Аллергоид из яда пчел для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаление пчелами и способ его получения

Аллергоид из яда пчел для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаление пчелами и способ его получения

Реферат

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается создания безопасного высокоэффективного гипосенсибилизирующего аллергоида с иммуностимулирующим эффектом для аллерген-специфической иммунотерапии больных, страдающих аллергией к яду пчел.

Аллергия, формирующаяся при ужалениях пчел, ос, признана наиболее опасным видом инсектной аллергии.

Яд пчел содержит ряд фармакологически и биохимически активных веществ: биогенные амины (норадреналин, гистамин, серотонин и др.), пептиды (мелиттин, Мс-пептид, МСП-пептид, секапин, минимин, терциатин и др.), ферменты (фосфолипазы А, В, гиалуронидазу, кислую и щелочную фосфатазы, и др.). В настоящее время описаны и представлены в соответствии с требованиями современной Международной Номенклатуры следующие аллергены пчелы медоносной (табл.1).

Отмечено также, что яд пчелы, осы и шмеля имеет общие антигенные детерминанты, с которыми может быть связан эффект перекрестно-аллергических реакции при укусах указанных насекомых. На укусы пчел формируются токсические реакции как локальные, так и системные. В основе аллергических реакций лежат иммунологические механизмы, в том числе обширные локальные (местные) реакции, анафилактические, по типу сывороточной болезни. Природа аллергического ответа на яд перепончатокрылых (Hymenoptera) характеризуется продукцией специфических IgE- и IgG-антител. Последние могут быть выявлены у пациентов в течение недель и месяцев с момента укуса. Большинство авторов полагает, что увеличение IgG-антител связывается с ростом "блокирующих" (защитных) антител в организме больного. Клинически защитный эффект этих антител не во всех случаях имел место. Наличие IgE-антител связывают с наличием позитивных кожных тестов у больных. Специфические к яду пчелы IgE-антитела выявлены в сыворотках больных с общей и сильно выраженной местной реакцией на ужаление перепончатокрылым. Значительные уровни специфических IgG-антител выявлены у пчеловодов, которые неоднократно подвергались ужалению, что, по-видимому, свидетельствует о возможных защитных функциях IgG-антител, титры которых резко возрастают и у больных после специфической иммунотерапии.

Из известной разработки аллергоидной формы аллергена из яда пчел следует, что при ужалении пчелами лиц, имеющих сенсибилизацию к яду перепончатокрылых, могут возникать острые аллергические реакции вплоть до анафилактического шока. Единственным надежным методом профилактики и терапии этих состояний является специфическая иммунотерапия (СИТ) аллергеном из яда пчел (ЯП). Однако в процессе СИТ при введении малых доз аллергенов сохраняется риск получения у больных реакций анафилактического типа.

Разработан препарат аллергоид (АЛД) из яда пчел Apis mellifera на основе модификации формальдегидом нативного аллергена с использованием иммунохимического (гель-хроматография, иммуноблоттинг) и клинико-лабораторного анализа (ИФА, хемилюминисценция). На основе главных аллергенов (фракции с ММ=3-12 kD, 16-31 kD, 38-46 kD) сформирована основная аллергенная фракция (ОАФ). В экспериментах на животных изучена динамика IgG-"блок"-антител по А.Д.Адо и соавт., 1991 (В.Н.Федосеева, А.И.Мартынов, И.А.Орлова, Т.Г.Федоскова. Разработка лечебной формы аллергоида из яда пчел. -"Аллергология и иммунология, том 4, №2, 2003, стр.84. Материалы V Съезда иммунологов и аллергологов СНГ, Санкт-Петербург, Россия, 8-11 июля 2003).

Задачей настоящего изобретения является создание препарата для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаления пчелами, обладающего специфической активностью и безопасного.

Для решения поставленной задачи предлагается группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом:

Аллергоид для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаления пчелами, содержащий аллергенные фракции с молекулярной массой 3-12, 16-31, 38-46, а также 20 и 60 kD и полученный путем полимеризации суммарной аллергенной фракции формальдегидом и стабилизации NaBH₄.

Предложен способ получения аллергоида, заключающийся в экстрагировании яда пчел, растворении яда в физрастворе, стабилизации сывороточным альбумином человека, осветлении, очищении диализом не более 3-х часов и выделении суммарной аллергенной фракции с последующей обработкой формальдегидом для полимеризации белков при смене температуры от +4°С до +22°С, по окончании полимеризации проводят диализ, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, стабилизируют NaBH₄, лиофильно высушивают.

Осветление пчелиного яда проводят центрифугированием.

Полимеризацию осуществляют в течение 30 дней.

Предложен также способ аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаления пчелами, в котором используется вышеназванный аллергоид.

Для получения аллергоида проводят:

1) Растворение пчелиного яда в физиологическом растворе,

2) Стабилизацию пчелиного яда сухим ЧСА (сывороточный альбумин человека),

3) Осветление стабилизированного пчелиного яда центрифугированием,

4) Коррекцию рН (до 7,0),

5) Очистку диализом,

6) Хроматографию и выделение главных и минорных аллергенов,

7) Получение суммарной аллергенной фракции для перевода в аллергоидную форму (фракции с ММ=3-12, 16-31, 38-46 kD - главные; 20 и 60 kD - малые),

8) Изучение иммунохимических свойств,

9) Изучение биологических свойств,

10) Обработку суммарной аллергенной фракции формальдегидом, при которой происходит полимеризация белков, в течение 30 дней со сменой температурных режимов от 4 до 22°С,

11) Диализ,

12) Центрифугирование (6000 об/мин в течение 30 мин),

13) Стабилизацию NaBH₄,

14) Лиофильное высушивание.

Проводили изучение иммунохимических свойств аллергоида, разработана схема АСИТ (аллерген-специфическая иммунотерапия), изучены биологические свойства аллергоида, специфическая активность, доказана безопасность препарата.

Для лечения больных с аллергическими реакциями на ужаление пчелами проводили симптоматическую терапию острой реакции на ужаление пчелы и аллерген-специфическую иммунотерапию аллергенами из яда пчел.

Разработана схема гипосенсибилизации животных, которая может быть использована в клинике. Принцип введения возрастающих доз по определенной схеме приведен в таблице 2.

Приведенные экспериментальные исследования и испытания на добровольцах показали, что заявленный аллергоид безвреден.

Таблица 1Аллергены яда пчелы медоносной (Apis mellifera)
Название	Аллерген	Mm
Apis mellifera (Honey bee)	Api m 1 (Phosfolipase A2)	16,000
Api m 2 (Hyaluronidase)	44,000
Api m 4 (Melittin)	3,000

1. Аллергоид для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаления пчелами, характеризующийся тем, что он содержит аллергенные фракции с молекулярной массой 3-12; 16-31; 38-46, а также 20 и 60 kD и полученный путем полимеризации суммарно аллергенной фракции формальдегидом и стабилизации NaBH₄.

2. Способ получения аллергоида, характеризующийся тем, что яд пчел экстрагируют, при этом яд растворяют в физрастворе, далее стабилизируют сывороточным альбумином человека, осветляют, затем очищают диализом не более 3 ч и выделяют суммарную аллергенную фракцию с молекулярной массой 3-12; 16-31; 38-46, а также 20 и 60 kD, которую затем обрабатывают формальдегидом для полимеризации белков при смене температуры от 4 до 22°С, по окончании полимеризации проводят диализ, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, полученный аллергоид стабилизируют NaBH₄ и лиофильно высушивают.

3. Способ по п.2, осветление пчелиного яда проводят центрифугированием.

4. Способ по п.2, полимеризацию осуществляют в течение 30 дней.

5. Способ аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергической реакцией на ужаления пчелами, характеризующийся тем, что используют аллергоид по п.1.