Растение и растительная клетка, трансформированные химерным геном

Растение и растительная клетка, трансформированные химерным геном

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к системе для уничтожения растительных клеток и прежде всего к трансгенным растениям, которые несут в своем геноме химерный ген, при экспрессии которого образуется цитотоксический протеин.

Одним из известных селекционерам растений путей получения новых сортов является создание гибридов существующих сортов, несущих требуемые признаки. Гибриды, как правило, отличаются от любого из родителей улучшенными различными характеристиками, это явление называют гибридной силой (гетерозис). Такие гибридные скрещивания можно осуществлять с помощью перекрестного опыления вручную, что представляет собой утомительную и требующую много времени процедуру.

В процессе осуществления таких гибридных скрещиваний решающее значение имеет предупреждение самоопыления. Для предупреждения самоопыления материнское растение можно эмаскулировать вручную, например, путем удаления метелки при получении гибридной кукурузы. Однако крупномасштабная эмаскуляция видов с гермафродитными цветками невозможна с экономической точки зрения. Можно также получать материнские линии (с мужской стерильностью) с помощью генетической мужской стерильности, этот хорошо известный у многих растений признак, как правило, является рецессивным и моногенным. Связанная с использованием этого подхода проблема состоит в трудности получения для каждого скрещивания чистых родительских линий с мужской стерильностью. Наиболее широко применяемая для создания гибридов система получения мужской стерильности представляет собой систему цитоплазматической мужской стерильности (cms). В этом случае недоразвитие пыльцы обусловлено цитоплазматическими факторами. У тех культурных растений, у которых в зародышевой плазме выявлена cms, например у кукурузы и подсолнечника, этот признак широко используется для создания гибридов. Известно несколько недостатков указанной системы: цитоплазма с мужской стерильностью может нести другие нежелательные характеристики, например Т-цитоплазму у кукурузы и чувствительность к Helminthosporium maydis; при ее применении необходимо поддерживать линии с изогенной мужской фертильностъю; и применение этой системы ограничено видами, у которых доступен цитоплазматический источник стерильности.

Другим преимуществом системы, основанной на использовании мужской стерильности, является то, что с ее помощью можно получать беспыльцевые растения. Это требуется для многих сортов декоративных цветковых растений и также может найти применение для борьбы с нежелательными генетическими признаками путем предупреждения ауткроссинга.

Еще одним ценным признаком основанной на использовании стерильности системы является возможность получать растения с женской стерильностью, у которых при развитии плодов не происходит образования семян. Бессемянные сорта плодов имеют преимущества при обработке, например, томатов, и также являются предпочтительными для потребителя, например, дыни. В настоящее время бессемянные сорта известны и существуют соответствующие программы селекции, но создание бессемянных плодов ограничено отсутствием у многих видов растений пригодной зародышевой плазмы.

В тех случаях, когда генетический источник стерильности отсутствует или недоступен по другим причинам, можно применять метод генетической модификации, который обеспечивает стерильность с помощью системы для уничтожения клеток, при этом некроз происходит в специфических клетках репродуктивных тканей.

В WO 89/10396 описана система для уничтожения растительных клеток, при использовании которой в растение интродуцируют химерный ген, содержащий специфичный для пыльника промотор, связанный с протеином или полипептидом РНКазы, при экспрессии которого происходит нарушение клеточного метаболизма. Таким образом, экспрессия химерного гена приводит к некрозу клеток пыльника и, как следствие, к мужской стерильности растений.

Для создания женской стерильности у растений можно использовать аналогичную систему для уничтожения клеток, мишенью которой является семяпочка растения.

В WO 93/18170 и WO 92/04453 описаны системы для уничтожения растительных клеток, специфические для борьбы с заражением нематодами. Согласно описанным в WO 93/18170 и WO 92/04453 системам в определенные виды растений-хозяев интродуцируют ген, содержащий кодирующую последовательность, причем кодирующая последовательность кодирует продукт, снижающий вредоносное действие нематод. Ген содержит также промоторную область, которая контролирует экспрессию кодирующей последовательности таким образом, что экспрессия происходит при нападении нематод и осуществляется практически специфично в клетках областей, которыми питаются нематоды, или в соседних клетках. Для снижения вредоносного действия нематод продукт либо может оказывать неблагоприятное воздействие на растительные клетки, которые в результате дифференцировки превращаются в клетки областей, которыми питаются нематоды, либо на соседние с ними клетки, либо может оказывать неблагоприятное воздействие непосредственно на нематод.

Имеющие экономическое значение паразитирующие на растениях нематоды включают цистообразующие нематоды, такие как картофельные нематоды (Globodera rostochiensis и G.pallida), соевая нематода (Heterodera glycines), свекловичная нематода (Heterodera schachtii) и зерновая нематода (Heterodera avenae), и галловые нематоды, такие как Meloidogyne spp. Такие паразитирующие на растениях нематоды являются основными патогенами многих культурных растений во всем мире, например овощных, кормовых бобовых культур, томатов, арбузов, винограда, арахиса, табака и хлопчатника.

Наиболее широко распространенные современные средства борьбы с нематодами основаны на применении химических средств защиты растений, агротехнических приемов и устойчивых сортов растений, и их часто используют в интегрированной системе борьбы с паразитирующими на растениях нематодами. Имеется необходимость в совершенствовании системы борьбы с нематодами, поскольку указанные существующие в настоящее время подходы не обеспечивают надежную защиту посевов. Безопасность нематицидов для окружающей среды является проблематичной, и они не всегда обладают достаточно высокой эффективностью. Однако применение системы защиты культурных растений может быть убыточным для фермеров вследствие различных причин. Широкий круг хозяев галловых нематод ограничивает возможность применения экономически значимых культур, которые не являются мишенью для нематод. Эффективные устойчивые сорта часто не являются доступными, а те, которые фермер может применять, иногда при невысокой численности нематод оказываются хуже чувствительных сортов. Кроме того, устойчивость может снижаться при высоких температурах почвы, что характерно для тропической и субтропической зон.

Можно рассматривать и другие пути применения систем для уничтожения растительных клеток. Например, мишенью могут быть определенные части цветка, что обусловливает изменение морфологии цветка. В другом варианте мишенью могут быть боковые корни, шипы или жгучие волоски. Можно достигать отделения (абсцизии) листьев или плодов, когда мишенью является отделительный слой листа или плода. Можно достигать также облегчения сбрасывания семян в случае, когда мишенью является семяножка. При использовании в качестве мишеней других органов, таких как трихомы, которые, как правило, являются железистыми (гландулярными), производство химических субстанций в этих органах можно прекращать или предупреждать. Другим вариантом применения может быть индуциуемое отделение корней, листьев, цветков или плодов в конце вегетационного периода.

Инактивирующие рибосому протеины (RIP) представляют собой группу токсичных растительных протеинов, которые каталитически инактивируют рибосомы эукариотических организмов (Stirpe и Barbieri, 1986). RIP функционируют в качестве N-гликозидаз, осуществляя удаление определенного аденина в консервативной петле большой молекулы рРНК и тем самым предупреждают связывание фактора удлинения 2, блокируя в результате этого синтез клеточного протеина.

Описаны три формы RIP. RIP типа 1, такие как антивирусный протеин фитолакки американской и ингибитор трансляции ячменя, каждый из которых имеет одну полипептидную цепь, величина относительной молекулярной массы (М_r) которой составляет примерно 30000. Все RIP типа 2, такие как рицин, абрин и модекцин, имеют по две полипептидные цепи. Один обладающий RIP-активностью полипептид (А-цепь) связывают с помощью дисульфидного мостика со связывающим галактозу лектином (Б-цепь; Stirpe и др., 1978). Величина M_r каждого RIP типа 2 составляет примерно 60000.

RIP кукурузы, обнаруженные в эндосперме семян кукурузы (Zea mays), относится к RIP типа 3. Этот RIP синтезируется в виде одной полипептидной цепи, которая затем подвергается протеолитическому расщеплению с высвобождением двух активных пептидных доменов. RIP кукурузы содержит два домена, т.е. α-домен и β-домен, в неактивной форме RIP кукурузы (т.е. pro-RIP кукурузы) эти домены разделены центральным пептидным спейсером и фланкированы N- и С-концевыми пептидами. α-Домен локализован вблизи N-конца pro-RIP, а β-домен вблизи С-конца. В процессе прорастания семян pro-RIP кукурузы активируется в результате протеолитического отщепления N- и С-концевых пептидов вместе с центральным пептидным спейсером, и два домена образуют зрелый (активный) RIP кукурузы (патент США 5248606). Расщепление осуществляется эндогенными протеазами.

Настоящее изобретение относится к растению, трансформированному химерным геном, содержащим промотор, где промотор индуцируется в области-мишени и/или в соседней области, и функционально связан с кодирующей последовательностью, которая кодирует инактивирующий рибосому протеин кукурузы или его фрагмент.

В заявке, кроме того, описаны растительная клетка, трансформированная химерным геном, содержащим промотор, этот промотор индуцируется в области-мишени и/или в соседней области и функционально связан с кодирующей последовательностью, которая кодирует инактивирующий рибосому протеин кукурузы или его фрагмент; ДНК, выделенная из химерного гена, содержащего промотор, где промотор индуцируется в области-мишени и/или в соседней области, и функционально связан с кодирующей последовательностью, которая кодирует инактивирующий рибосому протеин кукурузы или его фрагмент, а также функциональный экспрессионный вектор, несущий химерный ген, который содержит промотор, этот промотор индуцируется в области-мишени и/или в соседней области, и функционально связан с кодирующей последовательностью, которая кодирует инактивирующий рибосому протеин кукурузы или его фрагмент.

Кодирующая последовательность инактивирующего рибосому протеина кукурузы по изобретению может включать описанную выше полную последовательность pro-RIP кукурузы, которая содержит N-концевой пептид, α-домен, центральный пептидный спейсер, β-домен и С-концевой пептид.

В другом варианте кодирующая последовательность инактивирующего рибосому протеина кукурузы может включать рекомбинантный "зрелый" RIP, обозначенный в настоящем описании как "RIP-P", который содержит расположенные последовательно α-домен и β-домен, т.е. в котором удалены N- и С-концевые удлинения и центральный пептидный спейсер. В настоящем изобретении продемонстрировано, что образование функционально активной молекулы RIP не зависит от каких-либо конформационных ограничений, связанных с интактной молекулой pro-RIP кукурузы или реакцией расщепления. В патентах США 5248606 и 5646026 продемонстрирована функциональная активность рекомбинантных молекул RIP, лишенных центрального спейсера и концевых пептидов, в бесклеточных трансляционных системах.

В другом варианте кодирующая последовательность инактивирующего рибосому протеина кукурузы предпочтительно может содержать рекомбинантный RIP, включающий только α-домен, или рекомбинантный RIP, включающий только β-домен, при этом и α-домен, и β-домен по отдельности являются фрагментом инактивирующего рибосому протеина кукурузы, который обладает требуемой функциональной активностью. α-Домен инактивирующего рибосому протеина кукурузы представляет собой домен, расположенный вблизи N-конца инактивирующего рибосому протеина кукурузы, а β-домен расположен вблизи С-конца инактивирующего рибосому протеина кукурузы. Если в α- или β-домен включают дополнительные нуклеиновые кислоты, то активный фрагмент, как правило, должен по-прежнему представлять собой только α- или β-домен.

Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что α-домен содержит области распознавания рибосомы и области связывания, а β-домен содержит каталитический сайт, необходимый для депуринизации/расщепления рибосомы. Ранее, до создания настоящего изобретения считалось, что в проявлении активности инактивирующего рибосому протеина кукурузы основная роль принадлежит β-домену. При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что включение только α-домена (т.е. без β-домена) можно применять для нарушения функции рибосом растений и, как следствие, для некроза растительных клеток.

Нуклеотидная последовательность кодирующей последовательности pro-RIP приведена в SEQ. ID. No: 1 или представляет собой гомологичную ей кодирующую последовательность; нуклеотидная последовательность кодирующей последовательности RIP-P приведена в SEQ. ID. No: 2 или представляет собой гомологичную ей кодирующую последовательность; нуклеотидная последовательность кодирующей последовательности α-домена приведена в SEQ. ID. No: 3 или представляет собой гомологичную ей кодирующую последовательность; нуклеотидная последовательность кодирующей последовательности β-домена приведена в SEQ. ID. No: 4 или представляет собой гомологичную ей кодирующую последовательность.

В зависимости от требуемой гомологии нуклеотидных последовательностей можно применять различные условия строгости гибридизации для скрининга аналогичных последовательностей. В качестве примера (но, не ограничиваясь ими) для процесса гибридизации используют следующие строгие условия: гибридизация со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТК при 65°С и отмывка в 0,1xSSC/0,1% ДСН при 68°С (Ausubel F.M. и др. (ред.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, т.I, изд-во Green Publishing Associates, Inc. и John Wiley и Sons, Inc., New York, c. 2.10.3). Другие строгие условия, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Можно применять процессы гибридизации в следующих условиях умеренной строгости: гибридизация со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТК при 65°С и отмывка в 0,2xSSC/0,1% ДСН при 42°С (Ausubel и др., 1989, выше). Другие условия умеренной строгости, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Для процессов гибридизации можно применять другие растворы, такие как стандартный раствор хлорида и цитрата натрия (SSC) или хлорида натрия и фосфата ЭДТК (SSPE).

Приемлемые гомологичные последовательности представляют собой последовательности, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 85% и еще более предпочтительно на 90 или 95% гомологичны каждой из приведенных в настоящем описании последовательностей, причем такие гомологичные последовательности сохраняют требуемую ферментативную активность.

Приемлемые последовательности могут также представлять их варианты. Согласно настоящему изобретению вариант может представлять собой любую замену, вариацию, модификацию, замещение, или делецию, или добавление одной или нескольких нуклеиновых кислот/аминокислот, позволяющую получать последовательность, которая экспрессирует или проявляет требуемую ферментативную активность. Согласно изобретению можно также использовать производное или мутацию. Производное имеет определенные модификации, как правило, химические, по сравнению со встречающимся в естественных условиях полипептидом, экспрессируемым нуклеиновой кислотой.

Химерный ген может дополнительно содержать 3'-нетранслируемую последовательность терминатора. Последовательность терминатора можно получать из генов растений, бактерий или вирусов. Пригодные последовательности терминаторов представляют собой, например, последовательность терминатора rbcS гена Е9 гороха, последовательность терминатора Nos, выведенную из гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, и последовательность терминатора 35S вируса мозаики цветной капусты. Специалисту в данной области известны другие последовательности терминаторов. Химерный ген может также необязательно содержать последовательности энхансеров транскрипции или трансляции, например, описанные в международной заявке на патент, опубликованной под No. WO 97/20056, например последовательности, обеспечивающие направленный перенос внутри клетки, и интроны, а также нуклеотидные последовательности, функцией которых является облегчение процесса трансформации и стабильной экспрессии химерного гена, такие как пограничные области Т-ДНК, области, обеспечивающие присоединение к матриксу, и последовательности эксцизии/рекомбинации.

Описанная в заявке двухкомпонентная система предназначена для уничтожения клеток. Такие двухкомпонентные системы описаны в международных заявках на патент WO 98/32325 и WO 93/18170, в которых применяют два или большее количество трансгенов, при этом совместные действия продуктов их экспрессии приводят к уничтожению клеток. Индивидуальные компоненты по отдельности являются неактивными или безвредными, но обладают цитотоксическим действием при их объединении. Каждый трансген находится под контролем конкретного промотора, промоторы выбирают так, чтобы профили их экспрессии перекрывались в требуемой области-мишени, в которой должна происходить гибель клеток, но не в других тканях. В настоящем изобретении описана двухкомпонентная система, содержащая по отдельности α-домен и β-домен инактивирующего рибосому протеина кукурузы, каждый в виде индивидуальной трансгенной конструкции под контролем конкретного промотора. Примеры приемлемых промоторов приведены ниже, а другие промоторы хорошо известны специалистам в данной области. Такую двухкомпонентную систему можно получать путем скрещивания двух растений, каждое из которых содержит один из компонентов, путем последовательной или одновременной трансформации трансгенов с использованием двух трансгенных конструкций или путем трансформации конструкцией, содержащей оба компонента в одной кассете. Два домена могут происходить из различных инактивирующих рибосому протеинов кукурузы.

Предпочтительно промотор индуцируется специфично или практически специфично в области-мишени и/или в соседней с ней области. Если промотор индуцируется в сайтах, отличных от области-мишени и/или соседней с ней области, то промотор предпочтительно обеспечивает экспрессию главным образом в области-мишени и/или в соседней с ней области.

Согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения область-мишень может представлять собой область, которой питаются нематоды. В случае, когда область-мишень представляет собой область, которой питаются нематоды, в качестве промотора выбирают промотор, который индуцируется в области, которой питаются нематоды, и/или в соседней области. Индукция такого промотора предпочтительно происходит при поражении растения нематодами. Примером приемлемого промотора является промотор KNT1. Метод выделения промотора KNT1 описан в новозеландском патенте 260511, а также дополнительно описан ниже. Другие приемлемые промоторы включают промотор TobRB7 и промоторы Lemmi. Метод выделения промотора TobRB7 описан в международной заявке на патент WO 94/17194, а метод выделения промоторов Lemmi описан в международной заявке на патент WO 92/21757.

Область, которой питаются нематоды, может включать, например, растительные клетки, находящиеся в локальной области поражения, которые впоследствии подвергаются редифференцировке, образуя синцитий (в случае цистообразующих нематод), или гигантские клетки, и/или сопутствующие гипертрофические клетки (в случае галловых нематод), и/или одну или несколько клеток синцития, гигантских клеток и сопутствующих гипертрофических клеток.

При использовании в качестве мишени области, которой питаются нематоды, можно получать устойчивые к нематодам растения. Понятие "устойчивое к нематодам растение" относится к растению, которое при заражении паразитирующими на растении нематодами обладает способностью предупреждать, замедлять или иным образом оказывать отрицательное воздействие на рост и развитие нематод, поражающих растение, предупреждая тем самым достижения экономически значимой численности паразитирующих на растениях нематод в период вегетации культуры. При этом подразумевается, что нематоды могут, например, погибать или жизненный цикл нематод может замедляться, что приводит к удлинению времени, необходимого для достижения половой зрелости и откладки яиц, или женские особи нематод могут иметь уменьшенный размер и вследствие этого пониженную способность к откладке яиц, которая происходит только после достижения женскими особями нематод минимального критического размера.

Настоящее изобретение применимо к следующим видам нематод (но, не ограничиваясь ими): Globodera spp., Heterodera spp. и Meloidogyne spp.

Согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения областью-мишенью может быть один или несколько из таких органов растения, как пыльца, пыльник или тапетум. Если областью-мишенью является, например, тапетум, то выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в тапетуме и/или в соседних с тапетумом областях. Примером приемлемого для тапетума промотора является промотор ТА29 табака, описанный у Mariani и др. (1990). Специфичные для пыльника промоторы описаны у Twell и др. (1991).

Согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения область-мишень может представлять собой семяпочку растения. Это предусматривает, что выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в семяпочке и/или соседней области. Примером приемлемого промотора является промотор AGL15, описанный у Perry и др. (1996).

Согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения области-мишени могут представлять собой определенные части цветка, при этом целью является, чтобы эти определенные части цветка не развивались и морфологическое строение цветка изменялось. В этом случае выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в чашелистике, плодолистике, лепестке и/или тычинке, или в соседних областях. Примерами приемлемых промоторов являются промоторы генов, обусловливающих бесполость (agamous), отсутствие лепестков (apetala3), шарообразность (globosa), пестичность (pistillata) и другие различные дефициты (Sieburth и Meyerowitz, 1997; Samach и др., 1997 и приведенных в этих публикациях ссылках).

Согласно пятому варианту осуществления настоящего изобретения область-мишень может представлять собой отделительный слой листа и/или плода. Выбранный в этом случае промотор представляет собой промотор, который индуцируется в отделительном слое и/или в соседней области.

Согласно шестому варианту осуществления настоящего изобретения мишенью являются трихомы, при этом трихомы, как правило, являются гландулярными. Выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в трихомах и/или соседних областях. Вызывая некроз трихомов растения, можно прекращать или предупреждать производство трихомом химических субстанций.

Согласно седьмому варианту осуществления настоящего изобретения мишенью являются боковые корни, шипы или жгучие волоски.

Согласно восьмому варианту осуществления настоящего изобретения при вирусных инфекциях в пораженных вирусом клетках специфично или практически специфично индуцируются многочисленные гены. Выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в пораженных вирусом клетках и/или в соседней области.

Согласно девятому варианту осуществления настоящего изобретения мишенью являются семена. Известно большое количество генов, которые в процессе развития семян специфично или практически специфично индуцируются в определенных клетках/частях семени.

Согласно десятому варианту осуществления настоящего изобретения выбирают промотор, который индуцируется внешним стимулом и который индуцируется, например, в корнях растения. Такой промотор можно использовать для отделения корня в конце вегетационного периода. Для отделения листьев, цветков или плодов в конце вегетационного периода можно применять промоторы, которые индуцируются, например, в черешках листьев, цветоножках или плодоножках.

Методы трансформации растений хорошо известны в данной области и включают, например, опосредуемую Agrobacterium трансформацию. Как правило, при опосредуемой Agrobacterium трансформации бинарный вектор, несущий представляющую интерес чужеродную ДНК, т.е. химерный ген, переносят из соответствующего штамма Agrobacterium в растение-мишень посредством совместного культивирования Agrobacterium с эксплантатами растения-мишени. Трансформированную ткань растения затем регенерируют на средах для селекции, причем среды для селекции содержат селектируемый маркер и гормоны роста растений.

Пригодные методы трансформации включают, например, непосредственный перенос генов в протопласты с помощью полиэтиленгликоля или электропорации, бомбардировку частицами, микроинъекцию и применение волокон из карбида кремния.

Приемлемые виды растений, которые можно трансформировать согласно настоящему изобретению, включают (но, не ограничиваясь ими) рис, пшеницу, кукурузу, картофель, табак, сахарную свеклу, сою, канолу, томаты, арахис, хлопчатник, виноград, арбуз, папайю, овощные культуры и кормовые бобовые растения.

Для облегчения понимания и осуществления на практике изобретение более подробно рассмотрено ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых показано:

на фиг.1 - воздействие зрелого инактивирующего рибосому протеина кукурузы (RIP-P) на рибосомы табака, оцененное по синтезу протеина GUS;

на фиг.2 - воздействие различных количеств ДНК RIP-P кукурузы (от 0,02 до 20 мкг) на рибосомы табака, оцененное по синтезу протеина GUS;

на фиг.3 - воздействие протеинов RIP-P кукурузы на рибосомы табака, оцененное по синтезу α-амилазы и протеина GUS;

на фиг.4 - воздействие на рибосомы табака α- и β-доменов RIP-P кукурузы по отдельности и совместное воздействие α- и β-доменов, оцененное по синтезу протеина GUS;

на фиг.5 - схематическое изображение несущих промотор KNT1 конструкций pDVM35S и рАТС и конструкций рАТС KNT2/RIP α: KNT/RIP β, применяемых для трансформации растений;

на фиг.6 - взаимосвязь между размерами взрослых нематод на контрольных и трансгенных несущих RIP линиях кукурузы и их кумулятивной частотой;

на фиг.7 - взаимосвязь между размерами яйцекладущих женских особей нематод на тех же контрольных и трансгенных несущих RIP линиях кукурузы, что и на фиг.6, и их кумулятивной частотой;

на фиг.8 - сравнение взаимосвязи между размерами взрослых особей и яйцекладущих женских особей галловых нематод на контрольных и трансгенных линиях кукурузы и их кумулятивной частотой;

на фиг.9 - количество галлов и три категории нематод для каждой трансгенной в отношении устойчивости к нематодам линий. Линии A-G представляют собой потомство трансформантов кукурузы, несущих RIP-P, линии I-Q представляют собой потомство трансформантов кукурузы, несущих двухкомпонентную систему RIPα/RIPβ, а линии Р и Н обозначают нетрансформированные контрольные линии;

на фиг.10 - трансформирующий вектор рАТС, в который встраивают приведенные на фиг.5 конструкции RIP для трансформации растений;

на фиг.11 - клонирующий вектор pDE4;

на фиг.12 - схематическая диаграмма получения с помощью ПЦР вариантов инактивирующего рибосому протеина кукурузы;

на фиг.13 - конструкция, применяемая для получения мужской стерильности;

на фиг.14 - формирование пыльцевой трубки пыльцы у растения дикого типа (слева) с обозначенными стрелками ростовыми трубочками и у трансгенного, трансформированного RIP-P растения (справа) с деформированным пыльцевым зерном, лишенным ростовых трубочек;

на фиг.15 - пыльца растения дикого типа сорта Desiree (слева), для которой установлено поглощение ФДА (флуоресцеиндиацетат) жизнеспособными пыльцевыми зернами, и аналогичное количество пыльцевых зерен трансгенной, трансформированной RIP-P линии растения (справа), только для одной из которых установлено поглощение ФДА. Пыльцевые зерна имеют диаметр 50 мкм.

Примеры

Клонирование и секвенирование инактивирующего рибосому протеина кукурузы

Геномную ДНК экстрагировали из 14-дневных проростков кукурузы сорта Earli King.

Праймеры конструировали на основе нуклеотидной последовательности геномной ДНК RIP кукурузы для получения вариантов последовательностей RIP путем удаления N- и С-концевых областей и центрального спейсера. Также конструировали праймеры для удаления сайта рестрикции SacI в последовательности RIP, облегчая тем самым клонирование. Последовательности RIP амплифицировали с помощью полимеразы Pfu.

С помощью ПЦР геномной ДНК получали последовательность PRORIP (SEQ. ID. No: 1) с помощью следующего метода:

Для удаления сайта рестрикции SacI гена осуществляли две ПЦР с использованием праймеров PRORIPBF (SEQ. ID. No: 5) плюс RIPSDR (SEQ. ID. No: 14) и RIPSDF (SEQ. ID. No: 13) плюс PRORIPSR (SEQ. ID. No: 6) соответственно. ПЦР-продукты очищали на геле и объединяли. После перекрывающегося удлинения с последующей ПЦР-амплификацией с использованием праймеров PRORIPBF (SEQ. ID. No: 5) плюс PRORIPSR (SEQ. ID. No: 6) получали полноразмерную последовательность ProRIP (SEQ. ID. No: 1).

ПЦР ProRIP с использованием праймеров RIP1BF (SEQ. ID. No: 7) RIP2SR(SEQ. ID. No: 8) позволяла получать ПЦР-продукт длиной примерно 800 пар оснований, соответствующий домену RIPα, центральному спейсеру и домену RIPβ. Этот продукт ("RIP-CD") расщепляли с помощью рестриктаз Xbal и SalI, очищали на геле, встраивали путем лигирования в вектор pBluescript, трансформировали клетки Е.coli XL 1-Blue и секвенировали. Последовательность оказалась идентична последовательности эквивалентной области ДНК кукурузы.

Центральную спейсерную область удаляли следующим образом: ДНК RIP-CD амплифицировали с помощью двух ПЦР с использованием праймеров RIP1BF (SEQ. ID. No: 7) плюс RIPCDR (SEQ. ID. No: 12) и RIPCDF (SEQ. ID. No: 11) плюс RIP2SR (SEQ. ID. No: 8). ПЦР-продукты очищали на геле и объединяли. После перекрывающегося удлинения с последующей ПЦР с использованием праймеров RIP1BF (SEQ. ID. No: 7) и RIP2SR (SEQ. ID. No: 8) получали полностью процессированний RIP (RIP-P). RIP-P расщепляли с помощью рестриктаз Xbal и SalI, очищали на геле, встраивали путем лигирования в вектор pBluescript, трансформировали клетки Е.coli XL1-Blue и секвенировали. Последовательность RIP-P представлена в настоящем описании в виде SEQ. ID. No: 2.

Дополнительные ПЦР осуществляли с использованием RIP-P с помощью либо праймеров RIP1BF (SEQ. ID. No: 7) плюс RIP1SR (SEQ. ID. No: 9), либо RIP2BF (SEQ. ID. No: 10) плюс RIP2SR (SEQ. ID. No: 8) для амплификации доменов RIPα или RIPβ соответственно. RIPα и RIPβ расщепляли с помощью рестриктаз XbaI и SalI, очищали на геле, встраивали путем лигирования в вектор pBluescript, трансформировали клетки Е.coli XL1-Blue и секвенировали. Последовательности RIPα и RIPβ представлены в виде SEQ. ID. No: 3 и SEQ. ID. No: 4 соответственно.

Получение конструкций, содержащих инактивирующий рибосому протеин кукурузы, для анализов кратковременной экспрессии в протопласте

Конструкции, содержащие конститутивный промотор вируса 35S мозаики цветной капусты, связанный с кодирующей последовательностью, выведенной из инактивирующего рибосому протеина кукурузы, и последовательностью терминатора Nos, получали в векторе, являющемся производньм pDE4 (Denecke и др., 1990) (см. фиг.11), пригодном для применения в системе кратковременной экспрессии в протопласте. Были созданы следующие конструкции, которые схематично представлены на фиг.5:

1. pDE4 35S/Pro RIP

2. pDE4 35S/RIP P ("зрелый" RIP)

3. pDE4 35S/RIP α

4. pDE4 35S/RIP β

Экспресс-анализ конструкций RIP в протопластах табака

В этом анализе опосредуемую инактивирующим рибосому протеином кукурузы инактивацию рибосом определяли, оценивая синтез протеина GUS. Протопласты получали из листьев выращенных in vitro растений табака и подвергали электропорации с использованием конструкций RIP. Эффективность рибосом в отношении трансляции протеина в протопластах табака оценивали с помощью репортерного гена GUS в конструкции pDE4 под контролем промотора 35S CaMV. Несущую ген GUS конструкцию pDE4 подвергали совместной электропорации с каждой конструкцией RIP. Для получения данных об оптимальных уровнях синтеза протеина GUS в протопластах в условиях конкуренции со вторым протеином использовали GUS-позитивный контроль, для создания которого осуществляли совместную электропорацию протопластов табака с использованием несущей нетоксичный протеин BiP конструкции pDE800 (Leborgna-Castel и др., 1999) и несущей GUS конструкции pDE4. Также применяли GUS-отрицательный контроль, для создания которого осуществляли совместную электропорацию протопластов табака с использованием незагруженного вектора pDE4 и несущей нетоксичный хаперонный протеин BiP конструкции.

(I) Зрелый RIP-P кукурузы.

Протопласты табака трансформировали путем совместной электропорации конструкциями RIP-P кукурузы и конструкцией, несущей GUS. Воздействие активности RIP кукурузы на рибосомы оценивали по уровням активности GUS после экспрессии в течение 24 ч (фиг.1). Результаты свидетельствовали о том, что протеин RIP-P эффективно инактивирует рибосомы табака. Воздействие разных доз конструкций оценивали путем электропорации различных количеств (от 0,02 до 20 мкг) конструкции, несущей RIP-P кукурузы (фиг.2).

Результаты свидетельствовали о том, что зрелый протеин RIP-P кукурузы эффективно инактивировал рибосомы табака. Поэтому при сравнении с GUS-положительным контролем были обнаружены лишь фоновые уровни GUS.

Эффективность инактивации рибосом зависела от количества ДНК, применяемой для электропорации протопласта. Более высокие количества ДНК RIP (20 мкг) быстро индуцировали инактивацию рибосом и при этом были обнаружены лишь фоновые уровни GUS. Более низкие количества применяемой ДНК (0,02 мкг) приводили к более высокой остаточной активности GUS, вероятно из-за более длительного времени, необходимого для достижения критических концентраций протеина RIP и полной инактивации рибосом.

(II) Активность RIP-P кукурузы на различные рибосомы клетки:

Был проведен эксперимент для оценки того, обладает ли RIP-P кукурузы способностью осуществлять депуринизацию как рибосом эндоплазматического ретикулума (ЭР), так и рибосом цитозоля. В качестве примера протеина, синтез которого происходит в ЭР, использовали α-амилазу, т.е. протеин, который несет N-концевую сигнальную последовательность и секретируется в ЭР. Протопласты подвергали совместной электропорации конструкцией, несущей α-амилазу, и конструкцией, несущей RIP-P, для сравнения использовали несущую GUS конструкцию. После экспрессии в течение 24 ч осуществляли анализ амилазы (фиг.3).

Результаты свидетельствовали об отсутствии заметного различия между воздействием RIP-P на активность α-амилазы и GUS. Зрелый RIP-P кукурузы инактивировал все рибосомы, независимо от их клеточной локализации. Результаты этих анализов, проведенные с использованием RIP-P кукурузы, свидетельствовали о том, что фермент обладает высокой эффективностью в отношении индукции полной инактивации рибосом и последующего истощения клеток или гибели клеток.

(III) Функции различных доменов RIP-P кукурузы

Кроме того, в протопластах табака индивидуально или в сочетании экспрессировали полипептидные области RIPα и RIPβ кукурузы (фиг.4). Неожиданно было установлено, что экспрессия только протеина RIPα приводила к заметному снижению активности GUS. В противоположность этому экспрессия только протеина RIPβ не влияла на активность. С учетом предположений, основанных на структурных особенностях, RIPα содержит мотив распознавания РНК и области домена связывания рибосомы, но не содержит имеющий решающее значение остаток каталитического сайта. Протеин RIPα может предупреждать трансляцию протеинов путем связывания с рибосомами и прекращения трансляции протеи