Способ получения материала для остеопластики и материал для остеопластики

Способ получения материала для остеопластики и материал для остеопластики

Реферат

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а более конкретно к способам получения материалов для остеопластики, которые применяются в качестве остеозамещающих средств при оперативном замещении костных дефектов (любого рода деструкции костной ткани, при удалении из костной ткани кист и опухолей и т.д.), а также в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани и в качестве носителя биологически активных веществ, лекарственных средств и клеток.

Известен способ получения материала для остеопластики, включающий очистку, распиливание костной ткани, обезжиривание, обработку раствором мочевины, отмывание, высушивание, упаковку и стерилизацию (Патент РФ 2104703 С1, 20.02.98), который является ближайшим аналогом заявленного изобретения.

Недостатком указанного способа является то, что экстракцию неколлагеновых белков мочевиной проводят после удаления жира и частичной деминерализации костной ткани, что приводит к частичному разрушению коллагена и деструкции минерального остова костной ткани. При этом часть жиров и неколлагеновых белков остается, что повышает антигенность получаемого целевого продукта и снижает его биосовместимость, а частичная потеря минеральной части костной ткани после деминерализации значительно уменьшает ее механические и прочностные свойства.

Кроме того, процесс приживления данного костного материала для остеопластики, его адаптация к окружающим тканям костного дефекта, пролиферация и миграция клеток в строму материала довольно длительны, так как в зоне дефекта, при заболеваниях и повреждениях соединительной ткани значительно снижается уровень сГАГ, отвечающих за адаптацию материала и адгезию клеток.

Задачей изобретения в части способа получения материала для остеопластики является повышение качества очистки костной ткани от жиров и неколлагеновых белков с целью снижения его антигенности, повышения биосовместимости, механических и прочностных свойств целевого продукта, а также ускорение процессов репарации и остеоинтеграции, сокращение сроков лечения и реабилитации за счет дополнительного насыщения сГАГ.

Технический результат, согласно изобретению, достигается в части способа тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, обрабатывают 2% раствором щелочи в течение 10-24 часов при комнатной температуре, отмывают, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 10-24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 10-16 часов, обезжиривают в течение 24 часов, в смеси этанол: хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 10-16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, отмывают деионизованной водой и насыщают сГАГ от 800 до 1500 мкг/см³, отмывают буфер, высушивают, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.

Новым в способе получения материала для остеопластики с целью сохранности структуры недеминерализованного коллагена костной ткани, снижения антигенности и повышения биосовместимости является проведение обработки подготовленной костной ткани в виде пластин раствором 2% щелочи в течение 10-24 часов, отмывания деионизованной водой, раствором 6 М мочевины, отмывание деионизованной водой и обработки 3% перекисью водорода перед обезжириванием, при этом не происходит разрушения коллагена I и III типа и деструкции минерального остова костной ткани, а также окончательного удаления резидуальных белков и жира после обезжиривания смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 10-16 часов, со сменой раствора на новый не менее 2 раз. Насыщение целевого продукта сГАГ обусловлено их стимулирующим влиянием на процессы остеорепарации и способностью повышать биосовместимость целевого продукта.

СГАГ являются сложными полисахаридами и входят в состав протеогликанов. В свою очередь, протеогликаны, являясь одним из основных компонентов межклеточного матрикса костной ткани, представляют сложные соединения полисахаридов с белком. Полисахариды, входящие в их состав, это линейные полимеры, построенные из разных дисахаридных субъединиц, образованных уроновыми кислотами (глюкуроновой, галактуроновой и идуроновой), N-ацетилгексозаминами (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин) и нейтральными сахаридами (галактозой, маннозой и ксилозой). Именно эти полисахаридные цепи называются гликозаминогликанами (ГАГ). По меньшей мере один из сахаров в дисахариде имеет отрицательно заряженную карбоксильную или сульфатную группу. Зрелая костная ткань содержит такие (сГАГ), как хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматансульфат и кератансульфат. Биосинтез протеогликанов в костной ткани осуществляется главным образом активироваными остеобластами и в незначительной степени зрелыми остеоцитами. Важным признаком изобретения является насыщение костного материала сГАГ.

Экспериментально установлено, что сГАГ способны аффинно связываться с коллагеном, что значительно повышает функциональную активность материала и его биосовместимость.

Сырьем для получения материала для остеопластики может являться губчатая или кортикальная кость человека или позвоночных животных, птиц. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью и высокой устойчивостью к действию коллагеназы и других протеолитических ферментов. Этот вид коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани.

Сохранность структуры недеминерализованного коллагена костной ткани в основном обусловлена способами его получения.

Способ получения материала для остеопластики, согласно изобретению, осуществляется следующим образом.

Свежая косная ткань механически очищается от остатков мышц, сухожилий и прочее.

Получение костного материала путем измельчения и обработкой ферментами и перекисью водорода приводит к деструкции костного коллагена как в результате механической и термической обработки, так и результате ферментативного разрушения связей коллагена и минеральной части (Пат. РФ 2155025 от 14.12.1999 г.). При этом снижается возможность эффективного связывания коллагена и биологически активных веществ, таких, например, как сГАГ.

Природный костный минерал является уникальным многокомпонентным соединением солей и их комплексов. Помимо основного минерала гидроксиапатита в состав костного минерала входят карбонаты, фосфаты и микроэлементы.

Полученные искусственным путем гидроксиапатиты только приближены к структуре гидроксиапатита костной ткани и в настоящее время не могут полностью соответствовать природному костному минералу. В большинстве способов при получении костного материала коллаген или деминерализованная кость смешиваются с искусственным гидроксиапатитом или солями кальция (напр., Pat. US 5425770 от 20.06.1995 г. Piez K.et al).

Согласно изобретению, в состав материала вводятся сГАГ: их содержание в соединительной ткани с возрастом, при заболеваниях и повреждениях снижается.

Изобретение не исключает возможности применения сГАГ из различных источников, применения их смесей или применения тканеспецифических сГАГ. Так, при заполнении дефектов костной ткани в пародонтологии в состав материала включают сГАГ, выделенные из трахей животных или человека. При заполнении дефектов в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии в состав материала могут входить сГАГ из костной ткани или сГАГ, выделенные из роговиц как сами по себе, так и в виде смеси.

Применение костной ткани в качестве остеозамещающего материала имеет неоспоримые преимущества перед искусственными и обусловлено ее более высоким сродством с костной тканью по своей структуре и составу. Процессы синтеза и ремоделирования костной ткани как в физиологических условиях, так и при репарации идут значительно быстрее, если материал имеет биологическое происхождение.

Технология приготовления биосовместимого материала для костной пластики, согласно изобретению, требует начальной механической обработки ткани, когда кость очищается от остатков мягких тканей и прочего.

После механической обработки ткань распиливают на пластины толщиной не менее 0,1 см и не более 2,0 см, поскольку эти размеры являются наиболее оптимальными при последующей обработке данной ткани растворами.

Минимальный размер пластин толщиной от 0,1 см и максимальный 2,0 см определены нами опытным путем. При увеличении толщины пластины возникают трудности при отмывке таких пластин от применяемых по технологии растворов. При уменьшении толщины пластин имеются серьезные проблемы с сохранением целостности костной ткани в процессе ее обработки.

После нарезки костную ткань промывают и помещают в 2% раствор щелочи, например в раствор гидроксида натрия (NaOH) от 10 до 24 часов.

В нативном состоянии волокна костного коллагена "защищены" от действия щелочи слоем гидроксиапатита и поэтому при обработке щелочью коллагеновые волокна не подвергаются деструкции и сохраняют свою структуру. В то же время щелочь способна эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопротеины, так как обработка ткани щелочью резко снижает антигенные свойства получаемого материала, не оказывает влияния на структуру коллагена и что особенно важно эффективно удаляет вирусы и прионные белки.

В зависимости от структуры костной ткани и ее толщины время обработки в щелочи может быть различно и варьирует от 10 до 24 часов. Так, например, при толщине пластины из губчатой кости в 0,1 см для обработки достаточно времени 10 часов, а при толщине пластины из губчатой кости 2,0 см или в случае обработки кортикальной кости время обработки увеличивается до 24 часов.

При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг костной ткани в раствор выделяется около 7% неколлагеновых белков, что практически равно теоретически рассчитанному количеству (8%) для данного типа ткани (Wendel, M., Sommarin, Y., and Heinegard, D.J. Cell Biol., 1998, 141, 839-847).

Минеральная составляющая кости не позволяет раствору щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24 часового воздействия. Эта стадия должна проводится при комнатной температуре - 18°С, т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры структура коллагена может разрушаться.

Отмывку костных пластин после обработки их щелочью проводят 5-ю объемами деионизованной воды. Деионизованная вода (полученная например на установке "Millipore") способствует лучшей отмывке материала от неорганических и органических соединений и снижению содержания катионов и анионов солей металлов и органических примесей и фрагментов. Время отмывки 24 часа.

Эта операция оказывается достаточной и позволяет отмыть все продукты реакции и удалить саму щелочь.

Окончательное разрушение неколлагеновых белков достигается после обработки костной ткани 6 М раствором мочевины. При этом корректно удаляются оставшиеся в костной ткани белки (1% от теоретически рассчитанного) и протеогликаны, которые обуславливают основные антигенные свойства ткани.

Обработку костной ткани 6 М раствором мочевины проводят в течение от 10 до 24 часов при комнатной температуре. Мочевина - наиболее эффективный агент, разрушающий белки, находящиеся на поверхности эндостакостной структуры.

Например, губчатую кость с размером пластин 0,1 см обрабатывают в течение 10 часов, так как за это время белковые молекулы, находящиеся на поверхности коллагеновых волокон, полностью разрушаются, а более толстые пластины и кортикальную кость обрабатывают в течение 24 часов, после этого времени белок в смывах не обнаруживается. Обработку материала проводят с перемешиванием на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность растворов к местам их воздействия.

После обработки мочевиной пластины отмывают деионизованной водой в 5-ти сменах в течение 24 часов и затем обрабатывают раствором перекиси водорода и продолжают обработку 3% перекисью водорода в течение от 10 до 16 часов.

Такая обработка, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белков и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, липиды, труднорастворимые соли и т.д. Данный эффект очевиден при обработке пластин с максимальным размером толщины 2,0 см в течение 16 часов и при толщине пластин 0,1 см в течение 10 часов. Для лучшей доступности раствора такую обработку также следует проводить на магнитной мешалке. После воздействия перекиси водорода костные пластинки отмывают деионизованной водой, затем этанолом и высушивают при комнатной температуре.

В отличие от всех известных способов получения костного материала в настоящем способе к обезжириванию приступают только после обработки кости щелочью и мочевиной, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген, благодаря покрывающему практически каждое костное волокно защитному слою гидроксиапатита, остается практически не измененным.

В костной ткани содержится значительное количество липидов и их соединений с белками и углеводами. В обработанных ферментом костных пластинах липиды находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления липидов в способ введена обработка костных пластин в смеси хлороформа и этанола в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, на стадии, когда основная строма материала уже очищена от других ее составляющих. Обработку в смеси проводят 24 часа, что определяется по количеству содержания липидов на 1 г ткани по сухому весу. Материал обрабатывают в смеси не менее 24 часов, поскольку за это время липиды выходят из плотной части ткани (кортикальная кость).

Для удаления резидуальных белков и других органических остатков в способ обработки введена обработка пластин раствором смеси 1% аммиака: 1% этанола в соотношении 1:1 с временем обработки от 10 до 16 часов. Время обработки обусловлено толщиной пластин.

При толщине пластин 0,1 см время обработки составляет 10 часов, что оптимально для выхода возможного остатка белка из пластин. При толщине пластин в 2,0 см прекращение выхода резидуальных белков наблюдали через 16 часов.

Данный раствор выбран экспериментально и специально для удаления резидуальных белков и является уникальным для их удаления из любой соединительной ткани. Ранее показано, что наиболее эффективным способом такие остаточные белки и другие примеси эффективно удаляются низкоконцентрированными растворами. Примером такого раствора является смесь 1% аммиака и 1% этанола. После 2-кратной обработки смесью аммиака и этанола в тот же свежий раствор добавляют порошок сГАГ в концентрации от 800 до 1500 мкг/см³.

СГАГ получают по способу, описанному в Патенте РФ №2162331, из различных источников - трахеи, кости или роговицы. Насыщение ведут в течение 24 часов.

Насыщение пластин из костной ткани сГАГ проводят на магнитной мешалке для их лучшей доступности к строме костного коллагена.

Концентрация сГАГ менее 800 мкг/см³ материала не оказывает выраженного стимулирующего эффекта на процесс репарации костного дефекта, а концентрация более 1500 мкг/г материала может вызывать аллергическую реакцию.

Насыщение пластин сГАГ проводят при комнатной температуре. Время насыщения определяется опытным путем по исчезновению сГАГ из раствора. Обычно это время не превышает 24 часов.

После процесса насыщения раствор сливают, промывают водой деионизованной, а пластины высушивают, нарезают на куски необходимого размера или готовят на его основе гранулы, гели или крошку. После этого материал фасуют и стерилизуют.

Краткая технология получения материала.

Прошедшую ветеринарный контроль кость свиньи, очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см и помещают в раствор 2% щелочи при комнатной температуре в течение 24 часов, отмывают, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 16 часов, обезжиривают в течение 24 часов в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз и насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см³ в течение 24 часов, высушивают, нарезают как необходимо, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.

Приведенные выше действия приводят к сохранности структуры коллагена и минерального компонента кости, а также к снижению антигенности полученного материала.

Технический результат в части материала для остеопластики достигается тем, что он содержит недеминерализованный коллаген костной ткани, сГАГ и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Недеминерализованный коллаген
из костной ткани свиней или человека	97-99
Сульфатированные гликозаминогликаны	0,08-1,5
Вода очищенная	Остальное

Материал для остеопластики, согласно изобретению, содержит недеминерализованный коллаген из костной ткани от 97 до 99%, что является оптимальным для замещения костного дефекта и соответствует составу природной костной ткани.

Материал для остеопластики, согласно изобретению, насыщен сГАГ от 0,08 до 1,5%, что является оптимальным для достижения стимулирующего эффекта.

При концентрации менее 0,08% стимулирующий и защитный эффект будет минимальным, а концентрация выше 1,5% может вызвать нежелательные побочные эффекты.

Материал для остеопластики свободен от белков, протеогликанов и жиров, что делает его неантигенным и биосовместимым.

Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики оценки его характеристик, принятые для данного типа материалов.

Выход белка по стадиям обработки определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах методом определения оксипролина по Кьельдалю.

Отсутствие протеогликанов на стадии после обработки перекисью водорода определяли спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм по методу Farndel.

Контроль на липиды после обезжиривания делали по окраске Суданом.

После высушивания и стерилизации ставили контрольные измерения на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом.

Сохранность структуры стромы костного материала определяли путем исследования гистологических срезов, электронно-микроскопически и методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костной ткани и отдельные волокна коллагена имеют типичный вид без каких-либо изменений и нарушений. Минеральный компонент расположен над поверхностью коллагеновых волокон в виде сферических образований вдоль их длины.

Снижение антигенности материала доказывается иммунологическим методом путем иммунизации животных - крыс породы Вистар (10 животных опытных, 10 контрольных). Из опытных образцов материала, изготовленного по предлагаемому способу, готовили водно-солевые экстракты, которые смешивали с неполным адьювантом Фрейнда. Аналогичные экстракты готовили и из контрольных образцов, изготовленных по способу, описанному в прототипе.

Животных иммунизировали по схеме, описанной в "Лабораторная иммунология". М. 1980. Через 1,5 мес. животных выводили из эксперимента и определяли титр антител методом преципитации и методом Кунса-Уэллера путем непрямой иммунофлюоресценции на флюоромикроскопе Оптон, для чего материал резали на криостате и помещали срезы на стекло, наносили антисыворотку в различных разведениях и меченные флюоресцеином антикроличьи Ig овцы, инкубировали в течение 15-30 мин и тщательно отмывали фосфатным буфером, заключали в глицерин и просматривали в микроскопе, через отсекающий фильтр при длине волны 440 нм.

Результаты этих исследований приведены в таблице.

Вид материала	Титр Ат 1:50	Титр Ат 1:100	Титр Ат 1:1000
Материал, обработанный по предлагаемому способу	++++	нет	нет
Материал, обработанный по прототипу	++++	++++	+
Где ++ визуальная оценка интенсивности свечения

Таким образом видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет снизить антигенность материала и таким образом повысить его биосовместимость и уменьшить число послеоперационных осложнений при применении данного материала в хирургической практике.

При использовании материала для остеопластики, согласно изобретению, ускоряются процессы репарации и остеоинтеграции, обеспечивается сокращение сроков на всех этапах лечения и реабилитации пациентов. Материал для остеопластики не антигенен. стерилен и прост в использовании. Материал является естественным матриксом для ориентированной миграции клеток, совместим с большинством биологически активных и лекарственных средств. Применение биоматериала для остеопластики, согласно изобретению, значительно снижает число осложнений особенно при длительном нахождении такого имплантата в организме.

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1.

Донорскую кость человека, прошедшую необходимые контрольные анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,1 см, помещают в 2% раствор щелочи на 10 часов при комнатной температуре, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 10 часов, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 10 часов, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 10 часов, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз и насыщают сГАГ 800 мкг/см³, отмывают высушивают, нарезают на блоки или полоски, фасуют и стерилизуют радиационным облучением при следующем соотношении компонентов, мас.%: недеминерализованный коллаген из донорской костной ткани человека - 97%, сГАГ - 0,08% и остальное - вода деионизованная.

Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях материал может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть носителем клеток (стволовых, эмбриональных и других видов клеток).

Пример 2.

Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0 см, помещают в 2% раствор щелочи на 1 6 часов при комнатной температуре, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 18 часов, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 16 часов, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 14 часов, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 12 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, насыщают сГАГ 1000 мкг/см³, отмывают, высушивают, нарезают на блоки, полоски, готовят крошку или гранулируют, фасуют и стерилизуют радиационным облучением, при следующем соотношении компонентов, мас.%: недеминерализованный коллаген из губчатой кости свиньи - 98%, сГАГ - 1,2% и остальное - вода деионизованная.

Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии. При необходимости материал может быть использован в качестве основы при изготовлении изделий для офтальмохирургии. В экспериментальных и научных целях костный материал может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть использован в качестве носителя клеток.

Пример 3.

Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см, помещают в 2% раствор щелочи на 24 часа при комнатной температуре, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 24 часов, отмывают 5 объемами деионизованной воды в течение 24 часов, затем 3% перекисью водорода в течение 16 часов, обезжиривают в смеси этанола и хлороформа в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью 1% аммиака и 1% этанола в соотношении 1:1 в течение 16 часов, меняют раствор на новый не менее 2 раз, насыщают сГАГ 1500 мкг/см³, отмывают, высушивают разрезают на блоки, фасуют и стерилизуют радиационным облучением, при следующем соотношении, мас.%: недеминерализованный коллаген кортикальной кости свиньи - 99%, сГАГ - 1,5% и вода деионизованная - остальное.

Материал применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии, травматологии и челюстно-лицевой хирургии. В экспериментальных и научных целях материал может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть носителем клеток (стволовых, эмтриональных и других видов клеток).

1. Способ получения материала для остеопластики, включающий очистку, распиливание кости, обезжиривание, обработку раствором мочевины, отмывание, высушивание, упаковку и стерилизацию, отличающийся тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, обрабатывают раствором 2%-ной щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 ч, отмывают, обрабатывают 6 М раствором мочевины в течение 10-24 ч, затем 3%-ной перекисью водорода в течение 10-16 ч, обезжиривают в течение 24 ч в смеси этанол: хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, обрабатывают смесью раствора 1% аммиак: 1% этанол в соотношении 1:1 в течение 10-16 ч, меняют раствор на новый не менее 2 раз и насыщают сульфатированными гликозаминогликанами от 800 до 1500 мкг/см³, высушивают, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.

2. Материал для остеопластики, характеризующийся тем, что он получен способом по п.1 и содержит не деминерализованный коллаген из костной ткани, сульфатированные гликозаминогликаны и деионизованную воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Недеминерализованный коллаген
из костной ткани	97-99
Сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ)	0,08-1,5
Вода деионизованная	Остальное