Способ получения биосовместимого материала для стоматологии

Способ получения биосовместимого материала для стоматологии

Реферат

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано для изготовления биоматериалов, которые применяются в качестве остеозамещающих средств при оперативном замещении костных дефектов (любого рода деструкция костной ткани, при удалении из костной ткани кист и опухолей и т.д.), а также в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани и в качестве носителя биологически активных веществ, лекарственных средств.

Наиболее близким по решению технической задачи является способ получения биосовместимого материала для стоматологии, включающий механическую очистку кости, обезжиривание, отмывание, измельчение кости до костной крошки размером от 7 до 700 мкм, обработку перекисью водорода, отмывание, высушивание, смешивание с коллагеном и сульфатированными гликозаминогликанами (RU 2155025 С1, 1999).

Недостатком указанного способа является то, что экстракцию неколлагеновых белков проводят после ферментной обработки и удаления жира и температурной обработки, что приводит к денатурации и разрушению коллагена костной ткани. При этом часть фермента и неколлагеновых белков остается в материале, что повышает антигенность получаемого продукта и снижает его биосовместимость. Потеря минеральной части костной ткани при кипячении значительно уменьшает ее механические свойства (прочность).

Технической задачей изобретения является создание способа получения биосовместимого материала для стоматологии с целью повышения степени очистки костной ткани от неколлагеновых белков, липидов, протеогликанов и солей, сохранности структуры костного коллагена и минерального компонента костной ткани, что позволяет заполнять и удерживать объем костного дефекта, минерального компонента костной ткани, повышение биосовместимости и стимуляции остеорапарации за счет насыщения ее сульфатированными гликозаминогликанами (сГАГ).

Технический результат согласно изобретению достигается тем, что что до обезжиривания кость размельчают до костной крошки размером от 70 до 400 мкм, обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи в течение 10-24 часов при комнатной температуре, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 часов, затем обрабатывают в смеси раствора 1% аммиака: 1% этанола в течение 10-16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают, обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 10-16 часов, отмывают, обезжиривают в смеси этанол : хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают крошку и смешивают ее с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см³, при следующем соотношении компонентов мас.%:

Недеминерализованный коллаген
из кости	97-99
Коллаген, выделенный из склеры сельскохозяйственных
животных и/или человека	1-2%
Сульфатированные гликозаминогликаны	0,08-1,5%
Вода деионизованная	остальное

Сырьем для получения биосовместимого материала для стоматологии может являться губчатая или кортикальная кость человека и позвоночных животных. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью и высокой устойчивостью к действию коллагеназы. Этот вид коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани. Входящий в состав костной ткани минеральный компонент - гидроксиапатит - инкрустирует коллагеновые волокна и придает костной ткани уникальные прочностные характеристики. Полученные искусственным путем гидроксиапатиты только приближены к структуре гидроксиапатита костной ткани и в настоящее время не могут полностью соответствовать природному костному минералу.

В качестве источника растворимого коллагена используют коллаген типа I, выделенный из склеры с/х животных, постольку поскольку он эффективно связывает недеминерализованный костный коллаген в целевом продукте.

Существенным признаком изобретения является насыщение материала сГАГ.

Введение в материал сГАГ обусловлено их стимулирующим влиянием на процессы остеорепарации и способностью повышать биосовместимость биоматериалов (Иванов С.Ю., Ларионов Е.В. Новое в стоматологии. М. 1999. вып.2., Биосовместимость. М., 1999, стр.295-312).

СГАГ являются сложными полисахаридами и входят в состав протеогликанов. В свою очередь протеогликаны, являясь одним из основных компонентов межклеточного матрикса костной ткани, представляют из себя сложные соединения полисахаридов с белком. Полисахариды, входящие в их состав, - это линейные полимеры построенные из разных дисахаридных субъединиц, образованных уроновыми кислотами (глюкуроновой, галактуроновой и идуроновой), N-ацетилгексозаминами (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин) и нейтральными сахаридами (галактозой, маннозой и ксилозой). Именно эти полисахаридные цепи называются гликозаминогликанами (ГАГ). По меньшей мере один из сахаров в дисахариде имеет отрицательно заряженную карбоксильную или сульфатную группу. Зрелая костная ткань содержит в основном сульфатарованные гликозаминогликаны (сГАГ), такие как хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматансульфат и кератансульфат. Биосинтез протеогликанов в костной ткани осуществляется, главным образом, активироваными остеобластами и в незначительной степени зрелыми остеоцитами.

Согласно изобретению в состав материала могут вводится сГАГ, выделенные, например, из глаз свиней, трахеи или тканеспецифические костные сГАГ, постольку поскольку их качественный и количественный состав в разных биологических тканях различен (Methods in Molecular Biology, Vol.171, Proteoglycan Protocols. lozzo, R.V., ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001), а функциональная роль в различных отделах соединительной ткани сходна. Экспериментально было установлено, что сГАГ способны аффинно связываться с коллагеном, что значительно повышает функциональную активность материала и его биосовместимость (Scott, J.E. Proteoglycan-fibrillar collagen interactions. Biochem. J; 1988, 252, 313-323).

Для насыщения костной крошки и связывания коллагена, выделенного из склеры с/х животных, могут быть применены сГАГ из различных источников, их смеси или тканеспецифические костные сГАГ. Так при заполнения дефектов костной ткани в пародонтологии в состав материала включают сГАГ, выделенные из трахей животных или человека. При заполнении дефектов в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии в состав материала могут входить сГАГ из костной ткани или сГАГ, выделенные из роговиц как сами по себе, так и в виде смеси.

Для осуществления способа берется свежая костная ткань, которая механически очищается от остатков мышц, сухожилий и крови.

После механической обработки ткань сразу распиливают до крошки пилой с определенной толщиной и числом зубьев. Размер крошки предпочтительно от 70 до 400 мкм, поскольку эти размеры являются оптимальными при последующей обработке данной ткани растворами и получении конечного продукта.

Минимальный размер крошки определен в 70 мкм, так как в этом случае она не вымывается из костного дефекта, а при размере более 400 мкм затрудняется получение конечного продукта.

После нарезки крошку помещают в 0,4 н. раствор щелочи, например в раствор гидроксида натрия (NaOH) от 10 до 24 часов при комнатной температуре.

В нативном состоянии волокна костного коллагена " защищены " от действия щелочи слоем гидроксиапатита, и поэтому при обработке щелочью коллагеновые волокна не подвергаются деструкции и сохраняют свою структуру. В то же время щелочь способна эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопротеины. Показано, что обработка ткани щелочью резко снижает антигенные свойства получаемого материала, не оказывает влияния на структуру коллагена и, что особенно важно, эффективно удаляет вирусы и прионные белки.

В зависимости от структуры костной крошки и ее размеров время обработки в щелочи может быть различно и варьирует от 10 до 24 часов. Так для крошки из губчатой кости достаточно обработки в течение 10 часов, а при обработке кортикальной кости время обработки увеличивается до 24 часов.

При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг крошки в раствор выделяется около 7% неколлагеновых белков, что практически равно теоретически рассчитанному количеству (8%) для данного типа ткани (Wendel, М., Sommarin, Y., and Heinegerd, D.J. Cell Biol., 1998, 141, 839-847).

Минеральная составляющая кости не позволяет раствору щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24-часового воздействия. Эта стадия должна проводится при комнатной температуре, т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры структура коллагена может разрушаться.

Отмывку крошки после обработки щелочью проводят 5-ю объемами деионизованной воды. Деионизованная вода (полученная, например, на установке "Millipore") способствует лучшей отмывке материала от неорганических и органических соединений и снижению содержания катионов и анионов солей металлов и органических примесей и фрагментов.

Эта операция оказывается достаточной и позволяет отмыть все продукты реакции и удалить саму щелочь.

Окончательное разрушение неколлагеновых белков достигается после повторной обработки 0,4 н. щелочью при комнатной температуре. При этом удаляются оставшиеся в костной ткани белки (1% от теоретически рассчитанного) и протеогликаны, которые обуславливают основные антигенные свойства ткани. После обработки щелочью крошку отмывают деионизованной водой в течение ночи.

Для окончательного и надежного удаления резидуальных (остаточных) белков и других органических остатков в способ обработки введена обработка крошки в смеси 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 с временем обработки от 10 до 16 часов, меняя раствор на новый не менее двух раз. Время обработки обусловлено качеством крошки - исходным материалом может быть губчатая или из кортикальная кость с/х животных или человека.

Для крошки из губчатой ткани время обработки составляет 10 часов, что оптимально для выхода возможного остатка белка из костной крошки. Для костной крошки из кортикальной кости прекращение выхода резидуальных белков наблюдали через 16 часов.

Данный раствор отработан экспериментально и специально для удаления резидуальных белков и является уникальным для их удаления из любой соединительной ткани. Ранее показано, что наиболее эффективным способом такие остаточные белки и другие примеси эффективно удаляются низкоконцентрированными растворами. Примером такого раствора является смесь аммиака и этанола, взятых в небольших концентрациях.

Обработку материала растворами проводят с перемешиванием на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность растворов к местам их воздействия.

После обработки в смеси 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 костную крошку отмывают деионизованной водой в 5-ти сменах и затем обрабатывают раствором 3% перекиси водорода в течение 10 до 16 часов.

Такая обработка, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белков и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, липиды, труднорастворимые соли и т.д. Данный эффект очевиден при обработке крошки из кортикальной кости в течение 16 часов и крошки из губчатой кости в течение 10 часов. Для лучшей доступности раствора такую обработку также следует проводить на магнитной мешалке. После воздействия перекиси водорода костную крошку отмывают деионизованной водой.

В отличие от всех известных способов получения биосовместимого костного материала в способе согласно изобретению к обезжириванию приступают только после обработки кости щелочью и перекисью водорода, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген благодаря покрывающему практически каждое костное волокно защитному слою гидроксиапатита остается практически не измененным.

В костной ткани содержится значительное количество липидов и их соединений с белками и углеводами. В известном способе обработанные ферментом костные пластины содержат липиды, которые находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления липидов согласно изобретению в способ введена обработка костной крошки в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:2 на стадии, когда основная строма материала уже очищена от других ее составляющих. Обработку в смеси проводят 24 часа, что определяется по количеству содержания липидов на 1 г ткани по сухому весу. Материал обрабатывают в смеси не менее 24 часов, поскольку за это время липиды выходят из плотной части ткани (кортикальная кость). При необходимости обработку делают повторно до полного выхода липидов из ткани.

После обезжиривания костную крошку отмывают деионизованной водой и высушивают.

Для получения биосовместимого материала для стоматологии применяют коллаген, выделенный из склеры с/х животных, например из склер свиней, коллаген, выделенный путем кислотно-щелочного гидролиза (Коллаген и его применение в медицине. М.: Медицина, 1976 г., с.50-53), и готовят из него раствор с концентрацией коллагена от 1 до 2%.

Высушенную крошку смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер с/х животных, в соотношении 2 объемных части крошки к 3 объемным частям коллагена и сразу добавляют сГАГ.

Для получения биосовместимого материала для стоматологии согласно изобретению применяют сГАГ, выделенные например, из трахеи, кости или роговицы (RU 2162331).

Насыщение с ГАГ проводят при постоянном помешивании для их лучшей доступности ко всему объему раствора.

Концентрация сГАГ менее 800 мкг/см³ материала не оказывает выраженного стимулирующего эффекта на процесс репарации костного дефекта, а концентрация более 1500 мкг/см³ материала может вызывать аллергическую реакцию.

Насыщение раствора сГАГ проводят при комнатной температуре. По окончании насыщения из полученного материала готовят гели, порошки, гранулы или блоки криогенным способом. После этого материал фасуют и стерилизуют.

Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики оценки его характеристик, принятые для данного типа материалов.

Выход белка на стадии обработки щелочью после отмывки водой определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах крошки методом определения оксипролина по Кьельдалю.

Отсутствие протеогликанов на стадии после обработки перекисью водорода определяли спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм по методу Farndel.

Контроль на липиды после обезжиривания делали по окраске суданом.

Сохранность структуры стромы костной крошки определяли методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костной ткани и отдельные волокна коллагена имеют типичный вид без каких-либо изменений и нарушений. Минеральный компонент расположен над поверхностью коллагеновых волокон в виде сферических образований вдоль их длины.

Снижение антигенности и повышение биосовместимости определяли путем контрольных измерений на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом.

Исследования проводили на стадии после обработки - для прототипа (контрольные образцы) после обработки ферментом папаином, а для предлагаемого способа после обработки щелочью.

Для этого костную крошку взвешивали и инкубировали в течение ночи при 37°С в термостате. После этого делали заборы из вытяжки и следовали материалы на наличие не коллагеновых белков с помощью тест-системы Bio-Rad Protein Assey на спектрофотометре Heλios Thermo Spectronic при длине волны 750 нм.

Полученные данные сведены в таблицу.

Н.пп.	Вес образца	Показатели измерений
		1	2	3	4	5
1. После обработки папаином	0,0664 г	0,013	0,014	0,014	0,013	0,014
2. После обработки щелочью	0,0677 г	0,003	0,003	0,002	0,002	0,002

Так в материале, полученном по способу, описанному в прототипе, определяется в 4-5 раз больше неколлагеновых белков по сравнению с предлагаемым способом. Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить антигенность материала по уровню снижения белка в 2-4 раза по сравнению с прототипом.

Повышение биосовместимости материала доказывается методом имплантации под кожу экспериментальных животных по правилам ГОСТ Р ИСО 10993 и устойчивости к биологическим тканям и жидкостям в соответствии с МУ 25.1-001-86 (п.5.11) по методу №6 в растворе кровезаменителя в непрерывном режиме.

Для чего экспериментальным животным-крысам породы Вистар под кожу имплантировали гранулированный материал полученный по предлагаемому способу (опытные животные) и по способу описанному в прототипе (контрольные животные).

Через 1,5-2 мес животных выводили из эксперимента и делали гистологические срезы, которые изучали на микроскопе "Leika" Германия.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что на препаратах опытных образцов вокруг имплантатов формируется незначительная фиброзная капсула, материал фрагментирован, явления воспаления и отторжения отсутствуют.

В контрольных образцах у нескольких животных в зоне имплантации на 7-14 сутки после операции отмечалась гиперемия и отечность. Гистологические исследования выявили развитие воспаления в зоне имплантата со скоплением клеток воспалительного ряда.

Таким образом, видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет снизить антигенность материала и, таким образом, повысить его биосовместимость.

Предлагаемый способ обработки ткани позволяет сохранить его структуру и повысить его качественные характеристики за счет повышения биосовместимости материала. Введение в материал коллагена, выделенного из склеры сельскохозяйственных животных и сГАГ, придает ему дополнительные остеорепаративные свойства и повышает его биосовместимость.

Краткая технология получения материала.

Прошедшую ветеринарный контроль губчатую кость свиньи очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 10-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 10-16 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают крошку раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают водой деионизованной, затем 3% перекисью водорода в течение 10-16 часов, отмывают водой деионизованной, обезжиривают в смеси раствора этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных, в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см³.

Приведенные выше действия приводят к сохранности структуры коллагена и минерального компонента кости, а также к снижению антигенности полученного материала.

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1.

Донорскую губчатую кость человека, прошедшую необходимые контрольные анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 70-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 10 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно при комнатной температуре в течение 10 часов обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака: и 1% этанола в течение 10 часов, меняют раствор на новый не менее двух раз, затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 10 часов, отмывают водой деионизованной, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают при комнатной температуре, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами 800 мкг/см³ при следующем соотношении: недеминерализованный коллаген из кости - 97%; коллаген из склеры с/х животных - 1%; сГАГ - 0,08% и остальное вода деионизованная.

Полученную смесь выдерживают в течение 16 часов, после чего готовят из нее гранулы криогенным способом.

Проводят контроли на наличие белка и липидов.

Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях материал может быть насыщен биологически активными веществами.

Пример 2.

Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 70-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 12 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака и 1% этанола в течение 12 часов, меняют раствор на новый не менее двух раз, затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 12 часов, обезжиривают в смеси раствора этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами 1000 мкг/см³, при следующем соотношении: недеминерализованный коллаген из кости - 98%; коллаген из склеры с/х животных - 1,5%; сГАГ - 1% и вода деионизованная остальное.

Полученный гелевый раствор расфасовывают в шприцы, стерилизуют.

Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях костный материал может быть насыщен биологически активными веществами.

Пример 3.

Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают до крошки размером 70-400 мкм, обрабатывают крошку при комнатной температуре в течение 24 часов раствором 0,4 н. щелочи, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 н. щелочи, в течение 24 часов при комнатной температуре отмывают водой деионизованной, обрабатывают смесью раствора 1% аммиака и 1% этанола в течение 16 часов, меняют раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 16 часов, отмывают водой деионизованной, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают при комнатной температуре, смешивают с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами 1500 мкг/см³, при следующем соотношении: недеминерализованный коллаген из кости - 99%; коллаген из склеры с/х животных - 2%; сГАГ - 1,5% и вода деионизованная остальное, затем готовят блоки криогенным методом, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.

Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В экспериментальных и научных целях костный недеминерализованный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами.

Использование предлагаемого способа позволяет получить насыщенный сГАГ, высококачественный и низкоантигенный материал для стоматологии с сохранной органической (коллаген костной ткани) и минеральной (гидроксиапатит костной ткани) структурой.

Способ получения биосовместимого материала для стоматологии, включающий механическую очистку кости, обезжиривание, отмывание, измельчение до костной крошки, обработку перекисью водорода, отмывание, высушивание и смешивание с коллагеном и сульфатированными гликозаминогликанами, отличающийся тем, что до обезжиривания кость размельчают до костной крошки размером от 70 до 400 мкм, обрабатывают раствором 0,4 Н щелочи в течение 10-24 ч при комнатной температуре, отмывают водой деионизованной, повторно обрабатывают раствором 0,4 Н щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 ч, затем обрабатывают в смеси раствора 1%-ного аммиака: 1%-ного этанола в течение 10-16 ч, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают, обрабатывают 3%-ной перекисью водорода в течение 10-16 ч, отмывают, обезжиривают в смеси этанол:хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее двух раз, отмывают водой деионизованной, высушивают крошку и смешивают ее с раствором коллагена, выделенного из склер сельскохозяйственных животных в соотношении 2:3 объемных частей, насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см³, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Недеминерализованный коллаген из кости	97,0-99,0
Коллаген, выделенный из склеры
сельскохозяйственных животных	1,0-2,0
Сульфатированные гликозаминогликаны	0,08-1,5
Вода деионизованная	Остальное