяжении аминокислот с 3 по 36. Агонист PYY может связываться с рецептором PYY с более высокой и более низкой аффинностью, проявлять более длительное или более короткое время полужизни in vivo или in vitro, или является более эффективным или менее эффективным, чем нативный PYY.

Под термином "состояние или расстройство, которое можно облегчить посредством снижения доступности калорийных (или питательных) веществ", подразумевают любое состояние или расстройство у субъекта, которое либо вызвано, осложняется, либо обостряется относительно высокой доступностью питательных веществ, или которое можно облегчить путем снижения доступности питательных веществ, например, путем снижения потребления пищи. Такие состояния или расстройства включают, но не ограничены указанным, ожирение, диабет, включая диабет типа 2, расстройства питания и синдром инсулиновой резистентности.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения ожирения у субъекта с ожирением или избыточным весом путем введения терапевтически эффективного количества PYY или агониста PYY. Хотя "ожирение" обычно определяют как состояние, когда индекс массы тела превышает 30, в целях данного описания любой субъект, включая субъектов с индексом массы тела менее 30, который нуждается или хочет снизить массу тела, включен в рамки термина "ожирение". Пользу от такого способа могут получить субъекты, у которых имеется резистентность к инсулину, непереносимость глюкозы или любая форма сахарного диабета (например, диабет типа 1, 2 или диабет беременных).

В других аспектах отличительным признаком изобретения являются способы снижения потребления пищи, лечения сахарного диабета и улучшения липидного профиля (включая снижение уровней ЛНП-холестерина и триглицеридов и/или изменение уровней ЛВП-холестерина), включающие в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества PYY или агониста PYY. В предпочтительном варианте способы согласно изобретению используют для лечения состояний или расстройств, которые можно облегчить путем снижения доступности питательных веществ у нуждающегося в этом субъекта, и способы включают введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества PYY или агониста PYY. Такие состояния и расстройства включают без ограничения гипертензию, дислипедимию, сердечно-сосудистое заболевание, расстройства питания, резистентность к инсулину, ожирение и сахарный диабет любого вида.

В способах согласно изобретению предпочтительными агонистами PYY являются агонисты, обладающие эффективностью в одном из анализов, приведенных в данном описании (предпочтительно в анализах потребления пищи, опорожнения желудка, секреции поджелудочной железы или снижения массы), которая превышает эффективность NPY в том же анализе.

При всех симптомах в предпочтительных вариантах предпочтительным агонистом PYY является PYY[3-36], и его предпочтительно вводят периферически в дозе, составляющей примерно от 1 мкг до 5 мг в сутки в виде однократной или разделенной доз, или примерно от 0,01 мкг/кг до 500 мкг/кг на дозу, более предпочтительно примерно от 0,05 мкг/кг до 250 мкг/кг, наиболее предпочтительно примерно ниже 50 мкг/кг. Дозирование в указанных пределах будет варьироваться в зависимости от эффективности каждого агониста, курса лечения и легко определяется специалистом в данной области.

В способах согласно данному изобретению PYY и агонисты PYY можно вводить отдельно или вместе с одним или несколькими другими соединениями и композициями, которые оказывают длительное или кратковременное действие, снижая доступность питательных веществ, включая, но не ограничивая указанным, другие соединения и композиции, которые содержат амилин или агонист амилина, холецистокинин (CCK) или агонист CCK, лептин (белок OB) или агонист лептина, эксендин или агонист эксендина или GLP-1 или агонист GLP-1. Подходящие агонисты амилина включают, например, [25, 28, 29 Pro-]амилин человека (также известный как "прамлинтид" и описанный в патентах США No.5686511 и 5998367) и кальцитонин лосося. Используемый CCK предпочтительно является октопептидом CCK (CCK-8). Лептин обсуждается, например, в (Pelleymounter, Cullen et al. Science 269: 540-543, 1995), (Halaas, Gajiwala et al. Science 269: 543-6, 1995) и (Campfield, Smith et al. Science 269: 546-549, 1995). Подходящие эксендины включают эксендин-3 и эксендин-4, а соединения агонистов эксендина включают, например, соединения, описанные в заявках PCT WO 99/07404, WO 99/25727 и WO 99/25728.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 является графиком активности лигандов рецептора Y в анализе потребления пищи у мышей NIH/SW, голодавших в течение ночи.

Фиг.2 является графиком активности различных лигандов рецептора Y в анализе опустошения желудка у крыс HSD.

На фиг.3 показано ингибирование секреции желудочной кислоты у крыс при остром периферическом введении PYY[3-36]. Данные выражены в виде мкмоль секретированной кислоты/10 мин.

Фиг.4 является диаграммой, на которой показано, что острое периферическое введение PYY[3-36] предотвращает опустошение желчного пузыря у мышей. Указанное действие может быть обратимо при введении CCK-8.

На фиг.5 показано острое дозозависимое действие подкожно вводимого PYY[3-36], ингибирующего стимулированную CCK-8 экзокринную секрецию поджелудочной железы (анализ на основе активности амилазы) у крыс.

На фиг.6 показан сниженный прирост массы тела у мышей C57B1/6 с ожирением (ожирение, индуцированное диетой, или DIO) при непрерывной периферической инфузии PYY[3-36] в течение периода, равного четырем неделям.

На фиг.7 показано влияние непрерывной периферической инфузии PYY[3-36] на снижение эффективности калорийных веществ у мышей C57B1/6 с ожирением (ожирение, индуцированное диетой или DIO) в течение периода, равного четырем неделям.

На фиг.8 показано улучшение гликемического контроля, измеренное по изменению HbA1c в процентах в течение периода, равного 28 дням, у диабетических крыс с ожирением (ZDF) при непрерывной периферической инфузии PYY[3-36].

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Считалось общепринятым, что эндогенный NPY (обзор в (Schwartz, Woods et al. Nature 404: 661-71, 2000)) и PYY (Morley, J.E., Levine, A.S., Grace, M., and Kneip, J. Brain Res. 341: 200-203, 1985)) через свои рецепторы усиливают поведение, связанное с потреблением пищи. В способах, направленных на лечение ожирения, неизменно стремились оказать антагонистическое воздействие на рецепторы Y, тогда как заявленные способы для лечения анорексии были направлены на агонистов данного семейства лигандов. Однако, как описано и заявлено в данном изобретении, неожиданно было обнаружено, что периферическое введение PYY и его агонистов оказывает сильное воздействие, уменьшая доступность питательных веществ, а не увеличивая ее, как свидетельствуют сообщения в патентной и научной литературе (смотри, например, патенты США No.5912227 и 6315203, в которых заявлено об использовании агонистов рецепторов PYY для того, чтобы увеличить прирост массы). Спектр действий по ингибированию потребления пищи, замедлению опорожнения желудка, ингибированию секреции желудочной кислоты и ингибированию секреции ферментов поджелудочной железы полезен, обеспечивая клинические преимущества при метаболических заболеваниях, таких как сахарный диабет типа 1, типа 2 или сахарный диабет беременных, ожирение и другие проявления синдрома инсулиновой резистентности (синдрома X), и при любом другом применении для снижения доступности питательных веществ.

Применение PYY и агонистов PYY для снижения потребления пищи и доступности питательных веществ и при лечении таких расстройств, как диабет и ожирение, ранее не было заявлено. Действительно такое применение при диабете невозможно предсказать из-за отсутствия острого действия на уровень глюкозы в крови и исходя из сообщений об ингибировании секреции инсулина. Однако в данном описании показано, что группа лигандов и агонистических лигандов будет пригодна при таких состояниях и родственных состояниях.

Данные заявителя свидетельствуют о том, что эффекты периферически введенного PYY или PYY[3-36] в снижении потребления пищи и замедлении опустошения желудка определяются взаимодействием с одним или несколькими уникальными классами рецепторов семейства рецепторов с Y-упаковкой или сходных с ними рецепторов. Эти данные лучше всего объяснимы за счет взаимодействий с рецептором или рецепторами, подобными PYY-предпочитающим (или Y7) рецепторам, и хуже объяснимы за счет взаимодействий с другими известными рецепторами Y, такими как Y1-Y6. В таблице 1 (ниже) показаны опубликованные данные об эффективности лигандов семейства PP для известных рецепторов, а также некоторые неопубликованные данные заявителя и порядок ранжирования эффективности различных лигандов. Порядок ранжирования эффективности в приведенных в данном описании примерах не соответствует ни одним опубликованным фармакологическим данным о рецепторах и свидетельствует о новом механизме действия PYY в снижении доступности калорийных веществ.

В данном изобретении можно использовать любой PYY или агонист PYY. Предпочтительные агонисты PYY включают пептидные агонисты, в частности агонистические аналоги PYY, такие как PYY[3-36]. Аналоги, например, можно получить с помощью консервативной аминокислотной замены в последовательности PYY или ее части, и можно проверить в анализах, приведенных в примерах, или других подходящих анализах, которые отличают действия PYY от действия NPY или PP. Также предполагаются непептидные агонисты.

Спектр действий, проявляемых PYY, например, ингибирование потребления пищи, замедление опустошения желудка, ингибирование секреции желудочной кислоты и ингибирование секреции ферментов поджелудочной железы и т.д., осуществляется согласованно, ограничивая усвоение пищи и тем самым обеспечивая клиническое преимущество при таких метаболических заболеваниях, как сахарный диабет, ожирение, сердечно-сосудистое заболевание (атеросклероз, гипертензия, дислипидемия и т.д.) и проявления синдрома инсулиновой резистентности (например, синдрома X).

Последовательности пептидов человека в семействе лигандов PP, упоминаемых в данном описании, представляют собой следующие последовательности (указаны с помощью обычного однобуквенного кода аминокислот):

PP: APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRYINMLTRPRY (SEQ ID NO: 1)

PYY: YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY (SEQ ID NO: 2)

PYY[3-36]: IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY (SEQ ID NO: 3)

NPY: YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY (SEQ ID NO: 4)

Указанные пептиды амидируются на С-конце при физиологической экспрессии, но не нуждаются в амидировании в целях данного изобретения. Указанные пептиды также могут иметь другие посттрансляционные модификации.

PYY и агонисты на основе пептида PYY, представленные в данном описании, можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии или химического синтеза пептидов, известными в данной области, например, с использованием автоматического или полуавтоматического синтезатора пептидов.

Твердофазный синтез пептидов можно проводить с помощью автоматического синтезатора пептидов (например, модель 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), используя систему NMP/HOBt (вариант 1) и химию на основе tBoc или Fmoc (смотри, Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp.49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) и кэпирование. Пептиды также можно синтезировать с использованием синтезатора Advanced Chem Tech (модель MPS 350, Louisville, Kentucky). Пептиды можно очищать ОФ-ВЭЖХ (препаративной или аналитической), используя, например, систему Waters Delta Prep 3000 и препаративную колонку C4, C8 или C18 (10 мк, 2,2×25 см; Vydac, Hesperia, CA).

Пептидные соединения, применимые в изобретении, также можно получить с применением технологии рекомбинантной ДНК, используя способы, известные в данной области. Смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor (1989). Непептидные соединения, применимые в данном изобретении, можно получить известными в данной области способами. Например, можно получить содержащие фосфат аминокислоты и пептиды, содержащие такие аминокислоты, используя способы, известные в данной области. Смотри, например, Bartlett and Landen, Biorg. Chem. 14: 356-377 (1986).

Описанные выше соединения полезны с точки зрения их фармакологических свойств. В частности, соединения согласно изобретению обладают активностью в качестве агентов, снижающих доступность питательных веществ, включая уменьшение потребления пищи.

Композиции или фармацевтические композиции можно вводить любым путем, включая внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и внутримышечный путь, можно вводить перорально, местно, через слизистую оболочку или путем ингаляции легких. Композиции, применимые в изобретении, удобно поставлять в форме композиций, подходящих для парентерального (включая внутривенное, внутримышечное и подкожное), назального или перорального введения. В некоторых случаях удобно поставлять PYY или агонист PYY и другой агент, снижающий потребление пищи, снижающий уровень глюкозы в крови или изменяющий липидный состав плазмы, такой как амилин, агонист амилина, CCK или агонист CCK, или лептин или агонист лептина, или эксендин или агонист эксендина, в одной композиции или растворе для совместного введения. В других случаях предпочтительным может быть введение дополнительного агента отдельно от указанного PYY или агониста PYY.

Подходящую форму введения индивидуально для каждого пациента лучше всего может определить лечащий врач. Различные фармацевтически приемлемые носители и их композиции описаны в стандартных учебных пособиях по составлению композиций, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W.Martin. Смотри также Wang, Y.J. and Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No.10, Supp. 42: 2S (1988).

Соединения, применимые в изобретении, можно поставлять в виде парентеральных композиций, например, для инъекции или инфузии. Предпочтительно их суспендируют в водном носителе, например в изотоничном буферном растворе, при pH примерно от 3,0 до 8,0, предпочтительно при pH примерно от 3,5 до 7,4, от 3,5 до 6,0 или от 3,5 до примерно 5,0. Пригодные буферы включают буферы: цитрат натрия-лимонная кислота и фосфат натрия-фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота. Форму препарата длительного действия или препарата замедленного высвобождения из "депо" можно использовать для того, чтобы терапевтически эффективные количества препарата доставлять в кровяное русло в течение многих часов или дней после трансдермальной инъекции или доставки.

Так как продукты согласно изобретению являются амфотерными, их можно использовать в виде свободных оснований, в виде кислотно-аддитивных солей или в виде солей металлов. Конечно соли должны быть фармацевтически приемлемыми, и они будут включать соли металлов, в частности соли щелочных и щелочноземельных металлов, например соли калия или натрия. Доступно широкое множество фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Такие продукты легко получают способами, хорошо известными специалистам в данной области.

Для применения врачом композиции будут предоставлены в дозированной лекарственной форме, содержащей некоторое количество PYY или агониста PYY в присутствии или без другого активного ингредиента, например агента, уменьшающего потребление пищи, снижающего уровень глюкозы в плазме или изменяющего липидный состав плазмы. Терапевтически эффективными количествами PYY или агониста PYY для применения в снижении доступности питательных веществ являются количества, которые подавляют аппетит до требуемого уровня. Как будет понятно специалистам в данной области, эффективное количество терапевтического средства будет варьироваться в зависимости от многих факторов, включая возраст и массу пациента, физическое состояние пациента, уровень сахара в крови, уровень массы, который необходимо получить, и других факторов.

Эффективная суточная подавляющая аппетит доза соединений обычно будет в пределах примерно от 1-30 мкг до примерно 5 мг/сутки, предпочтительно примерно от 10-30 мкг до 2 мг/сутки и более предпочтительно примерно от 5-100 мкг до 1 мг/сутки, наиболее предпочтительно примерно от 5 мкг до 500 мкг/сутки для пациента массой 50 кг при введении в виде однократной или разделенных доз. Предпочтительно дозы составляют примерно от 0,01 до 100 мкг/кг/дозу. Точную дозу, которую необходимо ввести, легко определит специалист в данной области, и она зависит от эффективности конкретного соединения, а также от возраста, массы и состояния индивидуума. Введение следует начинать всякий раз, когда требуется подавление доступности питательных веществ, потребления пищи, массы, понижение уровня глюкозы в крови или содержания липидов в плазме, например, при первом признаке симптомов или сразу после диагностирования ожирения, сахарного диабета или синдрома инсулиновой резистентности. Введение можно осуществлять любым путем, например, инъекцией, предпочтительно подкожной или внутримышечной, пероральным, назальным, трансдермальным и т.д. путями. Дозы при некоторых путях введения, например для перорального введения, должны быть увеличены, принимая во внимание пониженную биодоступность, например, примерно в 5-100 раз.

Оптимальная лекарственная форма и способ введения соединений согласно данной заявке пациенту зависят от факторов, известных в данной области, таких как конкретное заболевание или расстройство, требуемый эффект и тип пациента. Хотя, как правило, соединения будут использованы для лечения людей, их также можно использовать для лечения сходных или идентичных заболеваний у других позвоночных, таких как другие приматы, сельскохозяйственных животных, таких как свинья, корова и домашняя птица, и спортивных животных и домашних животных, таких как лошади, собаки и кошки.

Скрининг дополнительных агонистов PYY

Другие агонисты PYY можно идентифицировать с использованием анализов связывания с рецептором, описанных ниже (например, в примерах 9 и 10) или известных в данной области в комбинации с физиологическими скрининговыми исследованиями, описанными в примерах далее. Потенциальные агонисты PYY можно сравнить по активности с PYY или PYY[3-36].

Альтернативно, после того как охарактеризован и клонирован один или несколько PYY-предпочитающих (Y7) рецепторов, можно выполнить альтернативные анализы и высокопроизводительные скрининги, которые обсуждаются ниже или известны в данной области. Рецепторами Y7 являются рецепторы с аффинностью по отношению к PYY или PYY[3-36] выше, чем их аффинность по отношению к NPY. Способы скрининга соединений, которые модулируют активность рецептора PYY, включают в себя осуществление контакта тестируемых соединений с рецепторами PYY и анализ на наличие комплекса между соединением и рецепторами PYY. В таких анализах тестируемый лиганд обычно метят. После соответствующей инкубации свободный лиганд отделяют от лиганда, присутствующего в связанной форме, и количество свободной или не вошедшей в комплекс метки является мерой способности конкретного соединения связываться с рецепторами PYY. Альтернативно, можно измерить связанный меченый лиганд (например, используя экспрессированные связанные с мембраной рецепторы Y7).

В другом варианте изобретения применяют высокопроизводительный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания по отношению к рецепторам PYY. Например, на твердом субстрате синтезируют большое количество различных небольших пептидных тестируемых соединений. Осуществляют контакт тестируемых пептидных соединений с рецептором PYY и промывают. Затем связанный рецептор PYY регистрируют способами, хорошо известными в данной области. Очищенными тестируемыми соединениями также можно непосредственно покрыть планшеты для использования в вышеуказанных способах скрининга лекарственных средств. Кроме того, если тестируемые соединения являются белками, можно использовать антитела, чтобы захватить белок и иммобилизовать его на твердом носителе любыми способами, известными в данной области.

Другие варианты изобретения включают в себя использование анализов конкурентного скрининга, при котором нейтрализующие антитела, способные специфично связывать полипептид согласно изобретению, конкурируют с тестируемым соединением за связывание с полипептидом. Таким образом, антитела можно использовать для выявления присутствия любого пептида, который имеет один или несколько общих антигенных детерминант с агонистом PYY. Исследования конкурентного связывания с радиоактивным мечением описаны в A.H.Lin et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1997, vol.41, no.10. pp.2127-2131, описание которой включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме.

Для облегчения понимания данного изобретения в описание включены следующие примеры. Конечно, эксперименты, имеющие отношение к данному изобретению, не следует рассматривать, как специально ограничивающие изобретение, и считают, что такие варианты изобретения, известные в настоящее время или разработанные позднее, которые могут быть в компетенции специалиста в данной области, входят в объем изобретения, которое представлено в данном описании и следующей далее формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

В описанных далее экспериментах в различных анализах использовали представителей семейства лигандов PP. Если не оговорено особо, все тестируемые пептидные соединения растворяли в физиологическом растворе до концентрации 1-5 мг/мл без измерения pH. Во всех случаях препараты были прозрачными на глаз перед введением.

Пример 1: Активность лигандов рецептора Y, влияющая на потребление пищи у голодавших в течение ночи мышей NIH/SW

Самок мышей NIH/Swiss (8-12-недельного возраста) содержали в группах в условиях цикла свет:темнота 12:12 с началом светового периода в 06-00. Воду и стандартный гранулированный корм для мышей был свободно доступен, кроме указанных случаев. Животные подвергали голоду и содержали отдельно, начиная примерно с 15-00 час за 1 день до эксперимента. Утром в день эксперимента (примерно в 06-30), всех животных взвешивали и разделяли на экспериментальные группы так, чтобы получить наиболее сходное распределение по массе между группами. В типичном исследовании n=10 для контрольной группы и, по меньшей мере, 5 для каждой группы обработки.

Во временной точке = 0 мин всем животным вводили внутрибрюшинную инъекцию носител