Факторы, действующие на активность фермента, высвобождающего рецептор фактора некроза опухолей

Факторы, действующие на активность фермента, высвобождающего рецептор фактора некроза опухолей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка заявляет эффект приоритета заявки США 09/081385, поданной 14 мая 1998, находящейся в процессе одновременного рассмотрения. Для целей ведения дела в США приоритет указанной заявки включен тем самым здесь в качестве полной ссылки.

Данное изобретение относится в общем к области трансдукции сигналов (передачи сигналов) между клетками, через цитокины и их рецепторы. Более конкретно, оно относится к ферментативной активности, которая расщепляет и высвобождает рецептор для TNF, обнаруженный на клеточной поверхности, и последующим биологическим эффектам. Определенными вариантами осуществления данного изобретения являются композиции, которые влияют на подобную ферментативную активность и могут быть включены в лекарственные средства для лечения заболеваний.

Цитокины играют центральную роль в коммуникации между клетками. Секреция цитокина из одной клетки в ответ на стимул может стимулировать соседнюю клетку к подходящему биологическому ответу - такому как стимуляция, дифференцировка или апоптоз. Высказывается гипотеза, что на важные биологические события может влиять не только высвобождение цитокинов из первой клетки, но также связывание с рецепторами на второй клетке, которое опосредует последующий ответ. Данное изобретение, описанное в этой патентной заявке, обеспечивает новые соединения для воздействия на трансдукцию сигнала от фактора некроза опухолей.

Цитокин, известный как фактор некроза опухолей (TNF или TNF-α), является структурно родственным лимфотоксину (LT или TNF-β). Они имеют около 40 процентов гомологии аминокислотной последовательности (Old, Nature 330:602-603, 1987). Эти цитокины высвобождаются макрофагами, моноцитами и природными клетками-киллерами и играют роль в воспалительных и иммунологических событиях. Эти два цитокина вызывают широкий спектр эффектов как in vitro, так и in vivo, в том числе (i) васкулярный тромбоз и некроз опухолей; (ii) воспаление; (iii) активацию макрофагов и нейтрофилов; (iv) лейкоцитоз; (v) апоптоз и (vi) шок. TNF связывали с разнообразными патологическими состояниями, в том числе с различными формами рака, артритом, псориазом, эндотоксиновым бактериально-токсическим шоком, сепсисом, аутоиммунными заболеваниями, инфекциями, ожирением и кахексией. TNF, по-видимому, играет роль в трех факторах, способствующих регуляции веса тела: потреблении, расходовании и накоплении энергии (Rothwell, Int. J. Obesity 17:S98-S101, 1993). В случае септицемии увеличенные концентрации эндотоксина, по-видимому, повышают уровни TNF (Beutler et al., Science 229:869-871, 1985).

Делались попытки изменения хода заболевания лечением пациента ингибиторами TNF, с варьирующимися степенями успеха. Например, ингибитор TNF дексанабинол обеспечивал защиту против опосредованных TNF действий после травматического повреждения головного мозга (Shohami et al., J. Neuroimmun. 72:169-77, 1997). Некоторое улучшение при болезни Крона было получено лечением антителами против TNF (Neurath et al., Eur. J. Immun. 27:1743-50, 1997).

TNF и LT человека опосредуют их биологические активности связыванием специфически с двумя различными гликопротеиновыми рецепторами плазматической мембраны (с размерами 55 кДа и 75 кДа, известными как TNF-R р55 и TNF-R р75 соответственно). Эти два рецептора имеют 28%-ную гомологию аминокислотной последовательности в их внеклеточных доменах, которые состоят из четырех повторяющихся обогащенных цистеинами районов (Tartaglia and Goeddel, Immun. Today 13:151-153, 1992). Однако эти рецепторы не имеют значимой гомологии последовательности в их внутриклеточных доменах и опосредуют различные внутриклеточные ответы на активацию рецепторов. В соответствии с различными активностями TNF и LT большая часть клеток человека экспрессирует низкие уровни рецепторов TNF: приблизительно 2000-10000 рецепторов на клетку (Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3127-3131, 1990).

На экспрессию рецепторов TNF как на лимфоидных, так и на нелимфоидных клетках можно подействовать экспериментально многими различными агентами, такими как бактериальный липополисахарид (ЛПС), форболмиристатацетат (диэфир форбола, ФМА; активатор протеинкиназы С), интерлейкин-1 (IL-1), интерферон-гамма (IFN-γ) и IL-2 (Gatanaga et al., Cell Immunol. 138:1-10, 1991; Yui et al., Placenta 15:819-835, 1994). Было показано, что комплексы TNF человека, связанные с его рецептором, интернализуются из клеточной мембраны, и затем рецептор подвергается либо деградации, либо рециркуляции (Armitage, Curr. Opin. Immunol. 6:407-413, 1994). Было сделано предположение, что активность рецептора TNF может модулироваться при помощи пептидов, которые связываются внутриклеточно с этим рецептором или которые связываются с сайтом связывания лиганда, или которые действуют на выделение рецептора из клетки. См., например, патентные публикации WO 95/31544, WO 95/33051, WO 96/06142 и ЕР 568 925.

TNF-связывающие белки (TNF-BP) были идентифицированы при повышенных уровнях в сыворотке и моче лихорадящих пациентов, пациентов с почечной недостаточностью и раковых пациентов и даже некоторых здоровых индивидуумов. Опухоли головного мозга и яичников человека продуцировали высокие уровни TNF-BP в сыворотке. Эти молекулы были очищены, охарактеризованы и клонированы (Gatanaga et al., Lymphokine Res. 9:225-229, 1990a; Gatanaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8781-8784, 1990b). TNF-BP человека состоит из белков 30 кДа и 40 кДа, которые идентичны N-концевым внеклеточным доменам TNF-рецепторов р55 и р75 соответственно (Патент США 5395760; ЕР 418-014). Такие белки были предложены для применения в лечении эндотоксинового бактериально-токсического шока. Mohler et al., J. Immunol. 151:1548-1561, 1993.

Имеется несколько механизмов, возможных для продуцирования секретируемых белков, сходных с мембраносвязанными рецепторами. Один из них включает в себя трансляцию из альтернативно сплайсированных мРНК, не имеющих трансмембранного и цитоплазматического районов. Другой включает в себя протеолитическое расщепление интактных мембранных рецепторов с последующим выделением расщепленного рецептора из клетки. Растворимая форма TNF-R р55 и р75, по-видимому, не образуется из сплайсинга мРНК, так как in vitro в клетках человека может быть детектирована только полноразмерная мРНК рецептора (Gatanaga et al., 1991). Карбокси-концевое секвенирование и исследования мутаций на TNF-R р55 человека показывает, что между остатками Asn 172 и Val 173 может существовать сайт расщепления (Gullberg et al., Eur. J. Cell. Biol. 58:307-312, 1992).

Имеются сообщения, что специфический ингибитор металлопротеазы, ингибитор протеазы TNF-α (TAPI), блокирует выделение растворимых TNF-R р75 и р55 (Crowe et а1., J. Exp. Med. 181:1205-1210, 1995; Mullberg et al., J. Immunol. 155:5198-5205, 1995). Процессинг про-TNF на клеточной мембране с высвобождением лиганда TNF, по-видимому, зависит от фермента, подобного металлопротеазе матрикса (Gearing et al., Nature 370:555-557, 1994). Именно семейство структурно родственных деградирующих матрикс ферментов играет главную роль в ремоделировании и репарации ткани, связанных с развитием и воспалением (Birkedal-Hansen et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4:197-250, 1993). Эти ферменты имеют Zn²⁺ в их каталитических доменах и Са²⁺ стабилизирует значительно их третичную структуру.

В Европейской патентной заявке ЕР 657536А1 Wallach et al. предполагают, что можно было бы получить фермент, который расщепляет рецептор TNF 55000 кДа, путем нахождения мутированной формы этого рецептора, которая не расщепляется этим ферментом, но все еще связывается с ним. Единственным предлагаемым источником для этого фермента является детергентный экстракт мембран клеток, который, по-видимому, имеет протеазную активность. Если бы было возможно получить фермент согласно этой схеме, то этот фермент предположительно содержал бы простирающийся через мембрану район. Эта патентная заявка не описывает какую-либо протеазу, которая была действительно получена.

В более ранней патентной заявке в данной серии (Международной патентной публикации WO 98/20140) описаны способы получения выделенного фермента, который отщепляет как TNF-R р55, так и TNF-R р75 от клеточных поверхностей. Подходящим источником является культуральная среда клеток, которые были стимулированы форболмиристатацетатом (ФМА). Эта ферментативная активность была названа TRRE (фермент высвобождения рецептора TNF). В других исследованиях TRRE высвобождался непосредственно при ФМА-стимуляции, что указывает на то, что он предварительно синтезируется в неактивной форме, чтобы быстро превращаться в активную форму при стимуляции. Доказательством прямого отщепления TNF-R является то, что выделение его из клетки начинается очень быстро (˜5 минут) с максимальным выделением в пределах 30 минут. TRRE является специфическим для TNF-R и не расщепляет рецепторы IL-1, CD30, ICAM-1 или CD11b. Активность TRRE усиливается добавлением Са⁺⁺ или Zn⁺⁺ и ингибируется ЭДТА и фенантролином.

При условии, что TNF участвует в разнообразных патологических состояниях, желательно было бы получить различные факторы, которые позволили бы модулировать выделение рецептора для регуляции тем самым трансдукции (передачи) сигнала от TNF в сайт заболевания.

Это описание обеспечивает новые соединения, которые стимулируют ферментативное расщепление и высвобождение рецепторов TNF из клеточной поверхности. Девять новых ДНК-клонов были отобраны после повторяемого скрининга в анализе, который тестирует способность усиления высвобождения рецептора. Полинуклеотидные последовательности данного изобретения и белки, кодируемые ими, являются потенциально диагностическими инструментами и терапевтическими соединениями, которые могут быть использованы для коррекции трансдукции сигнала TNF выгодным образом.

Одним вариантом осуществления данного изобретения является выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность со следующими свойствами: а) эта последовательность экспрессируется на уровне мРНК в Т-клетках Jurkat; b) когда клетки COS-1, экспрессирующие TNF-рецептор, генетически трансформируют для экспрессии этой последовательности, эти клетки имеют увеличенную ферментативную активность расщепления и высвобождения этого рецептора. Если полинуклеотидная последовательность экспрессируется в клетках Jurkat, то она может быть обнаружена в экспрессионной библиотеке клеток Jurkat, депонированной АТСС (Номер доступа TIB-152). Известно, что этот полинуклеотид может быть получен из других клеточных линий или получен рекомбинантными способами.

В изобретение включены полинуклеотиды, в которых эта нуклеотидная последовательность содержится в виде любой из последовательностей SEQ ID NO:1-10. Вариантами изобретения являются также полинуклеотиды, содержащие по меньшей мере 30 и предпочтительно больше последовательных нуклеотидов в указанной нуклеотидной последовательности или по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, которые гомологичны указанной последовательности, при значительном уровне, предпочтительно при уровне 90% или более. В изобретение включены также антисмысловые и рибозимные полинуклеотиды, которые ингибируют экспрессию модулятора TRRE.

Другим вариантом данного изобретения являются выделенные полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом данного изобретения. Неограничительными примерами являются последовательности, показанные в SEQ ID NO:147-SEQ ID NO:158. В данное изобретение включены фрагменты и слитые (химерные) белки и они предпочтительно содержат по меньшей мере 10 последовательных остатков, кодируемых полинуклеотидом данного изобретения, или по меньшей мере 15 последовательных аминокислот, которые гомологичны при значительном уровне, предпочтительно при уровне по меньшей мере 80%. Предпочтительные полипептиды стимулируют расщепление и высвобождение рецепторов TNF из клеточной поверхности, в частности клеток COS-1, генетически трансформированных для экспрессии рецептора TNF. Эти полипептиды могут иметь простирающийся через мембрану домен или могут не иметь простирающегося через мембрану домена и могут необязательно продуцироваться посредством процесса, который включает в себя секрецию из клетки. В изобретение включены видовые гомологи с желательной последовательностью и искусственные мутанты с дополнительными выгодными свойствами.

Другим вариантом данного изобретения является антитело, специфическое для полипептида данного изобретения. Предпочтительными являются антитела, которые связывают TRRE-модуляторный белок, но не другие вещества, обнаруживаемые в сравнимых количествах в пробах тканей человека.

Другим вариантом данного изобретения является тест-способ определения измененной TRRE-активности в пробе клеток или ткани, в котором используют полинуклеотид или антитело данного изобретения для обнаружения присутствия или отсутствия соответствующего TRRE-модулятора. Этот тест-способ может быть в случае необходимости использован для диагностики или оценки клинического состояния в связи с атипичными уровнями TNF или трансдукции сигнала TNF.

Другим вариантом данного изобретения является способ увеличения или уменьшения трансдукции сигнала от цитокина в клетку (в том числе сигнала TNF, но не только), предусматривающий контактирование этой клетки с полинуклеотидом, полипептидом или антителом данного изобретения.

Следующим вариантом данного изобретения является способ скрининга полинуклеотидов на способность модулировать TRRE-активность. Этот способ включает в себя обеспечение клеток, которые экспрессируют как TRRE, так и TNF-рецептор; генетическое изменение этих клеток подлежащими скринингу полинуклеотидами; клонирование этих клеток и идентификацию клонов с желательной активностью.

Еще одним вариантом данного изобретения является способ скрининга веществ на способность влиять на TRRE-активность. Обычно он предусматривает инкубирование клеток, экспрессирующих рецептор TNF, с TRRE-модулятором данного изобретения в присутствии или в отсутствие испытуемого вещества и измерение действия на выделение этого рецептора TNF.

Продукты данного изобретения могут быть использованы в приготовлении лекарственного средства для лечения организма человека или животного. Это лекарственное средство содержит клинически эффективное количество для лечения заболевания, такого как сердечная недостаточность, кахексия, воспаление, эндотоксиновый бактериально-токсический шок, артрит, множественный склероз, сепсис и рак. Эти композиции могут быть использованы для введения субъекту, у которого предполагают наличие или риск возникновения такого заболевания, необязательно в комбинации с другими формами лечения, пригодными для состояния субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 является схематическим представлением плазмиды pCDTR2. Эта плазмида экспрессирует TNF-R р75, ˜75 кДа-форму рецептора TNF. PCMV обозначает здесь цитомегаловирус; BGHpA обозначает сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.

Фигура 2 является линией, изображающей уровни TNF-R р75, обнаруженные на клетках COS-1, генетически измененных для экспрессии рецептора. Результаты, полученные для трансформированных клеток, обозначенных C75R (, устремленная вверх линия), сравниваются с результатами их исходных клеток COS-1 (, базовая линия). Число рецепторов рассчитывали при помощи анализа Скетчарда (вставка).

Фигура 3 является графиком выживания, показывающим, что TRRE снижает смертность в мышах, которым вводили липополисахарид (ЛПС) для индукции септического перитонита. (◆) только ЛПС; () ЛПС плюс контрольный буфер; () ЛПС плюс TRRE (2000 Е); () ЛПС плюс TRRE (4000 Е).

Фигура 4 является растровой репродукцией диаграммы в виде столбцов, показывающей действие 9 новых клонов на TRRE-активность на клетках C75R (клетках COS-1, трансфицированных для экспрессии TNF-рецептора). Каждый из этих клонов увеличивает TRRE-активность более чем в 2 раза.

Фигура 5 является графиком выживания, показывающим способность 4 новых клонов сохранять жизнь мышей, которым вводили ЛПС. (◆) солевой раствор; () БСА; () Меу-3 (100 мкг); (Х) Меу-3 (10 мкг); (*) Меу-5 (10 мкг); () Меу-8 (10 мкг).

Было обнаружено, что некоторые клетки, участвующие в пути трансдукции TNF, экспрессируют ферментативную активность, которая заставляет рецепторы TNF отделяться от клеточной поверхности. Ферментативная активность отщепления и высвобождения рецепторов TNF была обозначена как TRRE. Форболмиристатацетат индуцирует высвобождение TRRE из клеток в культуральную среду. TRRE-белок был очищен в качестве примера из супернатанта клеток TNF-1 (пример 2). Эта протеаза несет некоторые отличительные признаки семейства металлопротеаз и быстро высвобождается из клеток при активации.

Для выяснения природы этого белка проводили функциональное клонирование. Клетки Jurkat были выбраны как хороший источник TRRE. кДНК из библиотеки Jurkat экспрессировали и клеточный супернатант тестировали на способность высвобождать рецепторы TNF из клеточных поверхностей. Клонирование и тестирование продукта экспрессии проводили посредством нескольких циклов и были получены девять клонов, которые более чем удваивали TRRE-активность в этом тесте (фигура 4). На уровне ДНК все 9 клонов имели различные последовательности.

Продукты экспрессии белка из этих клонов тестировали в липополисахаридной модели животного для сепсиса. Белок из трех различных клонов успешно предохранял животных от летальной дозы ЛПС (фигура 5). Это указывает на важную роль этих молекул в способности справляться с патологическими состояниями, опосредованными TNF.

Количество новых стимулирующих TRRE клонов, полученных из экспрессионной библиотеки, было удивительным. Субстратная специфичность TRRE, выделенного в примере 2, отличает рецепторы TNF 75 кДа и 55 кДа от рецепторов других цитокинов и белков поверхности клеток. Было мало оснований для предположения заранее, что клетки могут иметь девять различных протеаз для рецептора TNF. Возможно, что один из этих клонов кодирует TRRE, выделенный в примере 2, или родственный белок. Возможно, что некоторые из других клонов имеют протеолитическую активность для расщепления рецепторов TNF в том же самом сайте или в другом сайте, что вызывает высвобождение растворимой формы из клетки. Гипотезой данного изобретения является то, что некоторые из этих клонов могут сами не иметь протеолитической активности, но играют роль в стимулировании TRRE-активности вторичным образом.

Эта возможность согласуется со сделанными наблюдениями, поскольку существует эндогенный уровень TRRE-активности в клетках, использованных в этом тесте. Тест расщепления включает в себя мониторинг высвобождения рецептора TNF из клеток С75, которые являются клетками COS-1, генетически измененными для экспрессии TNF-R р75. Стандартный тест проводят путем контактирования этих трансформированных клеток с жидкостью, которая, как считают, содержит TRRE. Уровень эндогенной активности TRRE выявляется из скорости самопроизвольного высвобождения рецептора, даже в отсутствие добавления экзогенного TRRE (приблизительно 200 единиц). Таким образом, дополнительные белки, которые стимулируют TRRE-активность, увеличивали бы активность, измеряемую в этом тесте. Возможны многочисленные механизмы стимуляции, включающие в себя белки, которые активируют зимогенную форму TRRE, белки, которые освобождают TRRE от других компонентов клеточной поверхности, или белки, которые стимулируют секрецию TRRE из внутреннего компартмента клетки. Не требуется обязательное понимание этого механизма для применения продуктов данного изобретения в большинстве описанных вариантов.

Ожидается, что некоторые из этих клонов будут иметь активность не только в отношении стимулирования расщепления рецептора TNF, но будут также оказывать действие на другие белки клеточной поверхности. Вплоть до того, что последовательности расщепления или вспомогательные белки являются общими между различными рецепторами, некоторые клоны могли бы стимулировать фенотипические изменения (такие как высвобождение рецептора) для семейства родственных субстратов.

Данное изобретение обеспечивает полипептиды, которые стимулируют TRRE-активность, полинуклеотиды, которые кодируют такие полипептиды, и антитела, которые связывают такие пептиды. Связывание TNF с его рецептором опосредует ряд биологических эффектов. Расщепление TNF-рецептора посредством TRRE уменьшает трансдукцию сигнала посредством TRRE. Потенциаторы TRRE-активности обладают таким же действием. Таким образом, продукты данного изобретения могут быть использованы для модуляции трансдукции сигналов цитокинами, что имеет важное значение в способности справляться с патологическими состояниями, на которые действуют цитокины. Продукты данного изобретения могут быть также использованы в диагностических способах для определения, когда атипичная TRRE-активность действует на трансдукцию сигнала неподходящим образом. Тест-системы, описанные в этом описании, обеспечивают способ для скрининга дополнительных соединений, которые могут влиять на TRRE-активность и, следовательно, на трандукцию сигналов от TNF.

На основании краткого изложения данного изобретения и руководствуясь иллюстрациями в разделе примеров, специалист с квалификацией в данной области легко поймет, какие способы следует использовать в применении на практике данного изобретения. Нижеследующее подробное описание дается в интересах читателя для лучшего понимания изобретения.

Определения и основные способы

В применении в данном описании, "TRRE-активность" обозначает способность композиции расщеплять и высвобождать рецепторы TNF из поверхности экспрессирующих их клеток. Предпочтительным тестом является расщепление из трансфицированных клеток COS-1, описанное в примере 1. Однако TRRE-активность может быть измерена на любых клетках, которые несут рецепторы TNF с размером 55 кДа или 75 кДа. Другие свойства фермента TRRE, полученного ФМА-индукцией клеток ТНР-1 (приведенные в примере 2), не должны быть обязательно свойством TRRE-активности, измеряемой в этом тесте.

Унифицированная активность TRRE определяется как 1 рг растворимого TNF-R р75, высвобождаемого из клеточной поверхности в стандартном тесте, после коррекции на самопроизвольное высвобождение. Измерение TRRE-активности объясняется дополнительно в примере 1.

"TRRE-модулятор" представляет собой соединение, которое обладает способностью либо увеличения, либо уменьшения TRRE-активности для процессинга TNF на поверхности клеток. Те соединения, которые увеличивают TRRE-активность, могут быть названы TRRE-стимуляторами, а те, которые уменьшают TRRE-активность, могут быть названы TRRE-ингибиторами. TRRE-стимуляторы включают в себя соединения, которые обладают протеолитической активностью в отношении TNF-R, и соединения, которые увеличивают активность протеаз TNF-R. Примерами TRRE-стимуляторов являются девять полинуклеотидных клонов, описанных в примере 5, и их белковые продукты. Ингибиторы TRRE-активности могут быть получены с использованием тестов скрининга, описанных ниже.

Термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Далее приведены неограничительные примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, (мРНК), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. В случае их присутствия, модификации нуклеотидной структуры могут быть произведены до или после сборки полимера. Термин полинуклеотид обозначает взаимозаменяемо двух- и одноцепочечные молекулы. Если нет иных указаний или требований, любой вариант данного изобретения, описанный здесь, который является полинуклеотидом, включает как двухцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, известных или предполагаемых для образования данной двухцепочечной формы.

"Гибридизация" обозначает реакцию, в которой один или несколько полинуклеотидов взаимодействуют с образованием комплекса, который стабилизируется через образование водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Реакции гибридизации могут проводиться в условиях различной "строгости". Рассматриваемые при этом условия включают в себя температуру, ионную силу и присутствие дополнительных растворенных веществ в реакционной смеси, таких как формамид. Условиями увеличивающейся строгости являются: 30°С, в 10Х SSC (0,15 М NaCl, 15 мМ цитратный буфер); 40°С, в 6Х SSC или при приблизительно 40°С, в 0,5Х SSC или при приблизительно 30°С, в 6Х SSC, причем SSC содержит 50% формамид. ДСН и источник фрагментированной ДНК (такой как сперма лосося) обычно также присутствуют во время гибридизации. Более высокие условия строгости требуют более высокого минимума комплементарности между гибридизующимися элементами для образования стабильного гибридизационного комплекса. См. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989).

Понятно, что пуриновые и пиримидиновые азотистые основания со сходными структурами могут быть функционально равноценными в смысле спаривания оснований по Уотсону-Крику; и взаимозаменяемость сходных азотистых оснований, в частности урацила и тимина, или модификация азотистых оснований, такая как метилирование, не является существенной заменой.

Процент идентичности последовательности для полинуклеотиов или полипептидов рассчитывают сопоставлением сравниваемых последовательностей и затем подсчетом числа общих остатков в каждом сопоставляемом положении. Никакого "пенальти" не налагается из-за присутствия вставок или делеций, но они допускаются только в том случае, когда требуется согласовать явно увеличенное число аминокислотных остатков в одной из сопоставляемых последовательностей. В том случае, когда одна из сравниваемых последовательностей указана как являющаяся "последовательной", "гэпы" (пробелы) в этой последовательности не допускаются во время сравнения. Процентная идентичность выражается как количество (в %) остатков в тестируемой последовательности, которые являются идентичными остаткам в сравнительной или ссылочной последовательности.

В применении здесь, "экспрессия" полинуклеотида обозначает образование РНК-транскрипта. Последующая трансляция в белок или другие эффекторные соединения может также иметь место, но не требуются, если нет иных указаний.

"Генетическое изменение" обозначает процесс, в котором генетический элемент вводят в клетку другим способом, чем посредством митоза или мейоза. Этот элемент может быть гетерологичным для данной клетки или он может быть дополнительной копией или улучшенной версией элемента, уже присутствующего в данной клетке. Генетическое изменение может быть выполнено, например, трансдукцией клетки рекомбинантной плазмидой или другим полинуклеотидом с использованием любого способа, известного в данной области, такого как электропорация, осаждение фосфатом кальция или контактирование с комплексом полинуклеотид-липосома. Генетическое изменение может быть также выполнено, например, трансдукцией или инфекцией ДНК- или РНК-вирусом или вирусным вектором. Предпочтительно, чтобы генетическое изменение наследовалось потомством данной клетки, но это не является общим требованием, если нет иных указаний.

Термины "полипептид", "пептид" и "протеин" используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Этот полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться неаминокислотами. Эти термины охватывают также аминокислотный полимер, который был модифицирован; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией, такой как конъюгация с меченым компонентом.

"Слитый полипептид" представляет собой полипептид, содержащий районы в отличающемся положении в последовательности, в сравнении с тем, что имеет место в природе. Эти районы могут нормально существовать в отдельных белках и быть соединены вместе в слитом полипептиде; они могут нормально существовать в том же самом белке, но быть помещены в новом расположении в слитом полипептиде; или они могут быть синтетически перегруппированы. "Функционально эквивалентный фрагмент" полипептида отличается от нативной последовательности добавлением, делецией или заменой аминокислотных остатков или любой их комбинацией при сохранении функционального свойства этого фрагмента, относящегося к тому контексту, в котором он используется. Слитые белки и функционально эквивалентные фрагменты включены в определение полипептидов, используемое в этом описании.

Понятно, что укладка и биологическая функция белков может использовать аккомодацию инсерций, делеций и замен в аминокислотной последовательности. Некоторые аминокислотные замены являются более легко переносимыми. Например, замена аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями, ароматическими боковыми цепями, полярными боковыми цепями, боковыми цепями с положительным или отрицательным зарядом или боковыми цепями, содержащими два или менее атомов углерода, другой аминокислотой с боковой цепью со сходными свойствами может происходить без нарушения по существу идентичности этих двух последовательностей. Способы определения гомологичных районов и оценки в баллах степени гомологии описаны в Altschul et al. Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986 и Heniroff et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992. Замены, которые сохраняют функциональность полипептида или придают новое и выгодное свойство (такое как повышенная активность, стабильность или пониженная иммуногенность), являются особенно предпочтительными.

Термин "антитело" (взаимозаменяемо используемый во множественной форме) обозначает молекулу иммуноглобулина, способную к специфическому связыванию с мишенью, такой как полипептид, посредством по меньшей мере одного сайта узнавания антигена, локализованного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В применении здесь этот термин включает в себя не только интактные антитела, но также эквиваленты антител, которые включают в себя по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт желательной специфичности. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, ферментативно или рекомбинантно полученные фрагменты антител, слитые белки, гуманизированные антитела, одноцепочечные вариабельные области, двойные антитела и цепи антител, которые подвергаются антигениндуцируемой сборке.

Термин "выделенный" ("выделенное") полипептид, полинуклеотид, белок, антитело или другое вещество относится к получению этого вещества, освобожденного по меньшей мере от некоторых других компонентов, которые могут также присутствовать там, где природно встречается это вещество или подобное вещество или откуда оно первоначально получено. Так, например, выделенное вещество может быть получено с использованием способа очистки для обогащения его из исходной смеси. Обогащение может быть измерено на абсолютной основе, такой как вес на объем раствора, или оно может быть измерено относительно второго, потенциально примесного вещества, присутствующего в исходной смеси. Чем больше обогащение вариантов данного изобретения, тем более предпочтительными они являются. Так, например, 2-кратное обогащение является предпочтительным, 10-кратное обогащение является более предпочтительным, 100-кратное обогащение является еще более предпочтительным, 1000-кратное обогащение является даже еще более предпочтительным. Вещество может быть обеспечено также в выделенном состоянии при помощи способа искусственной сборки, такого как химический синтез или рекомбинантная экспрессия.

Термин "клетка-хозяин" обозначает клетку, которая была генетически изменена или которая способна к трансформации, путем введения экзогенного полинуклеотида.

Термин "клиническая проба" включает в себя множество типов проб, полученных из субъекта и применимых в процедуре in vitro, такой как диагностический тест. Это определение включает в себя образцы твердых тканей, полученные хирургическим удалением, образец патологии или образец биопсии, клетки, полученные из клинического субъекта, или их потомство, полученное из культуры, жидкие пробы, такие как кровь, сыворотка, плазма, цереброспинальная жидкость и моча, и любые фракции или экстракты таких проб, которые содержат потенциальное указание на это заболевание.

Если нет иных указаний, практика данного изобретения будет использовать общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, в пределах квалификации в данной области. Такие способы объясняются в стандартной литературе, такой как "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989), "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984), "Animal Cell Culture" (R.I.Freshney, ed., 1987); ряд "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M.Weir & C.C.Blackwell, Eds.), "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M.Miller & M.P.Calos, eds., 1987), и "Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel et al., eds., 1987 и "Current Protocols in Immunology" (J.E.Coligan et al., eds., 1991). Читатель может также выбрать ссылку на более раннюю патентную заявку, относящуюся к TRRE, Международную заявку WO 98/020140.

Для целей ведения дела в США и в других юрисдикциях, где это позволено, все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, указанные в любом месте в этом описании, включены тем самым в качестве ссылки во всей их полноте.

Полинуклеотиды

Полинуклеотиды данного изобретения могут быть получены любым подходящим способом в данной области. С использованием данных, обеспеченных в данном описании, последовательности менее ˜50 п.н. легко получают химическим синтезом, либо через коммерческую службу, либо при помощи известного способа синтеза, такого как триэфирный способ или фосфитный способ. Предпочтительным способом является тверодофазный синтез с использованием мононуклеозидфосфорамидитных связывающих единиц (Hirose et al., Tetra, Lett. 19:2449-2452, 1978; US Patent No. 4415732).

Для использования в антисмысловой терапии полинуклеотиды могут быть получены при помощи химического способа, который дает более стабильные фармацевтические препараты. Неограничительные примеры включают в себя тиол-дериватизованные нуклеозиды (патент США 5578718) и олигонуклеотиды с модифицированными скелетами (патенты США с номерами 5541307 и 5378825).

Полинуклеотиды данного изобретения могут быть также получены ПЦР-амплификацией матрицы с желательной последовательностью. Олигонуклеотидные праймеры, охватывающие желательную последовательность, отжигают с матрицей, удлиняют их ДНК-полимеразой и затем расплавляют при более высокой температуре таким образом, чтобы матрица и удлиненные олигонуклеотиды разъединились. Этот цикл повторяют до тех пор, пока не будет получено желательное количество амплифицируемого полинуклеотида (патенты США с номерами 4683195 и 4683202). Подходящие матрицы включают в себя библиотеку Т-клеток Jurkat и другие экспрессионные библиотеки человека и животных, которые содержат последовательности, кодирующие TRRE-модулятор. Библиотека Т-клеток Jurkat доступна из Американской коллекции типовых культур, 10801 University BLVD., Manassas VA 20110, U.S.A. (ATCC # TIB-152). Мутации и другие адаптации могут быть выполнены во время амплификации конструированием подходящих праймеров или могут быть включены после генетического сплайсинга.

Количества промышленного масштаба больших полинуклеотидов наиболее удобно получать встраиванием желательной последовательности в подходящий клонирующий вектор и репродуцированием клона. Способы клонирования нуклеотидов даны в Sambrook, Fritsch & Maniatis (supra) и в патенте США с номером 5552524. Примеры клонирования и способы экспрессии иллюстрированы в примере 6.

Предпочтительные полинуклеотидные последовательности являются на 50%, 70%, 80%, 90% или 100% идентичными одной из последовательностей, приведенных в качестве примеров в этом описании; в порядке увеличения предпочтительности. Длина последовательных остатков в идентичной или гомологичной последовательности, сравнимой с примерной последовательностью, может быть приблизительно 15, 30,