Белки урокортина и их применения

Белки урокортина и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПИСАНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОГО ФИНАНСИРОВАНИЯ

Данное изобретение частично выполнено с использованием средств, полученных от Федерального правительства по гранту № DK-26741. Таким образом, Федеральное правительство имеет определенные права на данное изобретение.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение, в общем, относится к областям нейроэндокринологии и механизмам, вовлеченным в стресс. Более конкретно, данное изобретение относится к новым пептидам, родственным кортикотропин-рилизинг фактору, урокортину II и родственному урокортину белку человека, которые принимают участие в ответе на стресс.

ОПИСАНИЕ СВЯЗАННОЙ ОБЛАСТИ

Кортикотропин-рилизинг фактор (CRF) является пептидом, состоящим из 41 аминокислоты, лучше всего известным ввиду его важной роли в инициации гипофизарно-надпочечниковых ответов на стресс, эффекта, опосредуемого рецепторами CRF типа 1 (1). Кроме того, кортикотропин-рилизинг фактор широко распространен в головном мозге, и многократно было показано, что он принимает участие в мобилизации взаимодополняющих автономных и поведенческих приспособительных реакций в случае множества угрожающих условий (2, 3). Это побудило выдвинуть получившую широкое признание гипотезу о том, что кортикотропин-рилизинг фактор и семейство родственных ему пептидов играют важную роль в регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (НРА) при основных и стрессовых условиях (4, 5). Также считается, что кортикотропин-рилизинг фактор также участвует в других нейроэндокринных и паракринных ответах во многих тканях. Члены семейства CRF осуществляют интеграцию эндокринных, автономных и поведенческих ответов на стресс-факторы. Указанные пептиды также могут быть вовлечены в осуществление контроля аппетита, возбуждения и познавательных функций. В результате долговременного воздействия стресса могут возникать тяжелые психологические и физиологические последствия, такие как тревожные расстройства, нервная анорексия и меланхолическая депрессия.

Члены семейства кортикотропин-рилизинг фактора опосредуют свои биологические действия в результате специфичного связывания с рецепторами CRF с высокой аффинностью (6, 7). Рецепторы CRF являются рецепторами, связанными с G-белком, которые действуют через аденилатциклазу и являются структурно родственными семейству секретина. Указанное семейство также включает в себя GRF, VIP, PTH и рецептор кальцитонина. Ген рецептора CRF имеет 13 экзонов, и обнаружено несколько вариантов сплайсинга данного рецептора. Рецептор CRF-R1 распределен по всему головному мозгу и обнаружен в местах передачи сенсорных и моторных сигналов (8). CRF-R2α распределен в латеральной перегородке, вентрально-медиальном гипоталамусе, ядре одиночного пути и дорсальном ядре шва, которые представляют собой области, где CRF-R1 экспрессируется очень мало или совсем не экспрессируется (9). CRF-R2β главным образом обнаружен в периферических местах, включая сердце, кровеносные сосуды, желудочно-кишечный тракт, эпидидимис, легкое и кожу (7, 10). Фармакология двух типов рецепторов отличается тем, что кортикотропин-рилизинг фактор обладает низким сродством по отношению к CRF-R2 (Ki=15-100 нМ), но высоким сродством по отношению к CRF-R1 (Ki=1-2 нМ). Другие родственные пептиды, такие как уротензин карпа, саувагин лягушки и урокортин обладают высоким сродством к CRF-R2. Мыши, нокаутированные по CRF-R2, проявляют повышенное похожее на тревожное поведение, вызванное гиперчувствительностью к стресс-факторам (11).

Обнаружено, что в ряде групп клеток, идентифицированных как места действия пептидов, вызывающих стресс-подобные автономные и поведенческие ответы, отсутствует или ослаблена экспрессия необходимого лиганда(дов), рецептора(ров) или и того и другого (12, 13). Это привело к активизации поиска дополнительных родственных CRF сигнальных молекул, которые в настоящее время насчитывают два лиганда, связанные с G-белком рецепторы, получаемые из двух отдельных генов (CRF-R1 и CRF-R2), и связывающий белок, функции которых до конца неизвестны (14, 15).

Недавно обнаружили второй родственный CRF нейропептид млекопитающих, урокортин (Ucn), и показали, что он с высоким сродством связывается с обоими известными типами рецепторов CRF, тогда как CRF с большим предпочтением связывается с CRF-R1. При центральном введении урокортин более эффективен, чем CRF, в подавлении аппетита, но менее эффективен в генерировании острых подобных тревожным эффектов и в генерализованной активации поведения (17). Это использовали для того, чтобы показать, что урокортин может, по меньшей мере, частично опосредовать некоторые связанные со стрессом эффекты, которые сначала приписывали CRF, служа в качестве эндогенного лиганда CRF-R2. Однако данная точка зрения подвергается сомнению в результате таких наблюдений, как наблюдение того, что основные клеточные места экспрессии урокортина в головном мозге не распознаются в виде интегральных компонентов центральной связанной со стрессом схемы и что большинство основных мест экспрессии CRF-R2 слабо иннервированы содержащими урокортин выростами (18). Указанные и другие данные подтверждают возможное существование одного или нескольких дополнительных лигандов рецепторов CRF в головном мозге млекопитающих.

Предшествующий уровень техники не отвечает требованиям из-за отсутствия выявленных дополнительных генов и белков урокортина. Данное изобретение удовлетворяет эту давнюю необходимость и потребность в данной области.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Быстрый прогресс в накоплении данных о последовательностях геномов человека и мыши дает возможность для идентификации новых представителей многих семейств белков. Новая пептидная последовательность, родственный урокортину пептид человека (URP), идентифицировали в опубликованной базе данных генома человека. Последовательность пептида, родственного урокортину, обладает гомологией с урокортином человека (44%), уротензином карпа (39%) и CRF человека (36%). Синтезированный пептид, родственный урокортину, с более высокой аффинностью связывается с CRF-R2 (Ki=0,5 нМ), чем с CRF-R1 (Ki=70 нМ). Пептид человека, родственный урокортину, стимулирует секрецию АКТГ из клеток передней доли гипофиза крыс, хотя значительно менее эффективно по сравнению с урокортином или CRF. Используя средства поиска гомологии последовательностей, также идентифицировали мышиный ген, кодирующий пептид из 38 аминокислот, который представляет собой новый член CRF-семейства нейропептидов. Указанный пептид, названный урокортином II (Ucn II), отличается от других известных представителей семейства тем, что он связывается с высокой избирательностью с CRF-R2. Доказательства наличия урокортина II в головном мозге крыс получены при иммуногистохимических исследованиях и исследованиях гибридизации in situ с использованием антител высокоспецифичных по отношению к урокортину II.

В одном варианте данного изобретения представлена последовательность ДНК, кодирующая урокортин II. Указанную последовательность можно выбрать из группы, состоящей из: изолированной и очищенной ДНК, которая кодирует урокортин II; изолированной и очищенной ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с антисмысловой последовательностью, комплементарной ДНК урокортина II, (при этом условия высокой жесткости определяют как промывку мембраны при высокой температуре и низкой концентрации соли, функционально эквивалентных 0,1 х SSC при 65°С); и изолированной и очищенной ДНК, кодирующей урокортин II, но которая отличается по последовательности вследствие вырожденности генетического кода. Указанная ДНК предпочтительно кодирует белок-предшественник, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.

В другом варианте данного изобретения направлением настоящего изобретения является вектор, способный экспрессировать урокортин II. Такой вектор состоит из ДНК, кодирующей урокортин II, и регуляторных элементов, необходимых для экспрессии урокортина II в клетке. В предпочтительном варианте указанный вектор кодирует белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11. Направлением данного изобретения также является клетка-хозяин, трансфицированная таким вектором и экспрессирующая урокортин II с указанного вектора. Белок может экспрессироваться в типе клеток, выбранном из бактериальных клеток, клеток млекопитающих, растительных клеток и клеток насекомых. В одном предпочтительном варианте белок экспрессируется в E. coli.

В еще одном варианте данное изобретение относится к выделенному и очищенному белку урокортина II человека, кодируемому описанной выше ДНК. Предпочтительно очищенный родственный урокортину пептид человека имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 11.

В другом варианте данное изобретение относится к антителу, направленному против белка урокортина II. Указанное антитело может представлять собой моноклональное антитело.

В еще одном варианте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок урокортина II. Такую фармацевтическую композицию можно использовать для снижения температуры тела, подавления аппетита и лечения или профилактики застойной сердечной недостаточности и различных расстройств, связанных со стрессом.

В следующем варианте данное изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей родственный урокортину пептид человека. Указанную последовательность можно выбрать из группы, состоящей из: изолированной и очищенной ДНК, которая кодирует родственный урокортину пептид человека; изолированной и очищенной ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с антисмысловой последовательностью, комплементарной ДНК родственного урокортину пептида человека (при этом условия высокой жесткости определяют как промывку мембраны при высокой температуре и низкой концентрации соли, функционально эквивалентных 0,1 х SSC при 65°С); и изолированной и очищенной ДНК, кодирующей родственный урокортину пептид человека, но которая отличается по последовательности вследствие вырожденности генетического кода. Указанная ДНК предпочтительно имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 и кодирует белок-предшественник, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2.

В другом варианте данного изобретения направлением настоящего изобретения является вектор, способный экспрессировать родственный урокортину пептид человека. Такой вектор состоит из ДНК, кодирующей родственный урокортину пептид человека, и регуляторных элементов, необходимых для экспрессии родственного урокортину пептида человека в клетке. В предпочтительном варианте указанный вектор кодирует белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. Направлением данного изобретения также является клетка-хозяин, трансфицированная таким вектором и экспрессирующая родственный урокортину пептид человека с указанного вектора. Белок может экспрессироваться в типе клеток, выбранном из бактериальных клеток, клеток млекопитающих, растительных клеток и клеток насекомых. В одном предпочтительном варианте белок экспрессируется в E. coli.

В еще одном варианте данное изобретение относится к выделенному и очищенному белку родственного урокортину пептида человека, кодируемому описанной выше ДНК. Предпочтительно очищенный родственный урокортину пептид человека имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3.

В другом варианте данное изобретение относится к антителу, направленному против белка родственного урокортину пептида человека. Указанное антитело может представлять собой моноклональное антитело.

В еще одном варианте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок родственного урокортину пептида человека. Такую фармацевтическую композицию можно использовать для снижения температуры тела, подавления аппетита и лечения или профилактики застойной сердечной недостаточности и различных расстройств, связанных со стрессом.

В другом варианте данного изобретения описаны различные модификации белков урокортина II и родственного урокортину пептида человека, включая модификацию последовательности и отдельных аминокислот белков. Модификации также включают в себя конъюгацию урокортина II и родственного урокортину пептида человека с флуоресцентными метками, комплексными радионуклидами и токсинами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Чтобы можно было достичь и подробно понять перечисленные выше особенности, преимущества и объекты изобретения, а также другие вопросы, которые станут очевидными, можно представить более конкретные описания изобретения, сущность которого кратко изложена выше, со ссылками на некоторые его варианты, которые иллюстрированы прилагаемыми чертежами. Данные чертежи образуют часть описания. Однако необходимо отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные варианты изобретения, и поэтому их не следует считать ограничивающими в данных рамках.

На фигуре 1 показана последовательность геномной ДНК человека, на основании которой спрогнозировано существование нового пептида, родственного урокортину и CRF. Геномные последовательности идентифицировали в опубликованной базе данных и использовали для расчета новой последовательности родственного урокортину пептида человека. Предполагаемым сайтом старта является положение 1, и последовательность зрелого пептида показана жирным шрифтом. Рассчитанные сайты отщепления сигнального пептида указаны стрелками.

На фигуре 2 показан предполагаемый предшественник родственного урокортину пептида человека. Подчеркнутая область представляет собой неполную последовательность кДНК, которую выделяли посредством ПЦР из библиотеки кДНК островков поджелудочной железы человека.

На фигуре 3 показано сравнение родственного урокортину пептида человека (URP) (SEQ ID No4) с человеческим Ucn (SEQ ID No:5), уротензином I (SEQ ID No:6), CRF (SEQ ID No:7), саувагином лягушки (SEQ ID No:8) и CRF/Uro морской собаки (SEQ ID No:9). Области самой высокой гомологии находятся внутри белых прямоугольников. Указано количество консервативных аминокислот.

На фигуре 4А показана выведенная аминокислотная последовательность Ucn II. Стартовый метионин, отмеченный жирным шрифтом, локализован выше кодирующей области пептида, которая ограничена рамкой. Полную нуклеотидную последовательность поместили в Genbank (инвентарный No.AF331517).

На фигуре 4В показано выравнивание Ucn II мыши (SEQ ID No:10) с гомологичными пептидами человека (SEQ ID No:11) и рыб (URP)(SEQ ID No:12) и с Ucn крысы (SEQ ID No:13) и CRF крысы/человека (SEQ ID No:14). Остатки, идентичные последовательности Ucn II мыши, ограничены рамкой. Ξ указывает сайт амидирования.

На фигурах 5А и 5В показано опосредованное родственным урокортину пептидом человека замещение ¹²⁵I-саувагина, связывающегося с CRFR1 и CRFR2β. Аффинность Ucn и пептидов URP по отношению к CRFR1 и CRFR2β, стабильно экспрессированным в клетках СНО, определяли по конкурентному замещению ¹²⁵I-саувагина. Представлены данные из 3 экспериментов, и значения константы диссоциации/ингибирования (K_i) (95% доверительный интервал) рассчитывали с использованием программы Prism.

На фигуре 6 (А-С) показана экспрессия мРНК урокортина II в головном мозге крыс. Микрофотографии в темном поле, показывающие мечение (белые гранулы), наблюдаемое в отдельных областях при использовании меченного изотопами зонда антисмысловой кРНК, полученной на основе кДНК урокортина II мыши. Позитивные сигналы гибридизации видны в паравентрикулярном ядре гипоталамуса (фигура 6, А), главным образом, в его магноцеллюлярном отделе (pm), при этом более диффузный сигнал виден в парвоцеллюлярной области (mp) и обширно в голубоватом месте (locus coeruleus) (LC; фигура 6, В), моторном ядре лицевого нерва (VII, фигура 6, С) и мозговых оболочках (men) на вентральной поверхности головного мозга. Другие сокращения: CBL, мозжечок; v3, третий желудочек; v4, четвертый желудочек. Увеличения: фигура 6, А и В, Х75; фигура 6, С, Х50.

На фигуре 7 показана авторадиограмма экспрессии родственного урокортину пептида человека в гипоталамусе примата. PVH, паравентрикулярные ядра; SO, супраоптические ядра; CN, хвостатое ядро; och, оптическая хиазма; me, средняя возвышенность; ac, передняя спайка; ic, внутренняя капсула; Sept, перегородка.

На фигурах 8 (А-F) показаны картины клеточной активации в ответ на центральную микроинъекцию урокортина II. Фигура 8, А-С и Е: Микрофотографии в светлом поле иммунопероксидазных препаратов, показывающие индуцированную экспрессию Fos у крыс, забитых через 2 часа после интрацеребровентрикульной (icv) инъекции 1 мкг синтетического урокортина II мыши. Микрофотографии в темном поле, показывающие гистохимические данные о локализации гибридизации мРНК CRF-R2 в областях, соответствующих областям, показанным на фигуре 8, С и Е, представлены на фигуре 8, D и F соответственно. Центральная инъекция урокортина II вызывает индукцию Fos, главным образом, в группе взаимосвязанных структур, участвующих в центральной автономной и нейроэндокринной регуляции, включая парвоцеллюлярный отдел паравентрикулярного ядра (фигура 8, А), центральное ядро миндалевидного тела (фигура 8, В) и ядро одиночного пути (NTS, фигура 8, С). Среди указанных структур только NTS является местом экспрессии CRF-R2 (фигура 8, D). Другие основные места экспрессии CRF-R2, включая вентромедиальное ядро гипоталамуса (фигура 8, F) не проявляют индуцированной урокортином II экспрессии Fos в исследованных пределах доз пептида (1-10 мкг). Все микрофотографии сделаны при увеличении 75Х.

На фигуре 9 показана активация центральных связанных со стрессом групп клеток после центральной инъекции родственного урокортину пептида человека посредством исследования стимуляции ядерной экспрессии FOS в терминальной полоске (stria terminalis) (BST), паравентрикулярном ядре гипоталамуса (PVH), центральном ядре миндалевидного тела (CeA), латеральном парабрахиальном ядре (PBI), голубоватом месте ((locus coeruleus) (LC)) и ядре одиночного пути (NTS). BSTov, ядро ложа stria terminalis (овальное нижнее ядро); ic, внутренняя капсула; CP, хвостатое ядро/скорлупа; ac, передняя спайка; V3, третий желудочек; AHA, передняя область гипоталамуса; pm, задняя магноцеллюлярная часть (паравентрикулярное ядро); fx, свод; CeAm, центральное ядро миндалевидного тела; BLA, базо-латеральное ядро миндалевидного тела; scp, верхняя ножка мозжечка; PBel, парабрахиальное ядро (наружная латеральная часть); V4, четвертый желудочек; ep, эпендима; AP, самое заднее поле; DMX, дорсальное моторное ядро блуждающего нерва; ts, одиночный путь; и cc, центральный канал.

На фигурах 10А и 10В показано влияние центрально введенного урокортина II на потребление пищи и общую моторную активность. На фигуре 10А показано среднее (±SEM; n=3-6 на группу) суммарное потребление пищи в ночное время (g) после icv-введения 1 мкг CRF, урокортина или урокортина II. CRF и урокортин в значительной степени снижали потребление пищи по сравнению с контролями, в которых инъецировали физиологический раствор, начиная с 4 ч после инъекции, тогда как действие урокортина II не проявлялось вплоть до 6 ч после обработки. *р< 0,002 (CRF и Ucn по сравнению с физиологическим раствором), **р< 0,002 (CRF, урокортин и урокортин II по сравнению с физиологическим раствором). На фигуре 10В показаны телеметрические измерения общей моторной активности, которые были в значительной степени повышены у животных, которые получали icv-инъекции CRF; ни урокортин, ни урокортин II не оказывали значимого влияния на моторную активность. *р< 0,001 (CRF по сравнению с физиологическим раствором).

На фигуре 11 показана стимуляция секреции АКТГ из клеток передней доли гипофиза урокортином и родственным урокортину пептидом человека. Клетки передней доли гипофиза крыс вводили в культуру и обрабатывали либо урокортином крыс, либо родственным урокортину пептидом человека. Секретированный АКТГ измеряли, используя набор (Nichols Institute Diagnostics).

На фигуре 12 показано влияние родственного урокортину пептида человека на уровни цАМФ в клетках A7R5, которые экспрессируют нативный CRF-R2β. Дозозависимое действие инкубации с урокортином (светлые кружки) или hURP (закрашенные кружки) в течение 30 минут на продукцию цАМФ. цАМФ измеряли посредством РИА (Biochemical Technologies).

На фигуре 13 показано влияние родственного урокортину пептида человека (hURP) на общую моторную активность у крыс.

На фигуре 14 показано влияние интрацеребровентрикулярной инъекции родственного урокортину пептида человека (URP) на температуру тела крыс.

На фигуре 15 показано влияние интрацеребровентрикулярной инъекции родственного урокортину пептида человека (hURP) на потребление крысами пищи в ночное время.

На фигуре 16 показана модель того, как родственный урокортину пептид человека действует на CRF-R1 и CRF-R2. Родственный урокортину пептид человека с высокой аффинностью связывается с CRF-R2, но не с CRF-R1, тогда как урокортин связывается с обоими рецепторами. CRF с высокой аффинностью связывается с CRF-R1, но не связывается с CRF-R2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно данному изобретению можно использовать традиционные способы молекулярной биологии, микробиологии и технологию рекомбинантной ДНК, разработанные в данной области. Полное объяснение таких способов имеется в литературе. Смотри, например, Maniatis, Fritsch and Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames and S.J. Higgins Eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames and S.J. Higgins Eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney ed. (1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Поэтому следующие термины, если они фигурируют в данном описании, будут иметь определения, указанные ниже.

В используемом здесь смысле термин «кДНК» будет относиться к ДНК-копии мРНК-транскрипта гена.

В используемом здесь смысле термин «выведенная аминокислотная последовательность» будет относиться к аминокислотной последовательности, определенной посредством считывания последовательности триплетов оснований нуклеотидов в кДНК.

В используемом здесь смысле термин «скрининг библиотеки» будет относиться к способу использования меченого зонда для того, чтобы при соответствующих условиях проверить, присутствует ли в конкретной библиотеке ДНК последовательность, комплементарная зонду. Кроме того, «скрининг библиотеки» можно выполнить посредством ПЦР.

В используемом здесь смысле термин «ПЦР» относится к полимеразной цепной реакции, которая является предметом патентов США № 4683195 и 4683202 Mullis, а также других модификаций, известных в настоящее время в данной области.

Все последовательности аминокислотных остатков представлены здесь формулами, в которых расположение слева направо соответствуют обычному направлению от аминоконца к карбоксильному концу. Кроме того, следует отметить, что тире в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков указывает на пептидную связь с другой последовательностью из одного или нескольких аминокислотных остатков.

Описанные здесь аминокислоты предпочтительно находятся в «L»-изомерной форме. Однако любой остаток L-аминокислоты может быть заменен остатками в «D»-изомерной формой, при условии, что требуемое функциональное свойство полипептида связываться с иммуноглобулином сохраняется. NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. COOH относится к свободной карбоксильной группе, присутствующей на карбоксильном конце полипептида.

Нестандартные аминокислоты можно включить в белки посредством химической модификации существующих аминокислот или в результате искусственного синтеза белка. Нестандартная аминокислота относится к аминокислоте, которая отличается по химической структуре от двадцати стандартных аминокислот, кодируемых генетическим кодом. Посттрансляционная модификация in vivo также может приводить к наличию нестандартной аминокислоты или производного аминокислоты в белке. N-концевые NH₂- и С-концевые СООН-группы белка также можно модифицировать в результате природной или искусственной посттрансляционной модификации белка.

Белки можно модифицировать заменами аминокислот. Часто некоторые изменения в результате приводят к значительным изменениям активности белков, тогда как другие оказывают незначительное влияние или не оказывают влияния. Менее всего вероятным является то, что консервативные замены сильно изменяют активность белка. «Консервативная аминокислотная замена» относится к замене аминокислоты химически сходной аминокислотой, т.е. замене неполярной кислоты другой неполярной аминокислотой; замене полярной аминокислоты другой полярной аминокислотой, кислых остатков другими кислыми аминокислотами, и т.д. Примеры предпочтительных консервативных замен указаны в таблице 1:

Таблица 1
Исходный остаток	Предпочтительные консервативные замены	Наиболее предпочтительная консервативная замена
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Nle	Leu
Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe; Nle	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Glu
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Nle	Leu

«Химическое производное» относится к обсуждаемому полипептиду, имеющему один или несколько остатков, химически дериватизированных в результате реакции функциональной боковой группы. Такие дериватизированные полипептиды включают, например, полипептиды, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы с целью образования гидрохлорида амина, пара-толуол сульфонильных групп, карбобензоксигрупп, трет-бутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы можно дериватизировать с образованием солей, метильных или этильных сложных эфиров или других типов сложных эфиров или гидразидов. Химические производные могут включать такие пептиды, которые содержат одно или несколько производных аминокислот природного происхождения из двадцати стандартных аминокислот. Например, серин можно заместить 4-гидроксипролином; и лизин можно заместить орнитином. Пептиды, охватываемые данным изобретением, также включают в себя пептиды, имеющие одно или несколько присоединений и/или делеций остатков по сравнению с конкретным пептидом, последовательность которого здесь указана, при условии, что модифицированный пептид сохраняет требуемую биологическую активность.

«Репликон» представляет собой любой генетический элемент (например, плазмиду, хромосому, вирус), который функционирует как автономная единица репликации ДНК in vivo; т.е. способна к репликации под своим собственным контролем.

«Вектор» является репликоном, таким как плазмида, фаг или космида, с которым может быть связан другой сегмент ДНК, для того, чтобы осуществлять репликацию связанного сегмента.

«Молекула ДНК» относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (адениновых, гуаниновых, тиминовых или цитозиновых), либо в ее однонитевой форме, либо в виде двунитевой спирали. Данный термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы, и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, этот термин включает в себя двунитевую ДНК, обнаруживаемую в числе прочего в виде линейных молекул ДНК (например, фрагментов рестрикции), вирусов, плазмид и хромосом. При обсуждении здесь структуры согласно обычной договоренности приводится только последовательность в направлении от 5' к 3' вдоль нетранслируемой нити ДНК (т.е. нить, имеющая последовательность, гомологичную мРНК).

«Начало репликации» относится к тем последовательностям ДНК, которые принимают участие в синтезе ДНК.

«Кодирующая последовательность» ДНК представляет собой последовательность двунитевой ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vivo в том случае, когда помещена под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяют по стартовому кодону на 5'-(амино)конце и стоп-кодону трансляции на 3'-(карбоксильном) конце. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничена этим, прокариотические последовательности, кДНК с эукариотической мРНК, последовательности геномной ДНК из эукариотической ДНК (например, ДНК млекопитающих) и даже синтетические последовательности ДНК. Сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, как правило, будут локализованы с 3'-стороны от кодирующей последовательности.

Транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями являются регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и тому подобное, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

«Последовательность промотора» представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности, расположенной «справа» (в 3'-направлении). В целях определения согласно данному изобретению промоторная последовательность ограничена на своем 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простирается «левее» (в 5'-направлении), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровне, выявляемом выше фона. В промоторной последовательности будет находиться сайт инициации транскрипции, а также домены, связывающие белок (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, но не всегда, содержат «ТАТА»-боксы и «САТ»-боксы. Прокариотические промоторы кроме консенсусных последовательностей -10 и -35 содержат последовательности Шайне-Далгарно.

«Последовательность регуляции экспрессии» представляет собой последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию другой последовательности ДНК. Кодирующая последовательность находится «под контролем» транскрипционных и трансляционных регуляторных последовательностей в клетке в том случае, когда РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем транслируется в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.

«Сигнальная последовательность» может быть встроена вблизи кодирующей последовательности. Указанная последовательность кодирует сигнальный пептид, N-концевой по отношению к полипептиду, который дает клетке-хозяину сигнал о направлении полипептида к поверхности клетки или секреции полипептида в среду, и указанный сигнальный пептид отрезается клеткой-хозяином перед тем, как белок покинет клетку. Сигнальные последовательности можно обнаружить связанными с различными белками, присущими прокариотам и эукариотам.

Термин «олигонуклеотид» в используемом здесь смысле по отношению к зонду согласно данному изобретению, определяют как молекулу, содержащую два или более рибонуклеотидов, предпочтительно более трех. Его точный размер будет зависеть от многих факторов, которые, в свою очередь, зависят от конечной функции и применения олигонуклеотида.

Термин «праймер» в используемом здесь смысле относится к олигонуклеотиду, либо имеющему природное происхождение как в очищенном продукте рестрикционного расщепления, либо полученному синтетическим путем, который способен действовать как точка инициации синтеза в том случае, когда он помещен в условия, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен нити нуклеиновой кислоты, т.е. в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и рН. Праймер может быть либо однонитевым, либо двунитевым, и должен иметь достаточную длину, чтобы праймировать синтез требуемого продукта удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймера будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и применение способа. Например, для диагностических применений в зависимости от сложности последовательности-мишени олигонуклеотидный праймер обычно содержит 15-25 или более нуклеотидов, хотя он может содержать меньшее количество нуклеотидов.

Здесь выбраны праймеры в «значительной степени» комплементарные разным нитям конкретной последовательности ДНК-мишени. Это значит, что праймеры должны быть в значительной степени комплементарными для того, чтобы гибридизоваться с соответствующими им нитями. Следовательно, последовательность праймера не должна отражать точную последовательность матрицы. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть связан с 5'-концом праймера, при этом остальная часть последовательности праймера комплементарна нити. Альтернативно некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть рассеяны в праймере, при условии, что последовательность праймера в достаточной степени комплементарна последовательности или гибридизуется с ней и таким образом образует матрицу для синтеза продукта удлинения.

В используемом здесь смысле термины «эндонуклеазы рестрикции» и «ферменты рестрикции» относятся к ферментам, каждый из которых разрезает двунитевую ДНК в конкретной нуклеотидной последовательности или вблизи нее.

Клетка «трансформирована» экзогенной или гетерологичной ДНК в том случае, когда ДНК была введена внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может быть интегрирована (ковалентно связана) или не интегрирована в геном клетки. Например, у прокариот, дрожжей и в клетках млекопитающих трансформирующая ДНК может поддерживаться в эписомном элементе, таком как плазмида. Что касается эукариотических клеток, стабильно трансформированная клетка представляет собой клетку, в которой трансформирующая ДНК оказалась интегрированной в хромосому, так что наследуется дочерними клетками посредством репликации хромосомы. Об указанной стабильности свидетельствует способность эукариотической клетки формировать линии или клоны клеток, состоящие из популяции дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК. «Клон» является популяцией клеток, полученных от одной клетки или предшественника путем митоза. «Линия клеток» является клоном первичной клетки, которая способна стабильно расти in vitro в течение многих поколений.

Две последовательности ДНК «в значительной степени гомологичны» в том случае, когда, по меньшей мере, примерно 75% (предпочтительно, по меньшей мере, примерно 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% или 95%) нуклеотидов совпадают на протяжении определенной длины последовательностей ДНК. Последовательности, которые гомологичны в значительной степени, можно идентифицировать посредством сравнения с использованием стандартной компьютерной программы последовательностей, имеющихся в банках данных последовательностей, или в эксперименте по Саузерн-гибридизации, например, в жестких условиях, которые определяют для данной конкретной системы. Определение соответствующих условий гибридизации известно специалистам в данной области. Смотри, например, Maniatis et al., выше; DNA Cloning, Vols I and II, выше; Nucleic Acid Hybridization, выше.

Гетерологичная область конструкции ДНК является идентифицируемым сегментом ДНК в большей по размеру молекуле ДНК, который в природе не выявляется связанным с большей молекулой. Таким образом, в том случае, когда гетерологичная область кодирует ген млекопитающих, ген, как правило, будет фланкирован ДНК, которая не фланкирует геномную ДНК млекопитающих в геноме исходного организма. В другом примере кодирующая последовательность является конструкцией, в которой сама кодирующая последовательность не выявляется в природе (например, кДНК, когда геномная кодирующая последовательность содержит интроны, или синтетические последовательности, имеющие кодоны, отличные от кодонов нативного гена). Алелльные варианты или мутационные события природного происхождения не вызывают п