Гибридные полипептиды с усиленными фармакокинетическими свойствами

Гибридные полипептиды с усиленными фармакокинетическими свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка является частичным продолжением серийной заявки No. 09/350641, поданной 9 июля 1999 г., которая является частичным продолжением серийной заявки No. 09/315304, поданной 20 мая 1999 г., которая является частичным продолжением серийной заявки No. 09/082279, поданной 20 мая 1998 г., полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

1. Введение

Настоящее изобретение относится к энхансерным пептидным последовательностям, первоначально полученным из белковой последовательности оболочки ретровируса (gр41), которые усиливают фармакокинетические свойства любого корового полипептида, с которым они связываются. Частично изобретение основывается на обнаружении того факта, что гибридные полипептиды, включающие энхансерные пептидные последовательности, связанные с коровым полипептидом, обладают усиленными фармакокинетическими свойствами, таким как увеличенный период полужизни. Изобретение также относится к новым антифузогенным и/или противовирусным пептидам, включающим такие пептиды, которые содержат указанные энхансерные пептидные последовательности, и к способам применения таких пептидов. Изобретение также относится к способам усиления фармакокинетических свойств любого корового полипептида посредством связывания энхансерной пептидной последовательности с коровым полипептидом. Используемые в практике осуществления настоящего изобретения коровые полипептиды могут включать любые фармакологически полезные пептиды, которые могут применяться, например, в качестве терапевтического или профилактического средства. В неограничивающем варианте настоящее изобретение иллюстрируется с помощью примера, в котором показано, что гибридный полипептид, включающий, например, коровый полипептид ВИЧ, связанный с энхансерными пептидными последовательностями, представляет мощный, нетоксичный ингибитор ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО (SIV) инфекции. Кроме того, энхансерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению связаны с коровым полипептидом респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и коровым полипептидом рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГ-РГ). В каждом случае показано, что гибридный полипептид обладает усиленными фармакокинетическими свойствами, и гибридный полипептид РСВ проявляет значительную анти-РСВ активность.

2. Предпосылки создания изобретения

Полипептидные продукты имеют широкий диапазон применений в качестве терапевтических и/или профилактических средств для профилактики и лечения заболевания. Многие полипептиды способны регулировать биохимические или физиологические процессы с целью либо профилактики заболевания, либо облегчения связанных с заболеванием симптомов. Например, полипептиды, такие как вирусные или бактериальные полипептиды, успешно применяют в качестве вакцин для профилактики патологических состояний. Кроме того, пептиды успешно применяют в качестве терапевтических средств для лечения симптомов заболеваний. Такие пептиды попадают в различные категории, такие как, например, гормоны, ферменты, иммуномодуляторы, сывороточные белки и цитокины.

Полипептиды, для того чтобы оказывать нужный биологический и терапевтический эффект на целевые участки, должны присутствовать в соответствующих концентрациях в участках применения. Кроме того, должна в основном поддерживаться их структурная целостность. Исходя из этого, показания по применению композиций полипептидов в качестве терапевтических средств определяются химической природой и характеристиками полипептидов, такими как их размер и сложность, конформационные требования, их стабильность, поддерживать которую зачастую бывает сложно, и профили растворимости. Фармакокинетические свойства любого конкретного терапевтического пептида зависят от биологической доступности указанного пептида, характера его распределения в организме и последующего выведения из организма.

Поскольку многие биологически активные вещества, такие как пептиды и белки, быстро разрушаются в организме, очень важно разрабатывать эффективные системы для поддержания стойкой концентрации пептида в кровяном русле, повышать эффективность действия таких пептидов и минимизировать случаи возникновения побочных эффектов и их тяжесть.

3.1. Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится, во-первых, к энхансерным пептидным последовательностям, первоначально полученным из белковых последовательностей оболочек (gр41) различных ретровирусов, например из ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО, которые усиливают фармакокинетические свойства любого корового полипептида, с которым они связываются. В основе изобретения лежит обнаружение того факта, что, когда раскрываемые энхансерные пептидные последовательности связываются с любым коровым полипептидом, получаемый гибридный полипептид обладает усиленными фармакокинетическими свойствами, включающими, например, увеличенный период полужизни и сниженный клиренс, в сравнении с одним только коровым полипептидом. Настоящее изобретение также относится к таким гибридным полипептидам и коровым полипептидам и к новым пептидам, которые проявляют антифузогенную активность, противовирусную активность и/или способность модулировать внутриклеточные процессы, в которых участвуют свернутые спиральные пептидные структуры. В число таких пептидов входят пептиды, которые содержат энхансерные пептидные последовательности.

Коровые полипептиды могут включать любые пептиды, которые могут быть введены в живую систему, например любые пептиды, способные функционировать в качестве терапевтических, профилактических или визуализирующих средств, полезных для лечения или профилактики заболевания или для использования в диагностических или прогностических методах, включая методы визуализации in vivo. Такие пептиды включают, например, факторы роста, гормоны, цитокины, ангиогенные факторы роста, внеклеточные матричные полипептиды, лиганды рецепторов, агонисты, антагонисты или инверсные агонисты, пептидные средства-мишени, такие как визуализирующие средства, или цитотоксичные средства-мишени, или полипептиды, которые проявляют антифузогенную и/или противовирусную активность, и пептиды или полипептиды, которые функционируют в качестве антигенов или иммуногенов, включая, например, вирусные и бактериальные полипептиды.

Изобретение также относится к способам усиления фармакокинетических свойств любого корового полипептида посредством связывания корового полипептида с энхансерными пептидными последовательностями с образованием гибридных полипептидов.

Изобретение далее относится к способам применения раскрываемых в нем пептидов, включая гибридные полипептиды, содержащие энхансерные пептидные последовательности. Например, способы настоящего изобретения включают способы снижения или подавления вирусной инфекции, например инфекции, вызванной ВИЧ-1, ВИЧ-2, РСВ, вирусом кори, гриппа, парагриппа, Эпштейна-Барра и вирусом гепатита, и/или процессов слияния клеток, вызванных вирусом. Энхансерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению могут дополнительно применяться для увеличения in vitro или ex-vivo периода полужизни корового полипептида, к которым присоединяются энхансерные пептидные последовательности, например энхансерные пептидные последовательности могут увеличить период полужизни присоединенных коровых полипептидов в клеточной культуре или образцах клеток или ткани.

Изобретение иллюстрируется примерами, в которых показано, что гибридные полипептиды, содержащие коровый полипептид ВИЧ, связанный с энхансерными пептидными последовательностями, проявляют значительно усиленные фармакокинетические свойства и действуют как мощные нецитотоксичные ингибиторы ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО инфекции. Изобретение далее иллюстрируется примерами, в которых показано, что гибридные полипептиды, содержащие коровый полипептид РСВ или полипептид лютеинизирующего гормона, проявляют значительно усиленные фармакокинетические свойства. Кроме того, гибридный полипептид с РСВ обладает существенной активностью против РСВ.

3.2. Определения

В контексте настоящего описания пептиды, полипептиды и белки определяются как органические соединения, включающие две или более аминокислот, ковалентно соединенных, например, с помощью пептидных амидных связей. Пептиды, полипептиды и белки могут также включать неприродные аминокислоты в любой модификации, а также дополнительные аминогруппы и карбоксильные группы, как указано в описании. Термины «пептид», «полипептид» и «белок» взаимозаменяемы при использовании в настоящем описании.

Определенные в настоящем описании пептидные последовательности изображаются с помощью однобуквенных символов, соответствующих конкретным аминокислотным остаткам, как приведено ниже:

А (аланин)

R (аргинин)

N (аспарагин)

D (аспарагиновая кислота)

С (цистеин)

Q (глютамин)

Е (глютаминовая кислота)

G (глицин)

Н (гистидин)

I (изолейцин)

L (лейцин)

К (лизин)

М (метионин)

F (фенилаланин)

Р (пролин)

S (серин)

Т (треонин)

W (триптофан)

Y (тирозин)

V (валин)

Х (любая аминокислота)

Термин "энхансерные пептидные последовательности" в контексте настоящего описания означает пептиды, имеющие следующие консенсусные аминокислотные последовательности:

"WXXWXXXI", "WXXWXXX", "WXXWXX", "WXXWX", "WXXW", "WXXXWXWX", "XXXWXWX", "XXWXWX", "XWXWX", "WXWX", "WXXXWXW", "WXXXWX", "WXXXW", "IXXXWXXW", "XXXWXXW", "XXWXXW", "XWXXW", "XWXWXXXW", "XWXWXXX", "XWXWXX", "XWXWX", "XWXW", "WXWXXXW" или "XWXXXW", где Х может быть любой аминокислотой, W означает триптофан и I означает изолейцин. Как указывается далее, энхансерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению также включают пептидные последовательности, которые в целом такие же, что и консенсусные аминокислотные последовательности, но содержат аминокислотные замещения, вставки или делеции, которые, однако, не устраняют способность пептида усиливать фармакокинетические свойства корового пептида, с которым он связывается, в сравнении с фармакокинетическими свойствами одного корового полипептида.

Термин «коровый полипептид» в контексте настоящего описания относится к любому полипептиду, который может быть введен в живую систему и таким образом представлять собой биологически активную молекулу, например любой полипептид, который может функционировать как фармакологически полезный пептид при лечении или профилактике заболевания.

Термин «гибридный полипептид» в контексте настоящего описания относится к любому полипептиду, включающему амино, карбокси или амино и карбокси концевую энхансерную пептидную последовательность и коровый полипептид. В типичном случае энхансерная пептидная последовательность связана непосредственно с коровым полипептидом. Следует понимать, что энхансерный пептид может также присоединяться к промежуточной аминокислотной последовательности, имеющейся между энхансерной пептидной последовательностью и коровым пептидом.

Термины "антифузогенный" и "препятствующий слиянию мембран" в контексте настоящего описания относятся к способности пептида ингибировать или снижать уровень явлений слияния двух или более структур, например клеточных мембран или вирусных оболочек или жгутиков, в сравнении с уровнем слияния мембран, который имеется между структурами в отсутствие пептида.

Термин "противовирусный" в контексте настоящего описания относится к способности пептида подавлять вирусное инфицирование клеток, протекающее посредством, например, слияния клеток или в виде свободной вирусной инфекции. Такое инфицирование может обуславливаться слиянием мембран, что имеет место в случае вирусов, покрытых оболочкой, или другими процессами слияния, вовлекая вирусную структуру и клеточную структуру, например слияние вирусного жгутика и бактериальной мембраны в ходе бактериальной конъюгации.

4. Краткое описание чертежей

Фиг.1. Гибридные полипептиды. Энхансерные пептидные последовательности, полученные из предположительного N-концевого и С-концевого взаимодействующих участков, изображены связанными с основным коровым полипептидом. Консервативные энхансерные пептидные последовательности затенены. Следует отметить, что указанные энхансерные пептидные последовательности могут использоваться либо как N-концевые, С-концевые или N- и С-концевые добавки. Кроме того, энхансерные пептидные последовательности могут добавляться к коровому полипептиду в прямой или обратной ориентации, индивидуально или в любой из возможных комбинаций, для усиления фармакокинетических свойств пептида.

Фиг.2А. Энхансерные пептидные последовательности, полученные из различных белковых последовательностей оболочек (gр41), отражающие N-концевой взаимодействующий участок, наблюдаемый во всех опубликованных к настоящему времени данных о выделенных последовательностях ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО. Концевая последовательность "WXXWXXXI" означает консенсусную последовательность.

Фиг.2В. Варианты энхансерной пептидной последовательности, полученные из различных белковых последовательностей оболочек (gр41), отражающие С-концевой взаимодействующий участок, наблюдаемый во всех опубликованных к настоящему времени данных о выделенных последовательностях ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО. Концевая последовательность "WXXXWXWX" означает консенсусную последовательность.

Фиг.3. Сравнение титров ВИЧ-1 в тканях мышей SCID-huPBMC, зараженных ВИЧ-1 9320, по данным уровней Р24, полученных в тестах на культуре huPBMC. На фиг.3 показано сравнение уровней ингибирования вирусов Т20 и Т1249 in vivo.

Фиг.4А-4В. Фармакокинетический профиль Т1249 в плазме крови в сравнении с уровнем контроля с коровым вариантом Т1387 у крыс CD после в/в инъекции в течение 2 часов (фиг.4А) и 8 часов (фиг.4В). Полипептид Т1387 представляет собой коровый полипептид и Т1249 представляет собой коровый полипептид, связанный с энхансерными пептидными последовательностями.

Фиг.5. Фармакокинетический профиль Т1249 в плазме крови в сравнении с контрольным вариантом Т20 у крыс CD после в/в инъекции. Полипептид Т1249 представляет собой гибридный полипептид, образованный из корового полипептида (Т1387), связанного с энхансерными пептидными последовательностями. Т20: n=4; Т1249: n=3.

Фиг.6. Сравнение активности и цитотоксичности Т20/Т1249 против ВИЧ-1/IIIb.

Фиг.7. Непосредственное связывание Т1249 с конструкцией на основе gр41 - М41Δ178. ¹²⁵I-T1249 очищен до максимально достижимой удельной активности методом ВЭЖХ. Показано насыщение при связывании с М41Δ178 (белок слияния из эктодомена gр41, не содержащий аминокислотной последовательности Т20), иммобилизованным на микротитрационном планшете в концентрации 0,5 мг/мл.

Фиг.8. Процесс ассоциации/диссоциации Т1249 с течением времени. Результаты показывают, что ¹²⁵I-T1249 и ¹²⁵I-T20 обладают сходными значениями аффинности связывания в 1-2 нМ. Начальные скорости ассоциации и диссоциации для ¹²⁵I-T1249 значительно ниже, чем для ¹²⁵I-T20. Диссоциацию связанного лиганда с радиоактивной меткой измеряют при добавлении немеченного пептида до конечной концентрации в 10 мкм в 1/10 общего объема среды для тестирования.

Фиг.9. Конкуренция при связывании Т1249 с М41Δ178. Немеченные Т1249 и Т20 титруют в присутствии одной концентрации ¹²⁵I-T1249 или ¹²⁵I-T20. Лиганд добавляют сразу после начала инкубации немеченного пептида.

Фиг.10А-10В. Фармакокинетический профиль гибридных полипептидов из РСВ - Т1301 (10А) и Т1302 (10В) в плазме крови крыс CD в сравнении с Т786.

Фиг.11А. Тест на снижение бляшкообразования. Гибридный полипептид Т1293 способен ингибировать инфекцию РСВ со значением ИК₅₀, равным 2,6 мкг/мл.

Фиг.11В. Тест на снижение бляшкообразования показывает, что гибридные полипептиды РСВ Т1301, Т1302 и Т1303 ингибируют РСВ инфекцию.

Фиг.12А и 12В. Фармакокинетический профиль гибридного полипептида лютеинизирующего гормона - Т1324 в сравнении с Т1323 в плазме крови самцов крыс CD. Полипептид Т1323 представляет коровый полипептид лютеинизирующего гормона, и полипептид Т1324 представляет гибридный полипептид, включающий коровый полипептид, связанный с энхансерными пептидными последовательностями.

Фиг.13. Гибридные полипептидные последовательности, полученные из различных коровых полипептидов. Коровые полипептидные последовательности показаны в затененном виде. Незатененные последовательности на амино- и карбокси-концах указывают на энхансерные пептидные последовательности.

Фиг.14А-В. Спектры кругового дихроизма (КД) для Т1249 в растворе (фосфатно-буферный раствор, рН 7) одного (10 мкМ при 1°С, фиг.14А) и в сочетании с пептидом, включающим 45 остатков, из gр41 HR1 связывающего домена (Т1346); зачерненный квадрат означает расчетный КД спектр, предсказанный в рамках модели «отсутствия взаимодействия», тогда как фактические спектры КД обозначены зачерненным кругом

Фиг.15. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле, показывающие защиту со стороны Т1249 конструкции на основе gр41 - М41Δ178 от расщепления протеиназой К; дорожка 1: праймерный маркер; дорожка 2: необработанный М41Δ178; дорожка 3: М41Δ178, инкубированный с протеиназой К; дорожка 4: необработанный Т1249; дорожка 5: Т1249, инкубированный с протеиназой К; дорожка 6: М41Δ178, инкубированный с Т1249; дорожка 7: инкубация Т1249 и М41Δ178 перед добавлением протеиназы К.

Фиг.16А-С. Фармакокинетика Т1249 у альбиносных крыс линии Спрэг-Доли (Sprague-Dawley); фиг.16А: фармакокинетика Т1249 в случае введения однократной дозы путем непрерывной подкожной инфузии; фиг.16В: фармакокинетика Т1249 в плазме крови при введении его подкожной инъекцией (п/к) или внутривенной инъекцией (в/в); фиг.16С: кинетический анализ Т1249 в лимфе и плазме крови после внутривенной инъекции.

Фиг.17А-В. Фармакокинетика Т1249 у cynomolgus обезьян;

фиг.17А: фармакокинетика в плазме крови однократной дозы Т1249 в 0,8 мг/кг, вводимой подкожной (п/к), внутривенной (в/в) или внутримышечной (в/м) инъекцией; фиг.17В: фармакокинетика в плазме крови Т1249 при подкожном введении трех разных доз (0,4 мг/кг, 0,8 мг/кг и 1,6 мг/кг).

Фиг.18А-18D. Противовирусная активность, проявляемая пептидами DP397 Т649 (--○--) и Т1249 (--▵--) в различных устойчивых к Т649 штаммах ВИЧ-1, по данным тестирования инфекционности по методу Magi-CCR-5; сплошные (верхние) и прерывистые (нижние) горизонтальные линии на каждом чертеже указывают уровни 50% и 90% снижения инфекционности ВИЧ-1 соответственно; фиг.18А: противовирусная активность, проявляемая DP397, Т649 и Т1249 в ВИЧ-1, штамм RF-649; фиг.18В: противовирусная активность, проявляемая DP397, Т649 и Т1249 в ВИЧ-1, штамм DH012-649; фиг.18С: противовирусная активность, проявляемая DP397, Т649 и Т1249 в ВИЧ-1, штамм 3'ETVQQQ; фиг 18D: противовирусная активность, проявляемая DP397, Т649 и Т1249 в ВИЧ-1, штамм SIM-649.

5. Подробное описание изобретения

В настоящем описании раскрыты пептидные последовательности, называемые энхансерными пептидными последовательностями, полученные из различных белковых последовательностей оболочки ретровируса (gр41), которые способны усиливать фармакокинетические свойства коровых полипептидов, к которым они присоединяются. Такие энхансерные пептидные последовательности могут использоваться в методах, направленных на усиление фармакокинетических свойств любого корового полипептида посредством связывания энхансерных пептидных последовательностей с коровым полипептидом с образованием гибридного полипептида с усиленными фармакокинетическими свойствами в сравнении с одним коровым полипептидом. Период полужизни корового полипептида, к которому присоединяются одна или более энхансерных пептидных последовательностей, может быть также увеличен in vitro. Так, например, присоединенные энхансерные пептидные последовательности могут увеличить период полужизни корового полипептида в случае наличия его в клеточной культуре, тканевой культуре или в образце, взятом у пациента, таком как клетка, ткань или другие образцы.

Коровые полипептиды в составе гибридных полипептидов согласно настоящему изобретению могут включать любой пептид, который может быть введен в живую систему, например любой пептид, который может функционировать как терапевтическое или профилактическое средство, полезное для лечения или профилактики заболевания, или как визуализирующий агент, полезный для визуализации структур in vivo.

В описании приведены также пептиды, включая пептиды, которые содержат энхансерные пептидные последовательности, проявляющие антифузогенную и/или противовирусную активность. Кроме того, описаны способы применения таких пептидов, включая способы, применяемые для снижения или подавления вирусной инфекции и/или слияния клеток, вызванного вирусной инфекцией.

5.1. Гибридные полипептиды

Гибридные полипепиды согласно настоящему изобретению включают по меньшей мере одну энхансерную пептидную последовательность и коровый полипептид. Предпочтительно гибридные полипептиды согласно настоящему изобретению включают по меньшей мере две энхансерных пептидных последовательности и коровый полипептид, причем по меньшей мере один энхансерный пептид находится на амино-конце корового полипепида и по меньшей мере одна энхансерная пептидная последовательность, имеющаяся в гибридном полипептиде, находится на карбокси-конце корового полипептида.

Энхансерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению включают пептидные последовательности, первоначально полученные из различных белковых последовательностей оболочки ретровируса (gр41), включая последовательности ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО, и внесенные в них специфические вариации или модификации описаны ниже. Коровый полипептид может включать любую пептидную последовательность, предпочтительно любую пептидную последовательность, которая может быть введена в живую систему, включая, например, пептиды, предназначенные для применения с целью лечения, профилактики или визуализации.

В типичном случае длина гибридного полипептида варьирует в диапазоне от примерно 10 до примерно 500 аминокислотных остатков, причем предпочтительной является длина от примерно 10 до примерно 100 аминокислотных остатков, и наиболее предпочтительной является длина от примерно 10 до примерно 40 аминокислотных остатков.

Не ограничивая обсуждение рамками какой-либо конкретной теории, следует тем не менее отметить, что структура белка оболочки такова, что предположительный участок α-спирали, расположенный на С-концевом участке белка, скорее всего, связан с участком «застежки-молнии» лейцина, расположенным на N-концевом участке белка. Сравнительный анализ структуры участков gр41 с N-концевой и С-концевой энхансерными последовательностями, проведенный во всех опубликованных к настоящему времени работах по выделению последовательностей ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО, приводит к идентификации консенсусных аминокислотных последовательностей.

В частности, были идентифицированы приведенные ниже консенсусные аминокислотные последовательности, отображающие консенсусные энхансерные пептидные последовательности (консенсусные последовательности перечислены в прямой и обратной ориентациях, поскольку указанные энхансерные пептидные последовательности могут использоваться либо в прямой, либо в обратной ориентации): "WXXWXXXI", "WXXWXXX", "WXXWXX", "WXXWX", "WXXW", "WXXXWXWX", "XXXWXWX", "XXWXWX", "XWXWX", "WXWX", "WXXXWXW", "WXXXWX", "WXXXW", "IXXXWXXW", "XXXWXXW", "XXWXXW", "XWXXW", "XWXWXXXW", "XWXWXXX", "XWXWXX", "XWXWX", "XWXW", "WXWXXXW" или "XWXXXW", где Х может быть любой аминокислотой, W означает триптофан и I означает изолейцин. Прямые ориентации консенсусных аминокислотных последовательностей показаны на фиг.1 и 2.

В типичном случае энхансерная пептидная последовательность составляет примерно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислотных остатков в длину, при этом предпочтительной является длина от примерно 4 до примерно 20 остатков, более предпочтительной является длина от примерно 4 до примерно 10 остатков и наиболее предпочтительной является длина от примерно 6 до примерно 8 остатков.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения энхансерные пептидные последовательности, которые могут применяться для усиления фармакокинетических свойств получаемых гибридных полипептидов, включают специфические энхансерные пептидные последовательности, показанные на фиг.2, 13 и в Таблице 1. В число наиболее предпочтительных энхансерных пептидных последовательностей входят такие, которые включают указанные ниже аминокислотные последовательности: "WQEWEQKI" и "WASLWEWF".

С целью иллюстрации, но не с целью ограничения, ниже в Таблице 1 перечислены аминокислотные последовательности, которые отражают предпочтительные варианты энхансерных пептидных последовательностей из числа энхансерных пептидных последовательностей согласно настоящему изобретению. Следует понимать, что хотя показана только прямая ориентация данных последовательностей, обратная ориентация приведенных последовательностей также входит в область настоящего изобретения. Так, например, если ниже показана прямая ориентация энхансерной пептидной последовательности "WMEWDREI", то и ее обратная ориентация, т.е. "IERDWEMW", также включается.

Таблица 1

WMEWDREI (SEQ ID NO:1544)

WQEWERKV (SEQ ID NO:1545)

WQEWEQKV (SEQ ID NO:1546)

MTWMEWDREI (SEQ ID NO:1547)

NNMTWMEWDREI (SEQ ID NO:1548)

WQEWEQKVRYLEANI (SEQ ID NO:1549)

NNMTWQEWEZKVRYLEANI (SEQ ID NO:1550)

WNWFI (SEQ ID NO:1551)

WQEWDREISNYTSLI (SEQ ID NO:1552)

WQEWEREISAYTSLI (SEQ ID NO:1553)

WQEWDREI (SEQ ID NO:1554)

WQEWEI (SEQ ID NO:1555)

WNWF (SEQ ID NO:1556)

WQEW (SEQ ID NO:1557)

WQAW (SEQ ID NO:1558)

WQEWEQKI (SEQ ID NO:1559)

WASLWNWF (SEQ ID NO:1560)

WASLFNFF (SEQ ID NO:1561)

WDVFTNWL (SEQ ID NO:1562)

WASLWEWF (SEQ ID NO:1563)

EWASLWEWF (SEQ ID NO:1564)

WEWF(SEQ ID NO:1565)

EWEWF (SEQ ID NO:1566)

IEWEWF (SEQ ID NO:1567)

IEWEW (SEQ ID NO:1568)

EWEW (SEQ ID NO:1569)

WASLWEWF (SEQ ID NO:1570)

WAGLWEWF (SEQ ID NO:1571)

AKWASLWEWF (SEQ ID NO:1572)

AEWASLWEWF (SEQ ID NO:1573)

WASLWAWF (SEQ ID NO:1574)

AEWASLWAWF (SEQ ID NO:1575)

AKWASLWAWF (SEQ ID NO:1576)

WAGLWAWF (SEQ ID NO:1577)

AEWAGLWAWF (SEQ ID NO:1578)

WASLWAW (SEQ ID NO:1579)

AEWASLWAW (SEQ ID NO:1580)

WAGLWAW (SEQ ID NO:1581)

AEWAGLWAW (SEQ ID NO:1582)

DKWEWF (SEQ ID NO:1583)

IEWASLWEWF (SEQ ID NO:1584)

IKWASLWEWF (SEQ ID NO:1585)

DEWEWF (SEQ ID NO:1586)

GGWASLWNWF (SEQ ID NO:1587)

GGWNWF (SEQ ID NO:1588)

В другом предпочтительном варианте определенные энхансерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению включают энхансерные пептидные последовательности, показанные на фиг.2, 13 и в Таблице 1, несут консервативные замещения аминокислот в одном, двух или трех положениях, причем указанные аминокислотные замещения не устраняют способность энхансерных пептидных последовательностей усиливать фармакокинетические свойства гибридного полипептида в сравнении с соответствующим входящим в его состав коровым полипептидом.

Наиболее предпочтительно такие замещения приводят к получению энхансерных пептидных последовательностей, которые попадают в область консенсусных последовательностей в энхансерной пептидной последовательности. В указанных случаях замещения в основном происходят по аминокислотным остаткам, соответствующим положению «X», обозначенному в указанных выше консенсусных аминокислотных последовательностях и на фиг.1 и 2. Термин «консервативные замещения» относится к таким замещениям, когда указанное замещение осуществляется аминокислотными остатками с близкими значениями заряда, размера и/или гидрофобности/гидрофильности, что и замещаемая аминокислота. Отмеченные характеристики аминокислот хорошо известны специалистам в данной области техники.

Настоящее изобретение также относится к энхансерным пептидным последовательностям, включающим аминокислотные последовательности, приведенные на фиг.1, 2, 13 и в Таблице 1, которые во всем идентичны им, за тем исключением, что указанные энхансерные пептидные последовательности включают одну или более аминокислотных добавок (в основном не более чем примерно 15 аминокислотных остатков в длину), делеций (например, усечения на аминогруппе или на концевых участках) или неконсервативных замещений, которые тем не менее не устраняют способность полученных энхансерных пептидных последовательностей усиливать фармакокинетические свойства коровых полипептидов, к которым они присоединяются, в сравнении только с коровыми полипептидами без энхансерных пептидных последовательностей.

Добавки в основном не длиннее, чем 15 аминокислотных остатков, и могут включать добавки, включающие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных аминокислотных остатков. Предпочтительно общее число аминокислотных остатков, добавляемых к исходному энхансерному пептиду, не превышает примерно 15 аминокислотных остатков, более предпочтительно составляет не более чем примерно десять аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно составляет не более чем примерно пять аминокислотных остатков.

Делеции предпочтительно представляют собой такие делеции, которые включают не более чем примерно 3 аминокислотных остатка (либо последовательных, либо непоследовательных остатка), более предпочтительно делеции, включающие 2 аминокислотных остатка и наиболее предпочтительно делеции из одного аминокислотного остатка. В основном делеции представляют аминокислотные остатки, соответствующие остаткам «X» в консенсусных последовательностях энхансерного пептида.

Энхансерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению также включают определенные энхансерные пептидные последовательности, показанные на фиг.2, 13 и в Таблице 1, содержащие один, два или три неконсервативных аминокислотных замещения, причем предпочтительно наличие двух таких замещений и наиболее предпочтительно наличие одного такого замещения. Термин «неконсервативный» в отношении замещения относится к замещению аминокислотными остатками с несходными показателями заряда, веса и/или гидрофобности/гидрофильности в сравнении с заменяемым аминокислотным остатком. Такие характеристики аминокислот хорошо известны специалистам в данной области техники.

Кроме того, необязательно, чтобы аминокислотные замещения ограничивались генетически кодируемыми аминокислотами, что в равной мере относится и к определенным предпочтительным вариантам осуществления изобретения. Фактически пептиды могут содержать аминокислоты, не кодируемые генетически. Так, в дополнение к природным кодируемым генетически аминокислотам аминокислотные остатки в пептидах могут замещаться природными некодируемыми аминокислотами и синтетическими аминокислотами. Такие замещения могут также иметь место внутри коровых полипептидов в гибридных полипептидах согласно настоящему изобретению, независимо от того, присутствуют ли они в энхансерной последовательности/последовательностях в конкретном гибридном полипептиде.

В число часто встречающихся аминокислот, которые позволяют осуществить полезные замещения, входят, но не ограничиваются приведенным списком, следующие: β-аланин (β-Ala) и другие омега-аминокислоты, такие как 3-аминопропионовая кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота (Dpr), 4-аминомасляная кислота и т.д.; α-аминоизомасляная кислота (Aib); ε-аминогексаноевая кислота (Aha); δ-аминовалериановая кислота (Ava); N-метилглицин, или саркозин (MeGly); орнитин (Orn); цитруллин (Cit); т-бутилаланин (t-BuA); т-бутилглицин (t-BuG); N-метилизолейцин (Melle); фенилглицин (Phg); циклогексилаланин (Cha); норлейцин (Nle); нафтилаланин (Nal); 4-хлорфенилаланин (Phe(4-Cl)); 2-фторфенилаланин (Phe(2-F)); 3-фторфенилаланин (Phe(3-F)); 4-фторфенилаланин (Phe(4-F)); пеницилламин (Pen); 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота (Tic); β-2-тиенилаланин (Thi); метионинсульфоксид (MSO); гомоаргинин (hArg); N-ацетиллизин (AcLys); 2, 4-диаминомасляная кислота (Dbu); 2,3-диаминомасляная кислота (Dab); п-аминофенилаланин (Phe(pNH₂)); N-метилвалин (MeVal); гомоцистеин (hCys); гомофенилаланин (hPhe) и гомосерин (hSer); гидроксипролин (Hyp); гомопролин (hPro); -метилированные аминокислоты, аналоги циклических аминокислот (используемые, например, для ограничения структуры аминокислотных остатков до определенных конформационных состояний, например, αα'- и ββ'-замещенные циклические аминокислоты, такие как 1-аминоциклопентан-карбоновая кислота (циклолейцин) и ββ-циклопентаметилен-β-меркаптопропионовая кислота (см., например, Hruby et al., 1990, Biochem. J. 268: 249-262) и пептоиды или олигопептоиды (N-замещенные аминокислоты, например N-замещенные глицины; см., например, Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-9371).

Несмотря на то, что в большинстве случаев аминокислоты в пептиде замещаются L-энантиомерными аминокислотами, указанные замещения не ограничиваются L-энантиомерными аминокислотами. Так, определение «мутированная» или «измененная» формы в отношении аминокислот охватывает также те ситуации, при которых L-аминокислота замещается идентичной D-аминокислотой (например, L-Arg - D-Arg) или D-аминокислотой из той же категории или подкатегории (например, L-Arg - D-Lys) и наоборот. Такие замещения могут также иметь место на коровых полипептидах в гибридных полипептидах согласно настоящему изобретению, независимо от того, присутствуют ли они в энхансерной последовательности/энхансерных последовательностях конкретного гибридного полипептида.

В дополнение к описанным выше аминокислотным заменам замещения в боковых группах могут быть осуществлены при введении, например, метильной группы или псевдоизостерических групп с разными электронным свойствами (см., например, Hruby et al., 1990, Biochem. J. 268: 249-262). Кроме того, могут быть введены двойные связи между соседними атомами углерода в аминокислотах и циклических пептидах или могут быть образованы аналоги при введении ковалентных связей, таких как в случае образования амидной связи между - и С-концом, между двумя боковыми цепями или между боковой цепью и - или С-концом пептида. Такие замещения могут также иметь место внутри коровых полипептидов в гибридных полипептидах согласно настоящему изобретению, независимо от того, присутствуют они или нет в энхансерной последовательности/энхансерных последовательностях конкретного гибридного полипептида.

Коровый и гибридный полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть также конъюгированы с одной или большим числом химических групп. Химические группы, используемые для конъюгирования, предпочтительно не обладают существенной токсичностью или иммуногенностью, т.е. любая токсичность или иммуногенность, наблюдаемые для конъюгата корового или гибридного полипептида, незначительно (т.е меньше чем на 50%) выше, чем любая токсичность или иммуногенность, отмечаемые для немодифицированного корового или гибридного полипептида. Химические модификации корового и/или гибридного полипептидов осуществляются с целью оказания воздействия на фармакокинетические свойства полипептида. Указанные эффекты включают снижение или усиление эффективности лекарственного средства, стабильность, биодоступность, клиренс, иммуногенность и период полужизни in vivo, а также влияние на катаболизм полипептида, его направленную миграцию и локализацию.

В одном варианте осуществления изобретения проводят конъюгацию гибридных полипептидов с одной или большим числом химических групп, осуществляя ее как на коровой, так и на энхансерной частях полипептида. В другом варианте осуществления изобретения такие модификации могут быть осуществлены либо на коровой части полипептида, либо на части энхансерного пептида гибридных полипептидов. В еще одном варианте осуществления изобретения модифицируется только коровая часть полипептида в гибридном полипептиде. В еще одном варианте осуществления изобретения коровый полипептид модифицируют по одной или большему числу химических групп, причем такой коровый полипептид не представляет собой часть гибридного полипептида. Так, например, коровый полипептид, такой как Т1387 (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH₂) может быть модифицирован с помощью одной или большего числа химических групп.

Примеры химических групп, полезных для осуществления конъюгации, включают полимеры небелковой природы, такие как полиолы. Другие химические группы включают белки, такие как, например, альбумин или иммуноглобулин, а также углеводы, такие, например, как те углеводы