Антитело к фактору hldf, способ его получения (варианты), пептид с антигенными и нк-гидролизующими свойствами и способ диагностики анапластического состояния клетки человека

Антитело к фактору hldf, способ его получения (варианты), пептид с антигенными и нк-гидролизующими свойствами и способ диагностики анапластического состояния клетки человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биохимии, к получению биологически активных веществ, способам их получения, а именно - к получению веществ, обладающих антигенными и иммуноспецифичными свойствами, и к медицине, а именно к способам диагностики анапластического состояния клетки человека, в частности, при онкологических заболеваниях.

Проблема создания эффективных способов диагностики онкологических заболеваний человека, особенно на ранних стадиях болезни, является весьма актуальной.

Статистика онкологических заболеваний показывает, что при раннем диагностировании процессов перерождения здоровой клетки в анапластическую возможно наиболее эффективное лечение рака человека как терапевтическими, известными специалистам, работающим в этой области, методами, так и хирургическим путем. Для диагностирования стадии онкологического заболевания весьма важно проводить исследования клеток человека с применением чувствительных тестов, улавливающих даже самые ранние незначительные предраковые изменения в структуре клетки, способные привести в дальнейшем к развитию интенсивной пролиферативной активности этих клеток, то есть к развитию онкологического заболевания.

Известные в настоящее время способы диагностики онкологических заболеваний основаны на применении иммуногистохимической реакции структур клетки при воздействии на клетку внешними биологическими маркерами, вызывающими, например, появление в клетке новых структур, например антигенов.

Известные в настоящее время современные способы диагностики опухолей основаны на проведении иммуногистохимической реакции с целью выявления определенных для данного вида опухоли антигенов. При раке предстательной железы проводят реакцию для изучения в клетках ткани опухоли экспрессии простат специфического антигена (PSA) р53, bcl-2, p27kipl, AR и MIB-1. (Bai XZ., Masters J.R., O'Donoghue N. et al. Prognostic markers in clinically localized prostate cancer. Int.. J.Oncol (Greece) 1999, v.14, N 4, p.785-791).

Известен способ иммуногистохимической диагностики анапластического состояния клетки человека, включающий следующие стадии:

- получение исследуемого образца ткани человека в виде постоперационного материала или кусочка ткани после пункционной биопсии,

- подготовка срезов ткани для иммуногистохимического анализа,

- иммуногистохимический анализ срезов ткани, обработка среза ткани биологическими маркерами, вызывающими образование окрашенных преципитатов в структурах клеток среза,

- визуальная оценка результатов проведенного анализа по характеру расположения и концентрации окрашенных преципитатов для выявления участков ткани с анапластическим состоянием клеток (Bhargava V., Kell D.L., van de Rijn M., Wamke R.A. Bcl-2 Immunoreactivity in Breast Carcinoma Correlates with Hormone Receptor Positivity. American Journal of Pathology 1994, v.145, N3, p.р.535-540).

При этом в качестве маркеров используются растворы, содержащие антитела к определенным антигенам, экспрессирующимся в структурах клетки. Известен метод имуногистохимического анализа среза ткани предстательной железы человека и способ диагностики на его основе. (Myers R.B., Grizzle W.E Changes in biomarker expression in the development of prostatic adenocarcinoma. Biotech. Histochem. 199T, v.72, N2, p.86-95).

В качестве биологических маркеров применяют растворы, выявляющие факторы, препятствующие развитию апоптоза в клетках человека, например антисыворотки мышиных моноклональных антител к белковым соединениям группы Bcl-2 (DAK.O Corporation, USA) (далее Bcl-2), обладающие свойством визуализировать появление окрашенных преципитатов - антигенов в цитоплазме эпителиальных клеток желез. Этот метод является достаточно эффективным для диагностирования высоко-, умеренно- и низкодифференцированных аденокарцином (high-, moderate - and low-) в предстательной железе.

В настоящее время в качестве иммуногистохимических маркеров наибольшее распространение получили иммунные растворы к факторам р53 и bcl-2. Однако использование данных маркеров имеет и отдельные ограничения; так, с помощью этих маркеров наиболее хорошо выявляются только выраженные виды опухолей (advanced stage prostatic adenocarcinomas).

При изучении экспрессии антигена bcl-2 в нормальной ткани предстательной железы человека либо при доброкачественной аденоме иммуногистохимическими методами положительная реакция обнаруживается, как правило, в базальном клеточном слое протоков и ацинусов и не обнаруживается в клетках, выстилающих железу. Данный маркер позволяет выявить предопухолевые процессы - простатические интраэпителиальные неоплазии низких и высоких градаций, при этом иммунореактивность отмечается как в клетках базального слоя, так и в железистом эпителии. Ограничением в широком использовании данного метода является то обстоятельство, что специфическое окрашивание в простатической интраэпителиальной неоплазии удается выявить только в 22% случаев, в то время как в 78% случаев наблюдается иммуногистохимическое окрашивание, характерное для процесса, не связанного с образованием опухоли, либо характерного для доброкачественной опухоли - аденомы.

Маркер р53 также не предназначен для выявления предопухолевых процессов, а служит в качестве прогностического фактора при различных формах терапии аденокарцином.

В связи с этим необходим поиск новых, более универсальных опухолевых и предопухолевых биологических маркеров, выявляющих начальные этапы анапластических процессов в тканях.

Специалистам, работающим в области биоорганической химии и микробиологии, известны способы получения антител как моноклональных, так и поликлональных, например, с использованием культивируемых клеток миелом, гибридом.

Известны способы получения антител путем выделения их из крови животных, иммунизированных раствором или суспензией, содержащих антиген, инициирующий появление в плазме крови специфических к нему антител.

Способы включают этапы получения антигена, иммунизации животного, получения сыворотки крови иммунизированного животного, выделения антител из сыворотки крови.

Такие способы получения антител осуществляются, в основном, с применением стандартных методов иммунизации, известных специалистам в этой области, с применением стандартных методов контроля и очистки сывороток. Различия связаны с различием веществ, применяемых в способах в качестве антигенов.

В настоящем изобретении была поставлена задача разработки новых более чувствительных биологических маркеров и способов их получения и нового способа диагностики анапластического состояния клетки человека на основе использования новых биологических маркеров, обладающих более направленным и более дифференцированным воздействием на структуры клетки человека, а в частности - на структуры, содержащие человеческий лейкоцитарный фактор дифференцировки, содержание и локализация которого в клетке зависит от степени ее дифференцированности.

Фактор дифференцировки HLDF (SEQ ID N0:1) первоначально был выделен из культурной среды клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека, обработанных ретиноевой кислотой (I.A.Kostanyan, M.V. Astapova, E.V. Starovoytova, S.M. Dranitsyna, V.M. Lipkin - A new human leukemia cell 8.2 kDa differentiation factor: isolation and primary structure. (1994) FEBS Lett., v.356, n.2-3, p.p.327-329).

Показано, что фактор HLDF вызывает дифференцировку исходной клеточной линии по гранулоцитарному пути и останавливает пролиферацию клеток. В ходе исследования было определено, что по мере развития процессов дифференцировки и апоптоза в клетках наблюдается значительное увеличение уровня содержания фактора HLDF, преимущественно в примембранной периферийной области.

Фактор HLDF представляет собой гликозилированный белок, состоящий из 54 аминокислотных остатков (см. прилагаемый к данной заявке Перечень последовательностей), который обладает ярко выраженными свойствами неспецифической нуклеазы. В процессе исследования был идентифицирован 8-членный фрагмент фактора (аминокислотные остатки 31-38), способный гидролизовать нуклеиновые кислоты. Этот участок фактора является высокоиммуногенным.

Поставленная задача была решена созданием нового антитела, обладающего иммуноспецифичностью к человеческому лейкоцитарному фактору дифференцировки (далее - HLDF) или фрагменту HLDF(31-38), характеризующегося следующими признаками:

- физико-химические свойства антитела соответствуют физико-химическим свойствам антител к иммуноглобулинам класса G (далее - IgG):

а) специфичность взаимодействия антител с белком А, подтверждена методом аффинной хроматографии;

б) величина электрофоретической подвижности антител в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, подтверждена данными электрофореграммы;

в) специфичность взаимодействия антител со вторичным антителами к иммуноглобулинам класса G подтверждена данными исследования антител методом иммуноферментного анализа (ELISA);

- специфичность взаимодействия с фактором HLDF, определенная методом иммуноферментного анализа (ELISA) и методом иммунопереноса с использованием фактора HLDF и его фрагмента;

- способность при взаимодействии с фактором HLDF или фрагментом HLDF(31-38) вызывать окрашивание клеточных структур-преципитатов.

При этом антитело, согласно изобретению, является поликлональным.

Поставленная задача также решена получением нового пептида, обладающего антигенными и НК-гидролизирующими свойствами, являющегося фрагментом фактора HLDF(31-38) (SEQ Ш N0:2), методом твердофазного пептидного синтеза путем последовательного наращивания пептидной цепи и имеющего следующие характеристики:

- структурная формула

Arg-Arg-Trp-His-Arg-Leu-Lys-Glu;

- молекулярная масса 1180±2 Да, определенная с помощью MALDI-спектрометрии;

- аминокислотный состав, определенный с помощью аминокислотного анализа и подтвержденный путем определения N-концевой аминокислотной последовательности на твердофазном секвенаторе Applicol Diosistem 470A, со следующим соотношением аминокислотных остатков в одной молекуле пептида:

Аргинин (Arg) - 3, Триптофан (Тгр) - 1, Гистидин (His) - 1, Лейцин (Leu) - 1, Глутаминовая кислота (Glu) -1, Лизин (Lys) - 1;

- изоэлектрическая точка 11,82, определенная в растворе рН 7,0;

- рН-стабильность в интервале рН от 2 до 9;

- термостабильность в сухом состоянии в интервале температур от 0 до 56°С, термостабильность в водном растворе в интервале температур от 0 до 37°С в течение 24 ч.;

- гомогенность 99,2%, определенная с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- растворимость в воде, физиологическом растворе и в буферных растворах рН от 2 до 11;

- цитотоксичность, определена по способности пептида вызывать апоптотическую гибель клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60.

Поставленная задача также решена разработкой способов получения указанных антител из плазмы крови кролика, включающих этапы получения антигена, иммунизации кролика антигеном, получения сыворотки крови иммунизированного животного и выделения антител из сыворотки крови, отличающихся тем, что при этом в одном способе согласно изобретению иммунизацию кролика проводят путем трехкратного инъецирования дозой антигена около 0,07 мг/кг веса, а в качестве антигена используют синтетический фактор HLDF, а в другом способе согласно изобретению иммунизацию кролика проводят путем трехкратного инъецирования в первый раз дозой антигена около 0,150 мг/кг веса, во второй и третий раз - дозой антигена около 0,035 мг/кг, а в качестве антигена используют конъюгат нового пептида согласно изобретению.

Поставленная задача также решена разработкой нового способа диагностики анапластического состояния клетки человека, включающего следующие стадии:

- получение исследуемого образца ткани человека, фиксация его состояния, дегидратация и обработка образца ткани для получения среза в парафине,

- подготовка парафинового среза ткани для иммуногистохимического анализа,

- иммуногистохимический анализ среза ткани, обработка среза биологическими маркерами, вызывающими образование в структурах клеток среза окрашенных преципитатов,

- визуальная оценка результатов проведенного анализа по характеру расположения и концентрации окрашенных преципитатов для выявления участков ткани с анапластическим состоянием клеток, отличающегося тем, что в качестве биологических маркеров используют раствор антител согласно изобретению в PBS концентрацией 0,0013 мг/мл.

В дальнейшем изобретение поясняется описанием конкретных, не ограничивающих настоящее изобретение, примеров осуществления изобретения и прилагаемыми чертежами, на которых:

Фиг.1 - хроматограмма сыворотки крови иммунизированных кроликов на Protein-A-Sepharose.

Фиг.2 - электрофореграмма распределения молекулярных масс антител согласно изобретению, полученная по методу Laemmly в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфита натрия (SDS-ПААГ).

Фиг.3 - электрофореграммы 3а, 3b, 3с, иллюстрирующие НК-гидролизующую активность пептида согласно изобретению.

Фиг.4 - электрофореграммы 4а, 4b, иллюстрирующие исследование специфичности взаимодействия антител согласно изобретению с фактором дифференцировки HLDF с помощью метода иммунопереноса.

Фиг.5 - изображение среза ткани нормальной предстательной железы, полученное способом диагностики с использованием раствора антител к белкам группы Bcl-2.

Фиг.6 - изображение среза ткани нормальной предстательной железы, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.7 - изображение среза ткани простаты с диагнозом доброкачественной гиперплазии предстательной железы, полученное способом диагностики с использованием раствора антител к белкам группы Bcl-2.

Фиг.8 - изображение среза ткани доброкачественной гиперплазии предстательной железы, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.9 - изображение среза ткани простаты с диагнозом предракового заболевания (простатическая интраэпителиальная неоплазия (PIN) низкой степени), полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.10 - изображение среза ткани простаты с диагнозом простатической интраэпителиальной неоплазии (PIN) высокой степени, полученное способом диагностики с использованием раствора антител к белкам группы Bcl-2.

Фиг.11 - изображение среза ткани с диагнозом простатической интраэпителиальной неоплазии (PIN) низкой степени, полученное способом диагностики с использованием раствора антител к белкам группы Bcl-2.

Фиг.12 - изображение среза той же ткани простаты с диагнозом PIN высокой степени, что и на Фиг.10, но полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.13 - изображение среза ткани эндометрия человека с диагнозом простой гиперплазии, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.14 - изображение среза ткани эндометрия человека с диагнозом аденоматозной гиперплазии эндометрия, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.15 - изображение среза ткани простаты с диагнозом дифференцированной аденокарциномы, полученное способом диагностики с использованием раствора антител к белкам группы Bcl-2.

Фиг.16 - изображение среза ткани простаты с диагнозом дифференцированной аденокарциномы, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.17 - изображение среза ткани простаты с диагнозом низкодифференцированной аденокарциномы при обработке на андрогеновые рецепторы (левая часть рисунка), в правой части - умеренно-дифференцированная аденокарцинома с распределением рецепторов к андрогенам в отдельных ядрах анаплазированных клеток.

Фиг.18 - изображение среза ткани простаты с диагнозом низкодифференцированной аденокарциномы, полученное способом диагностики с использованием раствора антител к белкам группы Bcl-2.

Фиг.19 - изображение среза ткани простаты с диагнозом низкодифференцированной аденокарциномы, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.20 - изображение среза ткани железистого эпителия толстого кишечника с диагнозом дифференцированной аденокарциномы, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Фиг.21 - изображение среза ткани гладкомышечных клеток матки с диагнозом лейомиосаркомы, полученное способом диагностики согласно изобретению.

Изобретение может быть осуществлено описанными далее способами.

Получение пептида согласно изобретению, имеющего структурную формулу Arg-Arg-Trp-His-Arg-Leu-Glu-Lys, может быть осуществлено любыми, известными специалистам, работающим в этой области, методами, например методом твердофазного пептидного синтеза с использованием трет-бутилоксикарбонильной схемы по методологии BOC/Bzl (Peptide Synthesis, 2nd edn., Pierce Chem.Co., Rickford IL), (Rodionov I.L., Baru M.B. and Ivanov V.T. A Swellographic approach to monitoring continuous flow solid phase peptide synthesis, Peptide Res.,1992, v.5. No.2, p.p.119-125).

Синтез проводят в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе. В качестве носителя используют сополимер полистирола и дивинилбензола с 4-гидроксилметилацетамидо-метильной (РАМ) якорной группировкой BOC-ARG(Tos)-РАМ RESIN (100-200 mesh, 0,47 ммол/г. Advanced Chem. Tech., USA Cat. No.SR 5605) в количестве 250 мкмоль.

Для временной защиты α-аминогрупп аминокислот используют блокирующую трет-бутилоксикарбонильную (ВОС) группировку. Для проведения реакции конденсации используют четырехкратные избытки реагентов: пентафторфенилового эфира ВОС-аминокислоты и гидроксибензтриазола.

В качестве исходных продуктов используют аминокислоты Аргинин, Триптофан, Гистидин, Лейцин, Глутаминовую кислоту. Лизин в твердом состоянии, имеющиеся в виде препаратов в свободной продаже, например, препаратов фирмы Reanal, в количестве 0,564 г каждой аминокислоты на каждый цикл синтеза.

Концевую карбоксильную группу С-концевой аминокислоты синтезируемого пептида ковалентно связывают с носителем.

Ступенчатое наращивание пептидной цепи с N-конца проводят, последовательно отщепляя с α-аминогруппы блокирующую группировку и связывая с ней карбоксигруппу последующей аминокислоты. Полноту протекания реакций контролируют с помощью качественного и количественного нингидринового теста, с использованием свеллографического мониторинга (Kaiser E., Colescott R.L., Bossinger C.D., Cook P.I., 1970, Anal. Biochem., 34, p.p.595-598).

Полученный пептидил-полимер отщепляют от носителя с одновременным удалением блокирующих групп действием жидкого фтористого водорода (19 мл на 700-1000 мг пептидил-полимера) в присутствии мета-крезола (1 мл) и цистеина (500 мг) при температуре от минус 10°С до 0 в течение двух часов.

Пептид очищают хроматографически методом гель-фильтрации на колонке со смолой Sephadex G-15 (26×500 мм) в 1-N-уксусной кислоте. Структуру пептида затем анализируют по аминокислотному составу известными специалистам, работающим в области пептидов, методами аминокислотного анализа и MALDI-спектрометрии.

Пептид очищают до гомогенности (99,2%) методом обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке NUCLEOSIL С18 на приборе ALTEX, USA, или другими известньми специалистам, работающим в этой области, методами хроматографии.

Выход конечного продукта составляет около 56% сухого вещества по отношению к суммарному количеству исходных аминокислот.

Затем пептид подвергают анализу на определение физико-химических свойств.

Таким образом, получен пептид, имеющий структурную формулу

Arg-Arg-Trp-His-Arg-Leu-Lys-Glu,

и следующие свойства:

- молекулярная масса -1180±Да;

- аминокислотный состав со следующим соотношением аминокислотных остатков в одной молекуле пептида:

Arg-3, Тгр-1, His-1, Leu-1, Glu-1, Lys-1;

- изоэлектрическая точка 11,82;

- растворимость в воде, физиологическом растворе и в буферном растворах рН от 2 до 11;

- рН-стабильность в интервале рН от 2 до 9;

- термостабильность в сухом состоянии в интервале температур от 0 до 56°С, термостабильность в водном растворе в интервале температур от 0 до 37°С в течение 24 часов;

- гомогенность 99,2%.

Анализ полученного пептида на иммуногенность, проведенный методом иммунизации кроликов конъюгатом пептида с овальбумином куриного яйца или гемоцианином улитки (KLH) показал, что пептид обладает высокой иммуногенностью, инициируя появление в сыворотке крови кроликов антител. Титр антител в полученной сыворотке составлял 1:1000.

Полученный пептид был подвергнут исследованию для определения его НК-гидролизующей активности.

С этой целью пептид в концентрации равной и более 10^-6 М инкубировали с нуклеиновыми кислотами в слабо кислой среде в 0,05 М-ном Na-ацетатном буфере, рН 4,5, в течение 1 часа при температуре 37°С. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле в 0,04 М-ном трис-ацетатном буфере, рН 8,0, с 0,002 М ЕДТА с последующим окрашиванием раствором этидиум бромида.

Результаты исследования представлены на электрофореграммах Фиг.3a, 3b, 3с, где Фиг.3а иллюстрирует гидролизующую активность пептида в отношении ДНК плазмиды рSр65, Фиг.3b - в отношении ДНК фага λ, Фиг.3с - в отношении рибосомной РНК, при этом на дорожках 2 (Фиг.3а, 3b, 3с) представлены формы нуклеиновых кислот, проинкубированных в тех же условиях, но без пептида, на дорожках 3 (Фиг.3а, 3b, 3с) - нуклеиновые кислоты до инкубирования, в исходном состоянии.

На электрофореграммах видно, что исходная нуклеиновая кислота деградирует под действием пептида (дорожки 1 на Фиг.3а, 3b, 3с).

Результаты показали, что пептид при концентрациях 10^-6 М и более способен гидролизовать молекулы плазмидной ДНК, ДНК фага λ, и РНК в кислых условиях (рН 4,5 и менее), что является косвенным доказательством участия в процессах апоптоза фактора дифференцировки HLDF, частью которого и является пептид.

Цитотоксичность пептида исследовали по его способности вызывать апоптотическую гибель клеток HL-60 путем воздействия раствором пептида в PBS с концентрацией пептида в PBS 10^-6 М, 10^-7 М, 10^-8 М, на клетки HL-60 после инкубации их в течение 4 часов при температуре 37°С.

В качестве контроля использовали клетки HL-60, обработанные раствором PBS. Для сравнения приведены результаты, полученные при воздействии на клетки HL-60 известного индуктора апоптоза - актиномицина D в таком же растворе PBS.

Цитотоксичность пептида оценивали по апоптотической гибели клеток HL-60 по сравнению с контролем, рассчитанной по формуле

где N_A - доля клеток, погибших от апоптоза,

к_{A exp} - количество апоптотических клеток в культуре HL-60, подвергнутой воздействию пептида или актиномицина D,

к_{A const} - количество апоптотических клеток в контрольном опыте.

Результаты анализа представлены в таблице.

Цитотоксичность пептида при воздействии на клетки HL-60
NA, %
Воздействие пептида в концентрации	Воздействие актиномицина D
10-6 M	10-7 М	10-8 M	10-6 М
385±10	395±3	239±5	280±5

Из данных таблицы ясно, что пептид при концентрациях 10^-6 М и 10^-7 М проявляет более сильное цитотоксическое действие, чем известный индуктор апоптоза актиномицин D в концентрации 10^-6.

Полученные результаты исследования цитотоксической и НК-гидролизующей активности пептида позволили предположить участие фактора дифференцировки HLDF в процессах апоптоза в качестве нуклеазы.

Из вышеизложенного каждому специалисту, сведущему в этой области, ясно, что полученный пептид обладает фармацевтической чистотой, не нуждается в дальнейшей очистке, может быть получен в виде твердого вещества, может быть использован в виде растворов в случаях его применения в научных исследованиях или в способах и технологических процессах, использующих его антигенные свойства, а также его НК-гидролизирующие свойства.

Получение антител к человеческому лейкоцитарному фактору HLDF и/или к фрагменту HLDF(31-38) может быть осуществлено способами, известными специалистам, работающим в этой области, с применением на различных этапах стандартных методов.

Получение указанных антител, согласно изобретению, из плазмы крови иммунизированного кролика и включает следующие этапы: получение антигена, иммунизация кролика, получение сыворотки крови иммунизированного животного, выделение антител из сыворотки крови.

Этап получения антигена может состоять из различных операций, например синтеза необходимого антигена, или его приобретения, подготовки растворов антигена для последующих инъекций, выполняемых стандартными, известньми специалистам в этой области, методами.

Иммунизацию кролика породы Шиншилл весом около 2,5 кг производят по стандартной методике инъецированием определенной дозой антигена подкожно инъекциями в 5-6 точках вдоль позвоночного столба объемом 1/5-1/6 объема раствора, содержащего антиген.

При этом антиген вводят в виде эмульгированного в адьюванте Фрейнда раствора антигена в PBS стандартной концентрации и состава в объеме 1 мл, причем для первого инъецирования используют полный адьювант Фрейнда, в последующих инъецированиях - неполный адьювант.

Забор крови осуществляют из краевой ушной вены кролика в объеме до 50 мл одноразово. Для образования сгустка и получения сыворотки кровь инкубируют в течение 30 мин при 37°С, затем в течение 12 часов при 4°С, а затем производят центрифугирование в течение 10 мин при температуре 4°С со скоростью 10 000 об/мин.

Полученную сыворотку крови разбавляют в 4 раза буфером, рН 8, содержащим TRIS-HCl, до концентрации 0,1М и наносят на колонку с Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), уравновешенную этим же буфером. Элюцию антител с сорбента осуществляют буфером, рН3, содержащим 0,1М Gly-HCl. Элюат титруют раствором 1М TRIS до нейтрального значения рН.

Затем производят очистку антител от антигена на K.LH- Sepharose, синтезированной по стандартной методике с использованием BrCN-activated Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция). Антитела, не связавшиеся с иммобилизированным K.LH, концентрируют с помощью повторной хромотаграфии на Protein A- Sepharose.

В соответствии с одним способом согласно изобретению для получения антител в качестве антигена используют фактор дифференцировки клеток HLDF, который синтезируют с помощью метода твердофазного синтеза или выделяют из культуральной среды клеток HL-60, обработанных транс-ретиноевой кислотой, по известному методу (FEBS Letter, 1994, Vol. No. 12) или с помощью метода твердофазного пептидного синтеза из имеющихся в продаже аминокислот, например, фирмы Reanal.

Согласно настоящему изобретению в этом способе получения антител иммунизацию кролика антигеном - фактором HLDF производят путем трехкратного инъецирования дозой антигена около 0,070 мг/кг веса, затем осуществляют забор крови, получают вышеописанными способами сыворотку крови и выделяют антитела.

Концентрация антител в полученном 50%-ном водном растворе глицерина составляет 1,5 мг/мл, рабочий титр антител 1:1000.

В другом способе согласно изобретению для иммунизации кролика в качестве антигена используют конъюгат фрагмента фактора HLDF(31-38)-пептида согласно изобретению, полученный описанным ранее способом пептидного твердофазного синтеза.

Для применения в указанном способе были синтезированы два типа конъюгатов указанного пептида с различными высокомолекулярными носителями: гемоцианином улитки (KLH) и овальбумином из куриного яйца.

Синтез конъюгатов проводился по стандартной методике, известной специалистам в этой области. Синтез был осуществлен с помощью водорастворимого 1-этил-3-(3-диметиламинопропанол)-карбодиимида-гидрохлорида (EDAC, Bio-Rad, USA) путем образования ковалентной пептидной связи между карбоксильной группой гаптена и аминогруппами носителя по следующей методике.

Раствор 4 мг EDAC в 100 мкл воды добавляют по каплям к раствору 2 мг указанного пептида в воде при температуре 4°С при перемешивании. Затем в реакционную смесь по каплям вводят раствор 6 мг KLH в 200 мкл раствора TBS стандартного состава 0,15 М NaCl, 0,05 М Tris-HCl и рН 7,5-8. Реакционную смесь инкубируют 4 часа при комнатной температуре при перемешивании.

Продукты реакции затем диализуют против раствора TBS. Готовый к употреблению конъюгат пептида хранится при минус 20°С в замороженном состоянии.

Иммунизацию кролика конъюгатом указанного пептида производят путем трехкратного инъецирования: первый раз дозой антитела около 0,150 мг/кг веса, второй и третий раз дозой антитела около 0,035 мг/кг веса.

Затем ранее описанными методами получают сыворотку крови иммунизированного животного и выделяют антитела.

Концентрация антител в полученном 50%-ном водном растворе глицерина составляет 1,3 мг/мл, рабочий титр антител 1:1000.

Полученные указанными двумя способами согласно изобретению антитела исследуют для определения их физико-химических свойств и выявления их специфичности, например, методами аффинной хроматографии, электрофореза в ПААГ-SDS, методами иммуноферментного анализа (ELISA), методом иммунопереноса.

Результаты исследований показали следующее.

Получены антитела, физико-химические свойства которых соответствуют физико-химическим свойствам антител класса IgG:

а) специфичность взаимодействия антител с белком А подтверждена результатами аффинной хроматографии, (Фиг.1) на которой видно, что фракции антител элюируются с колонки с Proteain A-Sepharose только в буфере В, содержащем 0,1М Gly-HCl, pH 3,0;

б) уровень электрофоретической подвижности в 12%-ном ПААГ-SDS подтвержден данными электрофореграммы, приведенной на фиг.26, где полосы колонок "а" и "d" соответствуют стандартным молекулярным массам белковых маркеров 97,4; 66,2; 55,0; 42,7; 40,0; 31,0; 21,5; 14,4 КДа, а белковые полосы колонок "b" и "с" - молекулярным массам антител согласно изобретению: колонка "с" - полученных первым способом, согласно изобретению, с использованием фактора HLDF в качестве антигена, колонка "b" - полученных вторым способом согласно изобретению, с использованием фрагмента фактора HLDF(31-38) - пептида согласно изобретению в качестве антигена;

в) специфичность взаимодействия со вторичными козьими антителами к иммуноглобулинам класса G подтверждена данными иммуноферментного анализа (ELISA).

Специфичность взаимодействия полученных антител с фактором HLDF определена методом ELISA и методом иммунопереноса

Результаты исследования антител с помощью метода иммунопереноса представлены на Фиг.4 (а, b). Фиг.4а представляет собой электрофореграмму синтетического фактора дифференцировки. Фиг.4b представляет собой изображение нитроцеллюлоидной мембраны, на которую с ПААГ перенесены белки, представленные на Фиг.4а и обработанные раствором антител согласно изобретению в разведении 1:1000 по стандартной методике иммунопереноса. (Harlow E., Lane D. Antibodies (A Laboratory Manual). Cold Spring Harbor; N.-Y.: Cold Spring Harbor Press, 1988).

Получено отчетливое изображение преципитата только с белком HLDF, что свидетельствует о высокой специфичности полученных антител. Способность при взаимодействии с фактором HLDF или фрагментом HLDF(31-38) вызывать образование окрашенных преципитатов в клетках человека подтверждается данными использования антител в качестве биологических маркеров в способе диагностики анапластического состояния клетки человека, согласно изобретению.

Способ диагностики анапластического состояния клетки человека согласно изобретению включает следующие стадии:

а) получение исследуемого образца ткани человека, например, стандартными методами из постоперационного гистологического материала или пункционного биопсийного материала (Ekman H., Hedberg К., Persson P. Cytological versus histological examination of needle biopsy speciments in the diagnosis of prostate cancer. Br. J.Urol. 1967, v.39, p.544) и подготовка его стандартным методом для последующего исследования, например, заключающаяся в том, что образцы ткани, размерами не превышающие 0,5×0,5×0,2 см, фиксируют в нейтральном 10%-ном растворе формалина на дистиллированной воде в течение 24 часов, затем проводят их дегидратацию в этиловом спирте последовательно в растворах 70%, 80%, 90%-ной концентрации и затем - трижды в растворе 100%-ного спирта с выдержкой в каждом растворе по 4 часа при комнатной температуре. Затем образцы выдерживают в 3-х сменах ксилола, по 4 часа в каждой, погружают в 2 смены жидкого парафина с температурой 60°С на 12 часов. После этого образцы ткани помещают в блоки и заливают парафином, и из блока нарезают при комнатной температуре срезы толщиной 5 мкм;

б) подготовка парафинового среза для иммуногистохимического анализа, например, стандартным методом (BonhoffH. Neuroendocrine cells in benign and malignant prostate tissue. Morphogenesis, proliferation and androgen receptor status. Prostate Supplement, 1998, v.8, p.p.18-22), заключающимся в том, что парафиновые срезы помещают на стекла, покрытые поли-L-лизином (препарат фирмы SIGMA, USA, P 0425), затем срезы депарафинируют путем погружения их в 3 смены ксилола, а затем в 3 смены 100%-ного этилового спирта, потом помещают последовательно в растворы этилового спирта 96%, 90%, 80%, 70%, 50%-ной концентрации на 5 мин в каждый, а затем в забуференный фосфатным буфером физиологический раствор рН 7,4 на деионизированной воде - PBS стандартного состава: 0,01 М - фосфатный буфер, содержащий 0,138 М NaCk, рН - 7,4.

Затем срезы обрабатывают в микроволновой печи по известному методу (Loda М., Fogt F., French F.S., Posner M., Cukor В., Aretz H.T., Alsaign N. Androgen receptor immunohistochemistry on paraffin-embedded tissue. Mod.Pathol. J., 1994, v.7, p.p.388-391) в 10 М-цитратном буфере (рН 6,0) в режиме мощности печи 750 Вт, последовательно доводя раствор до кипения и охлаждая его до комнатной температуры по схеме: кипячение в течение 5 мин, охлаждение в течение 2 мин при комнатной температуре, кипячение в течение 5 мин.

Затем стекла со срезами в том же растворе буфера охлаждают в течение 15-10 мин при комнатной температуре.

Для ингибирования эндогенной пероксидазной активности клеток ткани после охлаждения срезы вынимают из раствора и инкубируют в течение 5 мин. в 3%-ном растворе перекиси водорода.

Прошедшие ранее описанную подготовку срезы промывают раствором PBS указанного ранее состава;

в) иммуногистохимический анализ среза ткани, обработка среза биологическими маркерами, вызывающими образование в структурах клеток окрашенных преципитатов.

При иммунологическом анализе по стандартной методике сыворотки биологических маркеров наносят на срезы ткани, которые затем инкубируют во влажной камере в течение 12 часов при температуре 4°С, затем тщательно отмывают в растворе PBS указанного ранее состава. Затем проводят визуализацию тканевых антигенов, например, видин-биотиновым методом при помощи универсального пероксидазного DAKO LSAB+kit (DAKO Corporation, USA), в котором биотинированные вторичные антитела реагируют с соответствующими молекулами пероксидазо-конъюгированного стрептавидина.(Giomo R.A. Comparison of the two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology, 1984, v.2, p.161).

Срезы промывают и обрабатывают биотинированными растворами антикроличьих иммуноглобулинов в буфере PBS, содержащем белковый носитель и 15 мМ азида натрия. Через 30 мин инкубирования срезы опять промывают, а затем инкубируют 30 мин в растворе стрептавидина, меченного пероксидазой хрена, в буфере PBS, содержащем белковый носитель и консервант.

По окончании реакции срезы промывают раствором PBS и проводят их окрашивание субстрат-хромогенным раствором ДАБ (3,3-диаминобензидин). Затем срезы промывают в проточной воде в течение 10 мин.

При необходимости более яркого окрашивания фоновых структур срезы докрашивают гематоксилином Майера.

Затем срезы подвергают дегидратации в этиловом спирте, последовательно в растворах 50%, 70%, 80%, 90% и 100%-ной концентрации, выдерживая в каждом растворе в течение 1 мин при комнатной температуре, затем в ксилоле, а затем заливают канадским бальзамом;

г) визуальная оценка результатов проведенного иммуногистохимического анализа по характеру расположения и концентрации окрашенных преципитатов для выявления участков ткани с анапластическим состоянием клеток.

Оценка производится путем визуального наблюдения препаратов под световым микроскопом при увеличении 100х или 400х.

Результаты иммуногистохимической реакции могут быть "положительными" или "отрицательными". Положительная реакция характеризуется появлением коричневого окрашивания в исследуемом препарате в центральной части желез простаты либо в цитоплазме клеток железистого эпителия, что свидетельствует о специфичности проведенной иммуногистохимической реакции. Отсутствие коричневой окраски в эпителиальных клетках предстательной железы свидетельствует об ошибках в проведении иммуногистохимической реакции.

"Положительный" результат иммуногистохимической реакции в зависимости от распределения нерастворимых ее продуктов коричневого цвета в исследуемых образцах позволяет делать выводы о состоянии процессов, протекающих в клетках исследуемого образца.

Согласно изобретению в сп