Выделенный растворимый il-20 рецептор (варианты)

Выделенный растворимый il-20 рецептор (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описания всех цитируемых здесь ссылок включены в их полном виде в качестве ссылки.

Цитокины являются растворимыми белками, которые влияют на рост и дифференцировку многих типов клеток. Их рецепторы состоят из одного или нескольких интегральных мембранных белков, которые связывают цитокин с высокой аффинностью и трансдуцируют это событие связывания в клетку через цитоплазматические части определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокинов были сгруппированы в несколько классов на основе сходства в их связывающих внеклеточный лиганд доменах. Например, цепи рецепторов, ответственные за связывание и/или трансдукцию эффекта интерферонов (IFN), являются членами семейства рецепторов цитокинов типа II (CRF2), на основе характерного состоящего из 200 остатков внеклеточного домена. Демонстрированные in vivo активности этих интерферонов иллюстрируют огромный клинический потенциал и потребность в других цитокинах, агонистах цитокинов и антагонистах цитокинов. Некоторые цитокины участвуют в воспалительном каскаде и могут стимулировать такие заболевания, как ревматоидный артрит, болезнь Крона, псориаз, сердечное заболевание и т.д. Таким образом, существует потребность в обнаружении цитокинов и их рецепторов, которые участвуют в воспалении. Затем можно использовать выделенные растворимые рецепторы цитокина для ингибирования опосредованного этим цитокином воспаления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1-8 представляют схематическое представление различных вариантов растворимого рецептора по данному изобретению.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение удовлетворяет указанную потребность обеспечением вновь обнаруженного растворимого рецептора интерлейкина-20 (IL-20). Этот растворимый рецептор может быть использован для даун-регуляции (понижающей регуляции) IL-20 и, следовательно, лечения воспалительных заболеваний, таких как псориаз и воспалительные заболевания легких.

IL-20 был прежде назван 'Zcyto 10' (Международная патентная публикация № WO 99/27103) и имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-9. Рецептор для IL-20 состоит из двух цепей, альфа-цепи и бета-цепи. Альфа-цепь, далее называемая IL-20RA, прежде называлась ZcytoR7. См. Патент США №5945511. Бета-цепь, далее называемая IL-20RB, прежде называлась DIRS1. См. Международную Патентную Заявку №PCT/US99/03735. Данное изобретение представляет растворимый рецептор, состоящий из внеклеточного домена IL-20RA и внеклеточного домена IL-20RB.

Данное изобретение включает в себя выделенный растворимый рецептор, состоящий из субъединицы 'IL-20RA' и субъединицы 'IL-20RB', где субъединица IL-20RA состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 38, 55, 63 и 65, а субъединица IL-20RB состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:15, 59, 61, 67, 68 и 69. Субъединицы IL-20RA и IL-20RB обычно связаны вместе полипептидным линкером. Связывание может быть с использованием любого способа, но обычно осуществляется пептидной связью или дисульфидной связью между полипептидом, связанным с субъединицей IL-20RA, и полипептидом, связанным с субъединицей IL-20RB. Данное изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют новые полипептиды IL-20RA и IL-20RB данного изобретения.

В одном варианте субъединица IL-20RA слита с константной областью молекулы иммуноглобулина (Ig) или ее частью, а субъединица IL-20RB слита с константной областью легкой цепи молекулы Ig таким образом, что константная область легкой цепи связана дисульфидной связью с константной областью тяжелой цепи, обычно с остатком цистеина на шарнирной области тяжелой цепи. Может быть и наоборот, т.е. субъединица IL-20RA может быть слита с константной областью легкой цепи молекулы Ig, а субъединица IL-20RB может быть слита с константной областью тяжелой цепи молекулы Ig.

В одном варианте растворимого рецептора данного изобретения субъединица IL-20RA, слитая с константной областью тяжелой цепи, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:23, 53, 54 и 62, а субъединица IL-20RB, слитая с константной областью легкой цепи молекулы Ig, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:21, 57, 58 и 60.

Заявлен также белок, имеющий первый полипептид и второй полипептид, где первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:66, а второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:70 и 71. Полученный белок может быть использован для генерирования антител к субъединице IL-20RA и субъединице IL-20RB.

Определения

Перед более подробным изложением данного изобретения для его понимания может быть полезным определение следующих терминов.

Термины "амино-концевое" и "карбокси-концевое" используют здесь для обозначения положений в полипептидах. В тех случаях, когда это позволяет контекст, эти термины используют со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, определенная последовательность, расположенная карбокси-терминально относительно ссылочной последовательности в полипептиде, расположена проксимально к карбоксильному концу ссылочной последовательности, но не находится обязательно на карбоксильном конце полного полипептида.

В применении здесь, термин "слитый с антителом белок" относится к рекомбинантной молекуле, которая содержит компонент антитела и терапевтический агент. Примеры терапевтических агентов, пригодных для таких слитых белков, включают в себя иммуномодуляторы ("слитый белок антитело-иммуномодулятор") и токсины ("слитый белок антитело-токсин").

Термин "пара комплемент/антикомплемент" обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой полинуклеотид/антисмысловой полинуклеотид и т.п. Если желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент имеет аффинность связывания <10⁹ М^-1.

Термин "комплементы полинуклеотидной молекулы" обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую комплементарную последовательность оснований и обратную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5' ATGCACGGG 3' является комплементарной 5' CCCGTGCAT 3'.

Термин "контиг" обозначает полинуклеотид, который имеет смежный отрезок идентичной или комплементарной последовательности в отношении другого полинуклеотида. Говорят, что смежные последовательности (контиги) "перекрывают" конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности либо в их полном виде, либо вдоль частичного отрезка данного полинуклеотида. Например, репрезентативными контигами полинуклеотидной последовательности 5'-ATGGCTTAGCTT-3' являются последовательность 5'-TAGCTTgagtct-3' и 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Термин "вырожденная нуклеотидная последовательность" обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. каждый из триплетов GAU и GAC кодирует Asp).

Термин "экспрессирующий вектор" используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные сегменты включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и могут также включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих.

Термин "выделенный", в применении к полинуклеотиду, обозначает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация связанных районов будет очевидной лицу с обычной квалификацией в данной области (см., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

"Выделенным" полипептидом или белком является полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например, отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме, выделенный полипептид является по существу не содержащим других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 95%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте, термин "выделенный" не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы.

Термин "функционально (оперативно) связанные", при ссылке на ДНК-сегменты, указывает, что эти сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей, например, транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора.

Термин "полинуклеотид" обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются в парах нуклеотидов (сокращенно "п.н."), нуклеотидах ("нт") или тысячах пар нуклеотидов ("т.п.н."). Там, где позволяет контекст, два последних термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При использовании этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения всей длины, и он, как будет понятно, является эквивалентным термину "пары оснований". Специалистам в данной области будет понятно, что эти две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть ступенчатыми как результат ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида могут быть спаренными. Подобные неспаренные концы обычно не превышают 20 нуклеотидов в длину.

"Полипептид" является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют "пептидами".

Термин "промотор" используется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНК-полимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5'-некодирующих районах генов.

"Белок" обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные компоненты могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но тем не менее они могут присутствовать.

Термин "рецептор" используется здесь для обозначения связанного в клеткой белка, который связывается с биоактивной молекулой ("лигандом") и опосредует действие этого лиганда на клетку. Мембраносвязанные рецепторы характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в передаче (трансдукции) сигнала. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом (доменами) и другой молекулой (молекулами) в клетке. Это взаимодействие, в свою очередь, приводит к изменениям в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. Обычно, рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными, мономерными (например, рецептор тиреоидстимулирующего гормона, рецептор β-адренергического гормона) или мультимерными (например, PDGF-рецептор, рецептор гормона роста, IL-3-рецептор, GM-CSF-рецептор, G-CSF-рецептор, рецептор эритропоэтина и IL-6-рецептор).

Термин "секреторная сигнальная последовательность" обозначает здесь последовательность ДНК, которая кодирует полипептид ("секреторный полипептид"), который, как компонент большего полипептида, направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь.

Термин "сплайсинговый вариант" используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибированных из гена. Сплайсинговая вариация возникает природно посредством использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК, или менее обычно между раздельно транскрибируемыми молекулами РНК, и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин сплайсинговый вариант используют здесь также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена.

Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как "около" Х или "приблизительно" X, указанная величина Х должна пониматься как величина, определенная с точностью до ±10%.

Как указывалось выше, IL-20 (ранее называемый Zcyto10) является определенным, и способы получения IL-20 и антител к IL-20 описаны в Международной Патентной Заявке №PCT/US98/25228, публикации № WO 99/27103, опубликованной 25 ноября 1998 года, и Патентной Заявке США №09/313 458, поданной 17 мая 1999 года. Полинуклеотид и полипептид IL-20 человека представлены SEQ ID NO: 1-4, а IL-20 мыши SEQ ID NO:5-9.

Был обнаружен рецептор для IL-20, и он является гетеродимером, состоящим из полипептида, называемого 'IL-20RA' (прежде называемого Zcytor7), и полипептида, называемого 'IL-20RB'. Полипептид IL-20RA, нуклеиновая кислота, кодирующая его, антитела к IL-20RA и способы его получения описаны в Патенте США №5945511, выданном 31 августа 1999 года. SEQ ID NO:10-12 являются полинуклеотидами и полипептидами IL-20RA. Внеклеточный домен IL-20RA человека состоит из полипептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 12, 55, 63 и 65, причем полноразмерная субъединица рецептора состоит из SEQ ID NO:11. Внеклеточный домен мышиного IL-20RA представляет собой SEQ ID NO:38, причем SEQ ID NO:37 является полной мышиной субъединицей IL-20RA.

Внеклеточный домен 1L-20RB (SEQ ID NO:13-14 и вариантные SEQ ID NO:18 и 19) состоит из полипептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 15, 59, 61, 67, 68 и 69. Предпочтительно, внеклеточный домен полипептида IL-20RA и внеклеточный домен полипептида 1L-20RB ковалентно связаны друг с другом. В предпочтительном варианте внеклеточный полипептид одной субъединицы имеет константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с его карбокси-концом, а другая внеклеточная субъединица имеет константную область легкой цепи иммуноглобулина (Ig), слитую с ее карбокси-концом, так что оба эти полипептида объединяются вместе с образованием растворимого рецептора и между тяжелой и легкой цепями Ig образуется дисульфидная связь. В другом способе, пептидный линкер мог бы быть слит с двумя карбокси-концами полипептидов с образованием ковалентно связанного растворимого рецептора.

Последовательности SEQ ID NO:22 и 23 являются конструкциями внеклеточного домена IL-20RA, слитого с мутированной константной областью иммуноглобулина гамма 1 человека, полученными в соответствии с процедурой, описанной в примере 5. SEQ ID NO:62 является предсказанной зрелой последовательностью без сигнальной последовательности. SEQ ID NO:20 и 21 являются конструкциями внеклеточного домена 1L-20RB, слитого с константной областью дикого типа легкой цепи каппа иммуноглобулина человека, полученными в соответствии с процедурой примера 5. SEQ ID NO:60 является предсказанной зрелой последовательностью без сигнальной последовательности. Фиг.1 изображает гетеротетрамер, полученный в примере 5.

SEQ ID NO:52 и 53 являются конструкциями внеклеточного домена IL-20RA, слитыми с мутированной константной областью иммуноглобулина гамма 1 человека, полученными в соответствии с процедурой, описанной в примере 12. SEQ ID NO:54 является предсказанной зрелой последовательностью без сигнальной последовательности. SEQ ID NO:56 и 57 являются конструкциями внеклеточного домена IL-20RB, слитого с константной областью дикого типа легкой цепи каппа иммуноглобулина человека, полученными в соответствии с процедурой примера 12. SEQ ID NO:58 является предсказанной зрелой последовательностью без сигнальной последовательности. Полученный гетеротетрамер является почти идентичным гетеротетрамеру, полученному в примере 5, причем первичным отличием является отсутствие полипептидного линкера между внеклеточными доменами и началом константных областей Ig, 22 на фиг.1. В дальнейшем, термин "внеклеточный домен рецептора" означает внеклеточный домен рецептора или часть внеклеточного домена, которая является необходимой для связывания с его лигандом, причем в данном случае лиганд представляет собой IL-20.

Можно связать вместе внеклеточные домены IL-20RA и IL-20RB рядом способов таким образом, что полученный растворимый рецептор связывается с IL-20. Фиг.1-8 иллюстрируют репрезентативный ряд вариантов данного изобретения. Общие элементы в каждом из чертежей указываются одной и той же цифрой. Фиг.1 представляет вариант данного изобретения, полученный в соответствии с примером 5 ниже. Конструкция растворимого рецептора, обозначенная цифрой 10, состоит из двух полипептидных цепей сайта связывания IL-20, обозначенных 12 и 14. Каждый сайт связывания состоит из внеклеточного домена IL-20RA, обозначенного 16, и внеклеточного домена IL-20RB, обозначенного 18.

Внеклеточный домен, 16, IL-20RA связан с одним константным тяжелым (СН1) доменом (20) константной области тяжелой цепи иммуноглобулина гамма 1 человека через линкер 22, который представляет собой SEQ ID NO:72. Затем СН1-домен, 20, связан с Cl-12-доменом, 24, через шарнирный район 23. СН2-домен, 24, связан с СН3-доменом, 26, через шарнирный район 25.

В сравнении конструкции фиг.1 с SEQ ID NO:22, внеклеточный домен, 16, IL-20RA простирается от аминокислотного остатка 36, валина, до (и включительно) аминокислотного остатка 249, глутамина последовательности SEQ ID NO:22. Полипептидный линкер 22 простирается от аминокислотного остатка 250, глицина, до (и включительно) аминокислотного остатка 264, серина, SEQ ID NO:22. СН1-домен, 22, фиг.1 простирается от аминокислотного остатка 265, аланина, до (и включительно) аминокислотного остатка 362, валина, SEQ ID NO:22. Шарнирный район 23 фиг.1 простирается от аминокислотного остатка 363, глутаминовой кислоты, до (и включительно) аминокислотного остатка 377, пролина, SEQ ID NO:22. Цепи 12 и 14 связаны одна с другой дисульфидными связями посредством дисульфидных связей 28 и 30. Эти дисульфидные связи образованы между тяжелыми цепями цистеиновыми остатками в положениях 373 и 376 SEQ ID NO:22 каждой из двух тяжелых цепей.

Внеклеточный домен, 18, IL-20RB связан с тяжелой областью легкой цепи каппа (CL) человека, 34 фиг.1, через полипептидный линкер 32, который представляет собой полипептид SEQ ID NO:72. Внеклеточный домен, 18, IL-20RB простирается от аминокислотного остатка 30, валина, до (и включительно) аминокислотного остатка 230, аланина, SEQ ID NO:20. Полипептидный линкер, 32, простирается от аминокислотного остатка 231, глицина, до (и включительно) аминокислотного остатка 245, серина, SEQ ID NO:20. Константная область легкой цепи каппа, 34, простирается от аминокислотного остатка 246, аргинина, до (и включительно) конечного аминокислотного остатка 352, цистеина, последовательности SEQ ID NO:20. Цистеин в положении 352 SEQ ID NO:20 образует дисульфидную связь, 36 на фиг.1, с цистеином в положении 367 SEQ ID NO:22. Таким образом, константная область легкой цепи 34 связана с шарнирным районом 23 дисульфидной связью 36. Таким образом внеклеточный домен, 16, IL-20RA связан с внеклеточным доменом, 18, IL-20RB с образованием растворимого рецептора.

Если остатки цистеина в положениях 373 и 376 SEQ ID NO:22 заменяли на отличающиеся аминокислотные остатки, два IL-20-связывающих полипептида, 12 и 14, не могли быть связаны дисульфидными связями вместе и образовывали конструкцию, показанную на фиг.2, имеющую шарнирный район 27.

Фиг.3 показывает очень простой растворимый рецептор 38 данного изобретения, в котором внеклеточный домен, 16, IL-20RA связан с внеклеточным доменом, 18, IL-20RB посредством полипептидного линкера, 40. Полипептидный линкер простирается от амино-конца внеклеточного домена, 16, IL-20RA и соединен с карбоксильным концом внеклеточного домена, 18, IL-20RB. Полипептидный линкер должен иметь длину между 100-240 аминокислот, предпочтительно приблизительно длину 170 аминокислот. Подходящий линкер мог бы содержать остатки глицина и серина. Возможный линкер мог бы быть множественными единицами SEQ ID NO:72, предпочтительно приблизительно 12 единицами.

Фиг.4 показывает вариант, который имеет внеклеточный домен, 16, IL-20RA, связанный с внеклеточным доменом, 18, IL-20RB посредством линкера 40, как на фиг.3. Хотя внеклеточный домен, 16, IL-20RA связан с СH1-доменом, 20, как на фиг.1, посредством полипептидного линкера 42, который должен иметь длину приблизительно 30 аминокислотных остатков. Идеальный линкер мог бы состоять из глицина и серина, как в SEQ ID NO:72, и шарнирной последовательности 23 фиг.1.

Фиг.5 показывает возможный вариант данного изобретения. В этом варианте полипептидный линкер 44 из приблизительно 15 аминокислотных остатков, например, SEQ ID NO:72, связывает карбоксил-конец внеклеточного домена, 18, IL-20RB с амино-концом внеклеточного домена, 16, IL-20RA. Полипептидный линкер 46 из приблизительно 30 аминокислотных остатков простирается от карбокси-конца внеклеточного домена, 16, IL-20RA до СН2-домена. Карбоксильный конец линкера 46 предпочтительно содержит шарнирный район, простирающийся от аминокислотного остатка 363, глутаминовой кислоты, до (и включительно) аминокислотного остатка 377, пролина, последовательности SEQ ID NO:22. Тем не менее, полипептидный линкер 46 в идеале имеет по меньшей мере один остаток цистеина на его карбоксильном конце, так что может образовываться дисульфидная связь.

Растворимый IL-20-рецептор фиг.6 идентичен рецептору фиг.1, за исключением того, что СН3-домен, 26 фиг.1, не присутствует в варианте фиг.6. СН3-район начинается при аминокислотном остатке 488, глицине, и простирается до последнего остатка 594 SEQ ID NO:22.

Фиг.7 показывает конструкцию IL-20-рецептора, которая идентична конструкции фиг.1, за исключением того, что отсутствуют оба домена СН2 и СН3. Домены СН2 и СН3 идут от аминокислотного остатка 378, аланина, до конца полипептидной последовательности SEQ ID NO:22.

Фиг.8 показывает конструкцию, в которой как IL-20RA, 16, так и IL-20RB имеют полипептидный линкер, 48, слитый с их соответствующими карбоксильными концами. Каждый полипептидный линкер имеет два остатка цистеина, так что, когда они экспрессируются, эти цистеины образуют дисульфидные связи, 50 и 52. В этом случае полипептидный линкер содержит шарнирный район, 23 на фиг.1. Шарнирный район состоит из аминокислотных остатков 363, глутамина, и до (и включительно) аминокислотного остатка 377 SEQ ID NO:22.

В другом аспекте данного изобретения представлен способ получения растворимого рецептора, состоящего из внеклеточных доменов IL-20RA и IL-20RB, предусматривающий (а) введение в клетку-хозяина первой ДНК-последовательности, состоящей из транскрипционного промотора, функционально связанного с первой секреторной сигнальной последовательностью, с последующими, расположенными по ходу транскрипции (справа) и в правильной рамке считывания ДНК-последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть IL-20RA, и ДНК-последовательностью, которая кодирует константную область легкой цепи иммуноглобулина; (b) введение в клетку-хозяина второй ДНК-конструкции, состоящей из транскрипционного промотора, функционально связанного со второй секреторной сигнальной последовательностью, с последующими, расположенными по ходу транскрипции (справа) и в правильной рамке считывания ДНК-последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть IL-20RB, и ДНК-последовательностью, которая кодирует домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из С_н1, С_н2, С_н3 и С_н4; (с) выращивание клетки-хозяина в подходящей среде для выращивания при физиологических условиях, позволяющих секрецию слитого белка, состоящего из внеклеточного домена IL-20RA и IL-20RB; и (d) выделение этого полипептида из клетки-хозяина. В одном варианте вторая ДНК-последовательность дополнительно кодирует шарнирный район тяжелой цепи иммуноглобулина, где этот шарнирный район присоединен к указанному домену константной области тяжелой цепи. В другом варианте вторая ДНК-последовательность дополнительно кодирует вариабельную область иммуноглобулина, присоединенную против хода транскрипции (слева) от константной области тяжелой цепи иммуноглобулина и в правильной рамке считывания с ней.

В альтернативном варианте представлен способ получения растворимого рецептора, состоящего из внеклеточных доменов IL-20RA и IL-20RB, предусматривающий (а) введение в клетку-хозяина первой ДНК-последовательности, состоящей из транскрипционного промотора, функционально связанного с первой секреторной сигнальной последовательностью, с последующими, расположенными по ходу транскрипции (справа) и в правильной рамке считывания ДНК-последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть IL-20RB, и ДНК-последовательностью, которая кодирует константную область легкой цепи иммуноглобулина; (b) введение в клетку-хозяина второй ДНК-конструкции, состоящей из транскрипционного промотора, функционально связанного со второй секреторной сигнальной последовательностью, с последующими, расположенными по ходу транскрипции (справа) и в правильной рамке считывания ДНК-последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть IL-20RA, и ДНК-последовательностью, которая кодирует домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из С_н1, С_н2, С_н3 и С_н4; (с) выращивание клетки-хозяина в подходящей среде для выращивания при физиологических условиях, позволяющих секрецию димеризованного гетеродимерного слитого белка, состоящего из внеклеточного домена IL-20RA и IL-20RB; и (d) выделение этого димеризованного полипептида из клетки-хозяина. В одном варианте вторая ДНК-последовательность дополнительно кодирует шарнирный район тяжелой цепи иммуноглобулина, где этот шарнирный район присоединен к указанному домену константной области тяжелой цепи. В другом варианте вторая ДНК-последовательность дополнительно кодирует вариабельную область иммуноглобулина, присоединенную против хода транскрипции (слева) от константной области тяжелой цепи иммуноглобулина и в правильной рамке считывания с ней. (См. патент США №5843725).

Полинуклеотид, обычно кДНК-последовательность, кодирует описанные здесь полипептиды. кДНК-последовательность, которая кодирует полипептид данного изобретения, состоит из ряда кодонов, причем каждый аминокислотный остаток полипептида кодируется кодоном и каждый кодон состоит из трех нуклеотидов. Аминокислотные остатки кодируются их соответствующими кодонами следующим образом.

Аланин (Ala) кодируется GCA, GCC, GCG или GCT.

Цистеин (Cys) кодируется TGC или TGT.

Аспарагиновая кислота (Asp) кодируется GAC или GAT.

Глутаминовая кислота кодируется GAA или GAG.

Фенилаланин (Phe) кодируется ТТС или ТТТ.

Глицин (Gly) кодируется GGA, GGC, GGG или GGT.

Гистидин (His) кодируется САС или CAT.

Изолейцин (Ile) кодируется АТА, АТС или АТТ.

Лизин (Lys) кодируется ААА или AAG.

Лейцин (Leu) кодируется ТТА, TTG, СТА, СТС, CTG или

СТТ.

Метионин (Met) кодируется ATG.

Аспарагин (Asn) кодируется ААС или ААТ.

Пролин (Pro) кодируется ССА, ССС, CCG или ССТ.

Глутамин (Gln) кодируется САА или CAG.

Аргинин (Arg) кодируется AGA, AGG, CGA, CGC, CGG или

CGT.

Серин (Ser) кодируется AGC, AGT, TCA, TCC, TCG или ТСТ.

Треонин (Thr) кодируется АСА, АСС, ACG или ACT.

Валин (Val) кодируется GTA, GTC, GTG или GTT.

Триптофан (Тгр) кодируется TGG.

Тирозин (Туг) кодируется ТАС или TAT.

Должно быть понятно, что в соответствии с данным изобретением, когда заявляется полинуклеотид, как описано здесь, следует понимать, что заявляется тем самым смысловая цепь, антисмысловая цепь и ДНК в виде двухцепочечной ДНК, имеющей как смысловую, так и антисмысловую цепь, отожженные (гибридизованные) вместе посредством их соответствующих водородных связей. Заявляется также мессенджер-РНК (мРНК), которая кодирует полипептиды данного изобретения и которая кодируется описанной здесь кДНК. Мессенджер РНК (мРНК) будет кодировать полипептид с использованием тех же самых кодонов, что и кодоны, определенные здесь, за исключением того, что каждый нуклеотид тимин (Т) заменен нуклеотидом урацилом (U).

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды могут проявлять "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов". В общем, см., Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-1912, 1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6: 315-324, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13: 355-364, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-3087, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-597, 1982. В применении здесь, термин "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов" или "предпочтительные (преферентивные) кодоны" является термином данной области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту. Например, аминокислота треонин (Thr) может кодироваться АСА, АСС, ACG или ACT, но в клетках млекопитающих наиболее обычно используемым кодоном является АСС; в других видах, например, в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны Thr. Предпочтительные кодоны для конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами, известными в данной области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы для экспрессии в различных видах и тестированы на функциональность, как описано здесь.

Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенсмутации, проводят обычно в бесклеточной системе, содержащей экстракт Е. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991); Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991); Chung et al., Science 259:806-809 (1993) и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-1019 (1993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК, Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-19998 (1996). В третьем способе клетки Е. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, которую предстоит заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желательной природно не встречающейся аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Природно не встречающаяся аминокислота включается в этот белок вместо ее природной копии. См. Koide et al., Biochem. 33:7470-3476 (1994). Природно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть превращены в природно не встречающиеся разновидности химической модификацией in vitro. Химическая модификация может комбинироваться с сайт-направленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен, Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403 (1993).

Аминокислотные остатки могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся в природе аминокислот и неприродных аминокислот.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах данного изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-502 (1991). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-708, 1996. Сайты лиганд-рецепторного взаимодействия могут быть также определены физическим анализом структуры, как определено такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, вместе с мутацией предполагаемого сайта контакта аминокислот. См., например, de Vos et al., Science 255:306-312 (1992); Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992); Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64 (1992).

Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-57 (1988) или Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 (1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора на функциональный полипептид и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового представления, например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837 (1991); Ladner et al., U.S. Patent No. 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204, и район-направленный мутагенез, Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986); Ner et al., DNA 7:127 (1988).

Варианты описанных последовательностей ДНК и полипептидных последовательностей IL-20, IL-20RA и IL-20RB могут быть образованы перетасовкой ДНК, описанной Stemmer, Nature 370: 389-391 (1994), Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-107751 (1994) и в международной публикации WIPO Publication WO 97/20078. Вкратце, вариантные ДНК генерируют посредством гомологичной рекомбинации in vitro случайной фрагментацией исходной ДНК с последующей повторной сборкой при помощи ПЦР, приводящей к случайно введенным точковым мутациям. Этот способ может быть модифицирован с использованием семейства исходных молекул ДНК, таких как аллельные варианты или молекулы ДНК из различных видов, для введения дополнительной вариабельности в этот процесс. Отбор или скрининг на желательную активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и анализа обеспечивает быструю "эволюцию" последо