Вакцина везикул наружных мембран (omv), содержащая белки наружной мебраны n.meningitidis серологической группы в

Вакцина везикул наружных мембран (omv), содержащая белки наружной мебраны n.meningitidis серологической группы в

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к вакцинам против Neisseria meningitidis, серологической группы В (NmB).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все цитируемые здесь документы включены в качестве ссылки в их полном виде.

Neisseria meningitidis является неподвижным грамотрицательным диплококковым патогеном человека. Она колонизирует глотку, вызывая менингит, и изредка при отсутствии менингита септицемию. В Соединенных Штатах Америки уровень заражения равен 0,6-1 на 100000 человек в год, и он может быть более высоким во время вспышек эпидемии (см. Lieberman et al. (1996) JAMA 275 (19). 1499-1503; Schuchat et al. (1997) N Engl J Med 337 (14):970-976). В развивающихся странах темпы эндемического заболевания являются гораздо более высокими и во время эпидемий "уровни" заболеваемости могут достигать 500 случаев на 100000 человек в год. Смертность является крайне высокой, 10-20% в Соединенных Штатах и гораздо более высокой в развивающихся странах. После введения конъюгированной вакцины против Haemophilus influenzae, N. meningitidis является главной причиной бактериального менингита для всех возрастов в Соединенных Штатах (Schuchat et al. (1997) supra).

На основании капсулярного полисахарида данного организма были идентифицированы 12 серологических групп N. meningitidis. Менингококковая вакцина, применяемая в настоящее время, является четырехвалентной вакциной, составленной из серологических групп А, С, Y и W135. Однако после успеха вакцинации против Н. influenzae были разработаны конъюгатные вакцины против серологических групп А и С.

Однако серологическая группа В остается проблемой, и она является в настоящее время ответственной за приблизительно 50% случаев общего менингита в Соединенных Штатах, Европе и Южной Африке. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α (2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, который также присутствует в тканях млекопитающих. Это приводит к устойчивости к этому антигену; в самом деле, если бы ответная реакция индуцировалась, она была бы реакцией против аутоантигена и, следовательно, нежелательной. Во избежание индукции аутоиммунитета и для индукции защитной иммунной реакции этот капсулярный полисахарид был, например, химически модифицирован заменой N-ацетильных групп N-пропионильными группами, с сохранением неизмененной специфической антигенности (Romero & Outschoorn (1994) Clin Microbiol Rev 7(4):559-575).

Эффективная вакцина пузырьков (везикул) наружных мембран (OMV) против серологической группы В была получена Норвежским Национальным Институтом Общественного Здравоохранения [см., например, Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-96]. Хотя эта вакцина является безопасной и предупреждает заболевание NmB, ее эффективность ограничена штаммом, используемым для приготовления этой вакцины. Сообщалось также о других вакцинах на основе препаратов наружных мембран. Целью данного изобретения является расширение действия этих вакцин на другие штаммы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что дополнительное добавление определенных компонентов к вакцинам OMV значительно расширяет их эффективность.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую (а) препарат наружной мембраны NmB и (b) иммуногенный компонент, выбранный из одного или нескольких из следующих компонентов:

- белок, раскрытый в WO 99/57280, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/36544, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/24578, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/66791, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в работе Tettelin et al. [Science (2000) 287:1809-1815], или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в работе Parkhill et al. [Nature (2000) 404:502-506], или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 97/28273, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 96/29412, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 95/03413, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/31132, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/58683, или его иммуногенный фрагмент;

- белок, раскрытый в WO 99/55873,или его иммуногенный фрагмент; и/или

- белок PorA, TbpA, TbpB, PilC, ОрА или Omp85 Neisseria meningitidis.

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/24578, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890 и 892, как описано в WO 99/24578 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/36544, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 и 90, как описано в W099/36544 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в работе Tettelin et al. (т.е. белок, кодируемый одним из генов, описанных в этой работе), указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из NMB0001-NMB2160 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одного или нескольких из этих 2160 генов, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одним из этих 2160 генов).

Если эта композиция содержит белок, описанный в работе Parkhill et al., указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 2121 кодирующих последовательностей, описанных в этой работе (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих 2121 последовательностей, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих 2121 последовательностей).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/57280, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 1000, 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092, 10.94, 1096, 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174, 1176, 1178, 1180, 1182, 1184, 1186, 1188, 1190, 1192, 1194, 1196, 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 1220, 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236, 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256, 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276, 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 1288, 1290, 1292, 1294, 1296, 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316, 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336, 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356, 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376, 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 1392, 1394, 1396, 1398, 1400, 1402, 1404, 1406, 1408, 1410, 1412, 1414, 1416, 1418, 1420, 1422, 1424, 1426, 1428, 1430, 1432, 1434, 1436, 1438, 1440, 1442, 1444, 1446, 1448, 1450, 1452, 1454, 1456, 1458, 1460, 1462, 1464, 1466, 1468, 1470, 1472, 1474, 1476, 1478, 1480, 1482, 1484, I486, 1488, 1490, 1492, 1494, 1496, 1498, 1500, 1502, 1504, 1506, 1508, 1510, 1512, 1514, 1516, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526, 1528, 1530, 1532, 1534, 1536, 1538, 1540, 1542, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560, 1562, 1564, 1566, 1568, 1570, 1572, 1574, 1576, 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596, 1598, 1600, 1602, 1604, 1606, 1608, 1610, 1612, 1614, 1616, 1618, 1620, 1622, 1624, 1626, 1628, 1630, 1632, 1634, 1636, 1638, 1640, 1642, 1644, 1646, 1648, 1650, 1652, 1654, 1656, 1658, 1660, 1662, 1664, 1666, 1668, 1670, 1672, 1674, 1676, 1678, 1680, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1706, 1708, 1710, 1712, 1714, 1716, 1718, 1720, 1722, 1724, 1726, 1728, 1730, 1732, 1734, 1736, 1738, 1740, 1742, 1744, 1746, 1748, 1750, 1752, 1754, 1756, 1758, 1760, 1762, 1764, 1766, 1768, 1770, 1772, 1774, 1776, 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796, 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816, 1818, 1820, 1822, 1824, 1826, 1828, 1830, 1832, 1834, 1836, 1838, 1840, 1842, 1844, 1846, 1848, 1850, 1852, 1854, 1856, 1858, I860, 1862, 1864, 1866, 1868, 1870, 1872, 1874, 1876, 1878, 1880, 1882, 1884, 1886, 1888, 1890, 1892, 1894, 1896, 1898, 1900, 1902, 1904, 1906, 1908, 1910, 1912, 1914, 1916, 1918, 1920, 1922, 1924, 1926, 1928, 1930, 1932, 1934, 1936, 1938, 1940, 1942, 1944, 19.46, 1948, 1950, 1952, 1954, 1956, 1958, 1960, 1962, 1964, 1966, 1968, 1970, 1972, 1974, 1976, 1978, 1980, 1982, 1984, 1986, 1988, 1990, 1992, 1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008, 2010, 2012, 2014, 2016, 2018, 2020, 2022, 2024, 2026, 2028, 2030, 2032, 2034, 2036, 2038, 2040, 2042, 2044, 2046, 2048, 2050, 2052, 2054, 2056, 2058, 2060, 2062, 2064, 2066, 2068, 2070, 2072, 2074, 2076, 2078, 2080, 2082, 2084, 2086, 2088, 2090, 2092, 2094, 2096, 2098, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2110, 2112, 2114, 2116, 2118, 2120, 2122, 2124, 2126, 2128, 2130, 2132, 2134, 2136, 2138, 2140, 2142, 2144, 2146, 2148, 2150, 2152, 2154, 2156, 2158, 2160, 2162, 2164, 2166, 2168, 2170, 2172, 2174, 2176, 2178, 2180, 2182, 2184, 2186, 2188, 2190, 2192, 2194, 2196, 2198, 2200, 2202, 2204, 2206, 2208, 2210, 2212, 2214, 2216, 2218, 2220, 2222, 2224, 2226, 2228, 2230, 2232, 2234, 2236, 2238, 2240, 2242, 2244, 2246, 2248, 2250, 2252, 2254, 2256, 2258, 2260, 2262, 2264, 2266, 2268, 2270, 2272, 2274, 2276, 2278, 2280, 2282, 2284, 2286, 2288, 2290, 2292, 2294, 2296, 2298, 2300, 2302, 2304, 2306, 2308, 2310, 2312, 2314, 2316, 2318, 2320, 2322, 2324, 2326, 2328, 2330, 2332, 2334, 2336, 2338, 2340, 2342, 2344, 2346, 2348, 2350, 2352, 2354, 2356, 2358, 2360, 2362, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2374, 2376, 2378, 2380, 2382, 2384, 2386, 2388, 2390, 2392, 2394, 2396, 2398, 2400, 2402, 2404, 2406, 2408, 2410, 2412, 2414, 2416, 2418, 2420, 2422, 2424, 2426, 2428, 2430, 2432, 2434, 2436, 2438, 2440, 2442, 2444, 2446, 2448, 2450, 2452, 2454, 2456, 2458, 2460, 2462, 2464, 2466, 2468, 2470, 2472, 2474, 2476, 2478, 2480, 2482, 2484, 2486, 2488, 2490, 2492, 2494, 2496, 2498, 2500, 2502, 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2534, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 2594, 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 2646, 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 2684, 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 2756, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 2774, 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 2882, 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2930, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 2950, 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 3016, 3018 и 3020, как описано в WO 99/572.80 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в W099/28273, указанный белок является предпочтительно белком, представленным на фигуре 4 или фигуре 13 WO 97/28273.

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 96/29412, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-8, описанных в WO 96/29412 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 95/03413, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-23, описанных в WO 95/03413 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент одной или нескольких из этих SEQ ID, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с одной из этих SEQ ID).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/31132, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, описанной в WO 99/31132 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO:2, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO:2).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/58683, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, описанных в WO 99/58683 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4).

Если эта композиция содержит белок, описанный в WO 99/55873, указанный белок предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, описанных в WO 99/55873 (или белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или белок, содержащий последовательность, имеющую идентичность последовательности (предпочтительно более высокую, чем 50%, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID.NO:2 или SEQ ID NO:4).

Подробности относительно Ора и PorA могут быть найдены в работе Wiertz et al. [Infect. Iinmun. (1996) 61:298-304]. PilC описан в работе Nassif et al. [PNAS USA (1994) 91:3769-73]. Omp85 описан в работе Manning et al. [Microb. Pathog. (1998) 25:11-21]. TbpA и TbpB описаны в работе Ala'Aldeen & Borriello [Vaccine (1996) 14:49-53], а также в работе Legrain et al. [Protein Expr Purif (1995) 6:570-578].

Предпочтительными белками для компонента (b) являются:

- белок '919', представляемый SEQ ID NO:3069-3074 и 3207-3241 WO 99/57280 (см. также фигуру 23 и пример 15 в нем).

- белок '235', представляемый SEQ ID NO:869-874 и 3149-3178 WO 99/57280 (см. также фигуру 20 и пример 12 в нем).

- белок '519', представляемый SEQ ID NO:3045-3056 и 3185-3206 WO 99/57280 (см. также фигуру 22 и пример 14 в нем).

- белок '225', представляемый SEQ ID NO:793-804 и 3115-3148 WO 99/57280 (см. также фигуру 19 и пример 11 в нем).

- белок 'ORF40', представляемый примером 1 (SEQ ID NO:1-6) WO 99/36544 (см. также фигуру 1 WO 00/66741; см. также WO 99/31132 и WO 99/58683).

- белок '287', представляемый примером 9 W099/57280 (см. SEQ ID NO:1199-1204, 3103-3108 и 3179-3184 в нем).

- белок 'ORF1', представляемый примером 77 (SEQ ID NO:647-654) WO 99/24578 (см. также WO 99/55873 и номер доступа AJ 242535).

- белок 'ORF4', представляемый примером 26 (SEQ ID NO:215-2.26) WO 00/24578 (см. также фигуру 2 WO 00/66741).

- белок 'ORF46', представляемый примером 55 (SEQ ID. NO:457-466) WO 99/24578 (см. также фигуру 12 WO 00/66741).

Компонент (b) этой композиции является предпочтительно белком NmB. Предпочтительно компонент (b) включает в себя белок из штамма NmB, отличающегося от штамма, из которого получен компонент OMV (а), т.е. OMV в компоненте (а) предпочтительно дополняется иммуногенным компонентом (b) из отличающегося штамма NmB.

Один или несколько компонентов (или все компоненты) могут быть адсорбированы на Al(ОН)₃.

Компонент препарата наружной мембраны

Композиции данного изобретения включают в себя препарат наружной мембраны NmB в качестве компонента (а). Предпочтительно он находится в форме пузырьков (везикул) наружных мембран (OMV).

Получение OMV из NmB хорошо известно в данной области. Способы получения подходящих препаратов описаны, например, в работах: Claassen et al. [Vaccine (1996) 14:1001-1008]; Cartwright et al. [Vaccine (1999) 17:2612-2619]; Peeters et al. [Vaccine (1996) 14:1009-1015]; Fu et al. [Biotechnology NY (1995) 12:170-74]; Davies et al. [J.Immunol. Meth. (1990) 134:215-225]; Saunders et al. [Infect. Immun. (1999) 67:113-119]; Draabick et al. [Vaccine (2000) 18:160-172]; Moreno et al. [Infect. Immun. (1985) 47:527-533]; Milagres et al. [Infect. Immun. (1998) 66:959-965]; Rosenqvist et al. [Dev. Biol. Stand. (1998) 92:323-333]; Haneberg et al. [Infect. Iinmun. (1994) 62:4419-4424]; Naess et al. [Infect. Immun. (1998).66:1334-41]; Andersen et al. [Vaccine (1997) 15:1225-34]; Bjune et al. [Lancet (1991) 338:1093-96] ets.

OMV представляют собой предпочтительно дезоксихолатный экстракт из NmB (т.е. полученный из NmB экстракцией дезоксихолатом). Предпочтительным протоколом экстракции является протокол, который описан Fredriksen et al. [Production, characterization and control of MenB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group В meningococcal disease (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80].

Предпочтительным штаммом, из которого следует экстрагировать OMV, является штамм 44/76 (В:15:Р1.1,16:P5.5:L3,7,9) N. meningitidis.

Дополнительные подробности в отношении компонента OMV могут быть найдены, например, в работах Bjune et al. [Lancet (1991) 338(8775):1093-96] или Fredriksen et al. [Characterization of high molecular weight component in MenB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group В meningococcal disease. Pages 818-824 of Pathobiology and Immunology of Neisseriaceae (eds. Conde-Glez et al.) ISBN 968-6502-13-0].

Компонент OMV может быть адсорбирован на адъюванте гидроксиде алюминия. Предпочтительное отношение белок : адъювант равно 1:67 (масса/масса).

Типичная доза вакцины для человека содержит 25 мкг белка, 2 мкг LPS и 1,67 мг Al(ОН)₃ и может быть инъецирована в объемах 0,5 мл в дельтовидную мышцу.

Компонент OMV (например, полученный экстракцией дезоксихолатом) может быть обработан для удаления определенных компонентов. Например, могут быть удалены пирогены или токсичные компоненты (например, LPS).

Предпочтительно компонент OMV должен сохранять антигенный компонент 80 кДа, описанный Fredriksen et al. [pages 818-824 of Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae].

Более предпочтительно компонент OMV должен сохранять белок, содержащий одну или несколько следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 [или (i) белок, имеющий идентичность последовательности с SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 в зависимости от конкретной SEQ ID, степень идентичности последовательности предпочтительно является большей, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более), который включает в себя мутанты и аллельные варианты, или (ii) белок, содержащий иммуногенный фрагмент SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 фрагмент должен содержать по меньшей мере п последовательных аминокислот из этой последовательности, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 или большему числу (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или большему числу)].

Комбинирование компонентов (а) и (b)

Компоненты (а) и (b) могут комбинироваться простым смешиванием компонента (а) с препаратом наружных мембран (например, смешиванием ORF4 с Норвежскими OMV).

В качестве альтернативы, они могут комбинироваться" манипулированием бактерии таким образом, что она продуцирует (предпочтительно сверхпродуцирует) компонент (а) в ее наружной мембране - препарат наружных мембран из такой рекомбинантной бактерии будет содержать как компонент (а), так и компонент (b).

Подходящие бактерии для манипуляции, таким образом, включают в себя Neisseria meningitidis (любую серологическую группу или штамм), Neisseria lactamica, Neisseria cinerea или любую другую не позволяющую типирования Neisseria. Могут быть также использованы грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli, Salmonella, Shigella, Bordetella, Yersinia, Helicobacter и т.д. Способы трансформации хорошо известны в данной области.

Поливалентные вакцины

Необязательно, композиция данного изобретения может также содержать один или несколько из следующих компонентов:

- защитный антиген против серологической группы А Neisseria meningitidis;

- защитный антиген против серологической группы С Neisseria meningitidis;

- защитный антиген против серологической группы У Neisseria meningitidis;

- защитный антиген против серологической группы W Neisseria meningitidis;

- защитный антиген "против Haemophilus influenzae;

- защитный антиген против Pneumococcus;

- защитный антиген против дифтерии;

- защитный антиген против столбняка;

- защитный антиген против коклюша;

- защитный антиген против Helicobacter pylori;

- защитный антиген против полиомиелита; и/или

- защитный антиген против вируса гепатита В.

Предпочтительными примерами этих необязательных компонентов являются:

- полисахаридный антиген против серологической группы А Neisseria meningitidis;

- полисахаридный антиген против серологической группы С Neisseria meningitidis, такой как антиген, описанный Constantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698;

- полисахаридный антиген против серологической группы У Neisseria meningitidis;

- полисахаридный антиген против серологической группы W Neisseria meningitidis;

- полисахаридный антиген против Haemophilus influenzae;

- полисахаридный антиген против Pneumococcus;

- защитный антиген против дифтерии, состоящий из дифтерийного токсоида, например мутанта CRM197 [см., например, Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70].

- защитный антиген против столбняка, состоящий из столбнячного токсоида [см., например, Wassilak & Orenstein, Chapter 4 of Vaccine (eds. Plotkin & Mortimer), 1988].

- защитный антиген против коклюша, содержащий голотоксин коклюша (РТ) и нитевидный гемагглютинин (FHA); необязательно содержащий дополнительно пертактин и/или агглютиногены 2 и 3 [см., например, Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238].

- защитный антиген против Н. pylori, содержащий один или несколько из CagA (например, WO 93/18150), VacA (например, WO 93/18150), NAP (например, WO 99/53310), НорХ (например, WO 98/04702), HopY (например, WO 98/04702), уреазы.

- защитный антиген против вируса гепатита В, состоящий из поверхностного антигена HBV и/или корового антигена HBV.

Если композиция содержит антиген против дифтерии, она предпочтительно содержит также антигены против столбняка и полиомиелита. Если композиция содержит антиген против столбняка, она предпочтительно содержит также антигены против дифтерии и полиомиелита. Если композиция содержит антиген против полиомиелита, она предпочтительно содержит также антигены против дифтерии и столбняка.

Токсин коклюша является токсичным белком и, если он присутствует в композиции, он предпочтительно является детоксифицированным. Детоксификация может быть химической и/или может проводиться генетическими способами. Предпочтительным детоксифицированным мутантом является двойной мутант 9K/129G [см., например, Rappuoli (1997) Nature Medicine 3:374-376].

Если композиция включает в себя белок, который существует в различных насцентных и зрелой формах, используют предпочтительно зрелую форму этого белка. Например, если включен белок NspA (WO 96/29412; см. также Martin et al. (1997) J. Exp. Med. 185 1173-1183), предпочтительно используют зрелую форму этого белка, лишенную сигнального пептида.

Если композиция включает в себя полисахаридный антиген, этот полисахарид предпочтительно конъюгирован с белком-носителем.

Терапия, профилактика, диагностика

Композиция данного изобретения предпочтительно является вакциной. Вакцины в соответствии с данным изобретением могут быть либо профилактическими (т.е. для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфицирования).

Данное изобретение обеспечивает также композиции данного изобретения для применения в качестве лекарственных средств (предпочтительно вакцин) или диагностических реагентов. Оно обеспечивает также использование композиции в соответствии с данным изобретением в приготовлении: (i) лекарственного средства для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут быть любым видом или штаммом (таким как Neisseria gonorrhoeae), но предпочтительно они являются N. meningitidis, в частности, серологической группы В (NmB).

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения пациента, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции данного изобретения. Этот способ предпочтительно является иммунизацией.

Способы

Согласно следующим аспектам, данное изобретение обеспечивает различные способы.

Обеспечен способ получения композиции данного изобретения, предусматривающий стадию экстракции (например, экстракции дезоксихолатом) OMV из N. meningitidis.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В списке последовательностей представлены следующие последовательности:

SEQ ID NO:	ОПИСАНИЕ
1	N-концевая последовательность белка 80-85 кДа N. meningitidis серологической группы В
2	Полный ген из N. meningitidis серологической группы В
3	Кодируемый белок из SEQ ID NO:2
4	Сигнальная последовательность белка из SEQ ID NO:3
5	Зрелый белок из SEQ ID NO:3
6	Полный ген из N. gonorrhoeae, гомологичный SEQ ID NO:2
7	Кодируемый белок из SEQ ID NO:6
8	Сигнальный пептид белка из SEQ ID NO:7
9	Зрелый белок из SEQ ID NO:7
10	Полный ген из N. meningitidis серологической группы А, гомологичный SEQ ID NO:2
11	Кодируемый белок из SEQ ID NO:10
12	Сигнальный пептид белка из SEQ ID NO:11
13	Зрелый белок из SEQ ID NO:11
14	Белок '919' из штамма 2996 NmB

СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее следует краткое изложение стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для выполнения данного изобретения (например, применение описанных последовательностей для вакцинации или для диагностических целей). Это краткое изложение не является ограничением в отношении данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет использовать, если нет других указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие способы объясняются в полном виде в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds 1986).

В данной заявке используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Белки, используемые с данным изобретением, могут быть получены различными способами (например, рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом и т.д.) и в различных формах (например, нативные белки, слитые белки и т.д.). Предпочтительно их получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащими других белков Neisseria или белков клетки-хозяина).

Нуклеиновые кислоты, используемые с данным изобретением, могут быть получены многими способами (например, химическим синтезом, из библиотек геномной ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и могут быть в разных формах (например, в виде одноцепочечных, двухцепочечных ДНК, в виде векторов, зондов и т.д.). Термин "нуклеиновая кислота" включает в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные скелеты, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу от общего количества X+Y в этой композиции составляет X. Предпочтительно Х составляет по меньшей мере около 90% по весу от общей суммы X+Y в композиции, более предпочтительно по меньшей мере около 95% или даже 99% по весу.

Термин «содержащий» означает «включающий», а также «состоящий», например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из Х или может включать в себя что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин «гетерологичный» относится к двум биологическим компонентам, которые не находятся вместе в природе. Этими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные районы, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, как, например, когда промотор, гетерологичный для гена, функционально связан с этим геном. Другим примером является случай, когда последовательность Neisseria является гетерологичной для мышиной клетки-хозяина. Дополнительными примерами могли бы быть два эпитопа из одного и того же или различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, не обнаруживаемом в природе.

«Точка начала репликации» (ориджин) является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Точка начала репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способной к репликации под ее собственным контролем. Точка начала репликации может быть необходимой для репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. С определенными точками начала репликации экспрессирующий вектор может быть репродуцирован с высоким числом копий в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами точек начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые являются эффективными в дрожжах; и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Идентичность между белками предпочтительно определяют с использованием алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, осуществляемого в программе MPSRCH (Oxford Molecular) с применением поиска аффинных гэпов с параметрами штрафа открытого гэпа=12 и штрафа удлинения гэпа=1. Обычно 50%-ная или более высокая идентичность между двумя белками считается указанием на функциональную эквивалентность.

В применении здесь, «аллельный вариант» молекулы нуклеиновой кислоты или района нуклеиновой кислоты, для которого обеспечена здесь последовательность нуклеиновой кислоты, является молекулой нуклеиновой кислоты или районом нуклеиновой кислоты, которые встречаются по существу в том же самом локусе в геноме другого или второго изолята, и молекулой, которая вследствие природной изменчивости, обусловленной, например, мутацией или рекомбинацией, имеет сходную, но не идентичную последовательность нуклеиновой кислоты. Аллельный вариант кодирующего района обычно кодирует белок, имеющий сходную активность с активностью белка, кодируемого геном, с которым его сравнивают. Аллельный вариант может также содержать изменение в 5'- или 3'-нетранслируемых районах этого гена, например, в регуляторных районах (например, см. патент США US 5753235).

Системы экспрессии

Нуклеотидные последовательности Neisseria могут быть экспрессированы в разнообразных системах экспрессии; например, системах экспрессии, которые используются клетками млекопитающих, бакуло вирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Системы экспрессии млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь район инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности, и ТАТА-блок, обычно расположенный на 25-30 пар оснований (п.н.) выше (против хода транскрипции) от сайта инициации транскрипции. Предполагается, что ТАТА-блок определяет начало синтеза РНК РНК-полимеразой II в правильном месте. Промотор млекопитающих содержит также левый промоторный элемент, обычно расположенный на 100-200 п.н. выше ТАТА-блока. Левый промоторный элемент определяет скорость, при которой инициируется транскрипция и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Гены вирусов млекопитающих часто являются высокоэкспрессируемыми и имеют широкий спектр хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают в себя ранний Промотор SV40, LTR-промотор мышиного вируса опухоли молочной железы, основной поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, произведенные из невирусных генов, таких как ген мышиного металлотионеина, также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцируемой), в зависимости от того, может ли данный промотор индуцироваться глюкокортикоидом в чувствительных к гормону клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни транскрипции. Энхансер является регуляторной последовательностью ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичным или гетерологичным промоторами, причем синтез начинается в нормальном стартовом (инициирующем) сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены против хода транскрипции (выше) или по ходу транскрипции (ниже) от сайта инициации транскрипции либо в нормальной, либо в обратной ориентации или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, произведенные из вирусов, могут быть особенно применимыми, так как они обычно имеют широкий спектр хозяев. Примеры включают в себя энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, произведенные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1989) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с этой молекулой ДНК, и в этом случае первая аминокислота на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионином, который кодируется инициирующим кодоном ATG. Если желательно, этот N-конец может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно имеются сайты процессинга, кодируемые между этим лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут быть отщеплены in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией белка из клетки. Аденовирусный лидер, состоящий из трех частей, является примером лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в