Способы стабильной трансдукции клеток вирусными векторами

Способы стабильной трансдукции клеток вирусными векторами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам, а также к композициям, применяемым в этих способах, для эффективной и стабильной трансдукции клеток с использованием вирусных векторов. Эти способы позволяют увеличить эффективность трансдукции посредством контактирования трансдуцируемой клетки с одной или несколькими молекулами, которые связываются с клеточной поверхностью. Стадия контактирования может быть осуществлена до или после введения или одновременно с введением вирусного вектора в эти клетки. Настоящее изобретение также относится к использованию стабильно трансдуцируемых клеток в других целях, включая экспрессию нуклеиновых кислот, присутствующих в векторе, или лечение живых организмов.

Предпосылки создания изобретения

Методы "трансфекции", которые в основном относятся к введению генетического материала в клетку, внесли огромный вклад в молекулярную и рекомбинантную революцию в области биологии. Примерами методов трансфекции высших эукариотических клеток являются преципитация фосфатом кальция, обработка DEAE-декстраном, электропорация, микроинжекция, липофекция, инфицирование вирусом и другие методы, описанные во многих научных руководствах и журналах.

Из методов трансфекции уникальным методом является использование вирусной инфекции, где природный вирус, используемый как средство введения его генетического материала в клетку, имеет то преимущество, что он переносит желаемую молекулу нуклеиновой кислоты в клетку. Примерами вирусов, модифицированных и используемых в таких методах, являются аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы простого герпеса и ретровирусы. В общих чертах, в вирусный геном могут быть клонированы желаемые молекулы нуклеиновой кислоты. После репликации и упаковки вирусного генома полученная вирусная частица способна доставлять желаемую нуклеиновую кислоту в клетку в соответствии с механизмом внедрения вируса в клетку.

В основном вирусный геном сначала делают дефектным по репликации посредством модификации нуклеиновой кислоты, а затем добавляют желаемую нуклеиновую кислоту. Полученный вирусный геном или вирусный вектор, для осуществления сборки вирусной частицы и ее высвобождения из клетки, требует использования вируса-помощника или системы упаковки. Метод, в котором для переноса желаемого генетического материала в клетку используется вирусный вектор или вирусная частица, называется "трансдукцией". Таким образом, в общих чертах, "трансдукция" клетки предусматривает использование вирусного вектора или вирусной частицы для переноса генетического материала в клетку.

Из методов трансдукции особый интерес для генетической модификации клеток млекопитающих представляет использование ретровирусов. Особый интерес представляет использование модифицированных ретровирусов для введения генетического материала в клетки в целях лечения заболеваний, связанных с генетическими дефектами, и других заболеваний. Такой метод может быть использован, например, в случае клеток гемопоэтической системы, где ретровирусы и лентивирусные векторы являются объектом интенсивных исследований.

Так, например, Movassagh и др. в своих исследованиях обсуждают попытки повысить эффективность опосредуемой ретровирусом трансдукции путем использования результатов исследования клеточного цикла активированных Т-клеток. По существу, эти результаты зависят от активного деления клеток в процессе трансдукции. Эта работа также ограничена использованием мышиного онкоретровируса и требованием значительной предварительной стимуляции клеток перед трансдукцией клеток.

June et al. (WO 96/34970) описывают использование стимуляции Т-клеток в целях повышения уровня трансфекции Т-клеток. Другой работой, посвященной трансдукции Т-клеток с использованием активированных или стимулированных клеток, является публикация Douglas et al., Hooijberg et al., Onodera et al., Klebba et al., Barry et al. и Unutmaz et al. К сожалению, ни в одной из этих работ не была продемонстрирована эффективность трансдукции более, чем примерно на 65%.

Costello и др. описали трансдукцию стимулированных и нестимулированных Т-клеток с использованием лентивирусных векторов на основе вируса-1 иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Максимум эффективности, которую они наблюдали, составляла лишь примерно 17% для стимулированных первичных Т-клеток и менее 19% для нестимулированных Т-клеток. Эти авторы также отмечали ограниченную возможность увеличения эффективности до не более, чем 36% для стимулированных Т-клеток путем введения вспомогательных белков ВИЧ-1.

Chinnasamy и др. также описали увеличение эффективности трансдукции в присутствии вспомогательных белков ВИЧ-1 как в нестимулированных, так и в стимулированных митогеном Т-клетках. Подобно Movassagh и др., Chinnasamy и др. перед трансдукцией с использованием лентивирусного вектора осуществляли предварительную стимуляцию лимфоцитов крови в течение продолжительного периода времени. Сначала через 3 дня после трансдукции Chinnasamy и др. наблюдали эффективность трансдукции более чем на 96%, однако через две недели после трансдукции процент стабильно трансдуцируемых клеток снижался до 71,2%. Haas и др. также наблюдали кратковременную трансдукцию и "псевдотрансдукцию" в клетках, трансдуцированных лентивирусным вектором, способным экспрессировать маркерный ген (белок, флуоресцирующий в "зеленом" диапазоне спектра). Даже через три дня после трансдукции значительная (выше 10%) кратковременная трансдукция была детектирована на основе неинтеграционной экспрессии маркерного гена в трансдуцированных первичных CD34⁺-клетках пуповинной крови. Такая экспрессия в результате кратковременной трансдукции оставалась детектируемой на уровне примерно 5% даже через семь дней после трансдукции. В клетках, трансдуцированных вектором, не содержащим маркера, экспрессия, осуществляемая в результате кратковременной трансдукции, обнаруживалась только примерно через 10 дней после трансдукции.

Поэтому в случае, когда интегрированная форма вирусного вектора была встроена в хромосомную ДНК трансдуцированной клетки, Chinnasamy и др. не могли достичь стабильной трансдукции первичных лимфоцитов более чем на 71,2%, на что указывала эффективность трансдукции через две недели. Данный эффект наблюдался несмотря на применение цитокинов для престимуляции клеток. Кроме того, Chinnasamy и др. указывали, что они не смогли добиться значимой трансдукции (только 3,6% через 14 дней после трансдукции) нестимулированных лимфоцитов с использованием ВИЧ-вектора, который не экспрессировал вспомогательные белки (Vif, Vpr, Vpu и Nef) даже после более поздней стимуляции клеток митогеном РНА и цитокином IL-2 после трансдукции. Хотя эти результаты были несколько улучшены с использованием нестимулированных клеток и векторов, содержащих вспомогательные белки, однако ни в одном случае эффективность стабильной трансдукции стимулированных или нестимулированных клеток не превышала 75% на 14-й день после трансдукции указанным вектором, независимо от используемой схемы стимуляции.

Низкая частота стабильной трансдукции лентивирусными векторами также наблюдалась Haas и др., и максимальная эффективность стабильной трансдукции, которую им удалось достичь через семь дней после трансдукции с использованием первичных CD34-положительных клеток пуповинной крови, составляла лишь менее чем 25%. Поразительно то, что этот 25%-ный верхний предел трансдукции не мог быть улучшен даже после использования исключительно высокой множественности инфекции или концентрации вектора, например, множественности инфекции (MOI) вплоть до 9000 и концентраций вектора вплоть до 10⁸ инфекционных единиц на миллилитр.

Follenzi и др. также использовали очень высокую MOI=500 для трансдукции клеток в присутствии смеси из трех цитокинов, содержащей интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-6 (IL-6) и фактор стволовых клеток (SCF). Интересно отметить, что использование указанной смеси не позволяет использовать эти клетки для клинической трансплантации человеку.

Таким образом, необходимо разработать более эффективные способы стабильной клеточной трансдукции высокой частоты с использованием векторов. Кроме того, необходимо разработать более эффективные способы трансдукции нестимулированных клеток в целях их использования в качестве инструментов для исследования и в качестве терапевтического агента.

Цитирование вышеуказанных документов не означает, что любой из вышеуказанных документов относится к предмету заявки. Все утверждения, относящиеся как к дате представления, так и к содержанию этих документов, основаны на информации, доступной для заявителя, и за точность этих дат или содержания указанных документов заявитель ответственности не несет.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к высокоэффективным способам и к применяемым в них композициям для стабильной трансдукции клеток вирусными векторами и вирусными частицами. Термин "стабильная трансдукция" означает, что интегрированная форма данного вирусного вектора была встроена в хромосомную ДНК трансдуцированной клетки. Указанные способы предусматривают контактирование трансдуцируемых клеток по меньшей мере с одной молекулой, которая связывается с клеточной поверхностью. Эта стадия контактирования может быть осуществлена до или после введения, либо одновременно с введением вирусного вектора или вирусной частицы в эти клетки. Используемый далее термин "вирусный вектор" означает любую форму нуклеиновой кислоты, происходящей из вируса и используемой для переноса генетического материала в клетку посредством трансдукции. Этот термин охватывает нуклеиновые кислоты вирусного вектора, такие как ДНК и РНК, инкапсулированные формы этих нуклеиновых кислот, и вирусные частицы, в которых были упакованы указанные нуклеиновые кислоты вирусного вектора.

Настоящее изобретение также относится к использованию трансдуцированных клеток в других целях, включая продуцирование желаемых генных продуктов и белков путем экспрессии нуклеиновой кислоты, присутствующей в данном векторе, или терапию живых индивидуумов, страдающих заболеванием, или индивидуумов с риском возникновения указанного заболевания. Таким индивидуумом предпочтительно является человек.

По меньшей мере одной молекулой, которая связывается с поверхностью трансдуцируемых клеток, является любая молекула, которая физически взаимодействует с рецептором, маркером или другим распознаваемым элементом на поверхности клеток. В принципе для высокоэффективной трансдукции клеток может быть использована любая молекула, связывающаяся с клеточной поверхностью. Не претендуя на какую-либо теорию, можно сказать, что молекулы, связывающиеся с клеточной поверхностью, могут обеспечивать более высокую восприимчивость хроматина клетки-хозяина к интеграции ДНК; преимущественную интеграцию вирусного вектора в сайт, благоприятный для экспрессии векторного гена; более эффективное внедрение капсида, содержащего нуклеиновую кислоту, в цитоплазму; более эффективное внедрение вируса через клеточную мембрану или внутренние мембранные структуры, такие как эндосома; или получение клеток, которые являются более толерантными для нуклеарного импорта генетического материала вирусного вектора. Способы согласно изобретению могут также предусматривать более, чем одну из вышеуказанных возможностей. Кроме того, как очевидно из количества и разнообразия указанных возможностей, настоящее изобретение не может быть ограничено какой-либо одной теорией. Напротив, принимая во внимание уникальность открытия согласно изобретению, позволяющего достигать 100%-ной стабильной трансдукции обработанных клеток без какого-либо негативного влияния на возможное использование этих клеток в терапии человека, настоящее изобретение должно рассматриваться как открытие нового подхода в области клеточной терапии человека.

Однако не все молекулы, связывающиеся с клеточной поверхностью, будут обеспечивать эффективную и стабильную трансдукцию вирусными векторами. Так, например, связывание с клеточной поверхностью молекулы, которая индуцирует апоптоз, не будет приводить к эффективной трансдукции данной клетки, а, скорее, оно будет приводить к ее гибели. Хотя гибель клеток может оказаться предпочтительной для лизиса клеток (например, опухолевых клеток), однако она не является предпочтительной для стабильной трансдукции клеток векторами, содержащими гены или последовательности нуклеиновой кислоты с полезной нагрузкой. Предпочтительная молекула, связывающаяся с клеточной поверхностью, сообщает клетке большую восприимчивость к трансдукции вирусным вектором. Примерами таких молекул являются антитело, специфичное к рецептору клеточной поверхности или к его части, а также лиганд или домен, связывающийся с таким рецептором. Кроме того, в целях настоящего изобретения могут быть использованы антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как Fab- и Fv-фрагменты. Связывающий домен для специфического рецептора клеточной поверхности может содержать один эпитоп либо два или более эпитопов.

Предпочтительными примерами молекул, связывающихся с клеточной поверхностью, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются анти-CD3- и анти-CD28-антитела, связывающиеся с Т-клетками и сообщающие им большую восприимчивость к трансдукции вектором. Другими предпочтительными примерами молекул, связывающихся с клеточной поверхностью, являются антитела или лиганды, которые связываются с рецепторами лиганда FLT-3, ТРО и лиганда Kit и которые сообщают клеткам, экспрессирующим эти рецепторы, таким как гемопоэтические стволовые клетки, большую восприимчивость к трансдукции вектором. Другими предпочтительными молекулами, связывающимися с клеточной поверхностью, являются антитела или лиганды для рецепторов GM-CSF и IL-4, которые сообщают дендритным клеткам или их предшественникам, таким как моноциты, CD34-позитивным стволовым клеткам или их дифференцированным клеткам-предшественникам линии дифференцировки дендритных клеток большую восприимчивость к трансдукции вектором. Другими молекулами, связывающимися с клеточной поверхностью, являются молекулы, находящиеся на клеточных поверхностях, которые связываются с поверхностью других клеток.

Дополнительными примерами молекул, связывающихся с клеточной поверхностью, являются полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды и ионы; причем все они, но не обязательно, образуют комплексы с другими веществами. Предпочтительно указанные молекулы связываются с факторами, присутствующими на поверхности клеток крови, такими как CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD2, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8α, CD8β, CD9, CD10, GD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45R, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79α, CD79β, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CDw109, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CDw124, CD125, CD126, CDw127, CDw128a, CDw128b, CDw130, CDw131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166 и TCRξ. Строчные буквы (например, "а" или "b") указывают на комплексные молекулы CD, состоящие из множества генных продуктов или принадлежащие к семействам структурно родственных белков. Обозначение "w" относится к предполагаемым молекулам CD, которые еще не были полностью подтверждены. Более полный перечень молекул CD можно найти у Kishimoto T. (ed). Современные данные о молекулах CD имеются также в работе Shaw S. (ed). Protein Reviews on the Web: An International WWW Resource/Journal at http://www.bsi.vt.edu/immunology.

Более предпочтительными являются молекулы, которые связываются с факторами, присутствующими на поверхности лимфоцитов, Т-клеток и лейкоцитов, такими как CD2, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD6, CD7, CD8α, CD8β, CD9, СD11a, CD18, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD37, CD38, CD39, CD43, CD44, CD45R, CD46, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD53, CD54, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD62L, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD73, CDw75, CDw76, CD84, CD85, CD86, CD87, CD89, CD90, CD94, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD103, CD107a, CD107b, CDw108, CDw109, CD118, CD119, CD120b, CD121a, CD122, CDw124, CDw127, CDw128a, CDw130, CD132, CD134, CDw137, CD140a, CD140b, CD143, CD146, CD148, CD152, CD153, CD154, CD155, CD161, CD162, CD165, CD166 и TCRξ.

Другие антитела и молекулы, связывающиеся с поверхностью клеток и подходящие для использования в настоящем изобретении, описаны в руководстве Linscott's Directory of Immunological and Biological Reagents, 11th Edition, January 2000, Publisher: W.D. Linscott, Petaluma, CA, которое во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения указанная молекула, связывающаяся с клеточной поверхностью, не является цитокином.

Хотя настоящее изобретение может быть осуществлено с использованием растворимых молекул, связывающихся с клеточной поверхностью и стимулирующих трансдукцию клеток вектором, имеются и другие предпочтительные варианты осуществления изобретения, которые относятся к использованию иммобилизованных молекул, связывающихся с клеточной поверхностью. Предпочтительными иммобилизованными молекулами являются антитела. Альтернативно, иммобилизация может быть осуществлена с использованием других клеток, экспрессирующих молекулы, связывающиеся с клеточной поверхностью. Предпочтительный способ эффективной трансдукции гемопоэтических стволовых клеток предусматривает использование стромальных клеток костного мозга, экспрессирующих лиганды на своей поверхности, которые облегчают поддержание стволовых клеток в процессе трансдукции без их дифференцировки. Стимулирующие клетки не ограничиваются нативными клетками, и любая клетка может быть сконструирована так, чтобы она экспрессировала соответствующую молекулу, связывающуюся с клеточной поверхностью, в целях обеспечения желаемой стимуляции для трансдукции.

Могут быть также включены дополнительные молекулы, повышающие или усиливающие способность по меньшей мере одной молекулы связываться с клеточной поверхностью. Так, например, растворимая форма ("первого") антитела, специфичного к рецептору клеточной поверхности, может быть использована в комбинации со "вторым" антителом, которое может перекрестно реагировать с "первыми" антителами, уже связанными с клеточной поверхностью.

Разумеется, что для осуществления настоящего изобретения может быть использована любая клетка. Клеткой, предпочтительной для трансдукции, является эукариотическая клетка. Более предпочтительной клеткой является первичная клетка. Однако способами согласно изобретению могут быть также трансдуцированы клеточные линии, и во многих случаях эти клеточные линии более легко трансдуцируются. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанной трансдуцированной клеткой является первичный лимфоцит (такой как Т-лимфоцит) или макрофаг (такой как моноцит), либо предшественник любой из этих клеток, такой как гемопоэтическая стволовая клетка. Другими предпочтительными для трансдукции клетками в основном являются клетки системы кроветворения или, в частности, клетки, образованные в результате гемопоэза, равно как и стволовые клетки, из которых они образуются, и клетки, связанные с функцией клеток крови. Такие клетки включают в себя гранулоциты и лимфоциты, образованные в результате кроветворения, а также плюрипотентные предшественники, лимфоидные и миелоидные стволовые клетки. Клетками, ассоциированными с функцией клеток крови, являются клетки, обеспечивающие функционирование клеток иммунной системы, таких как антигенпредставляющие клетки, например дендритные клетки, эндотелиальные клетки, моноциты и клетки Лангерганса. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанными клетками являются Т-лимфоциты (или Т-клетки), такие как клетки, экспрессирующие CD4- и CD8-маркеры.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения такой клеткой является первичный CD4⁺-Т-лимфоцит или первичная гемопоэтическая стволовая CD34⁺-клетка. Однако с учетом факта, что вирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут быть псевдотипированы оболочечным G-белком вируса везикулярного стоматита (как обсуждается ниже), любая клетка может быть трансдуцирована способом согласно изобретению. Такими клетками являются, но не ограничиваются ими, астроцит, фибробласт кожи, эпителиальная клетка, нейрон, дендритная клетка, лимфоцит, клетка, ассоциированная с иммунным ответом, эндотелиальная сосудистая клетка, опухолевая клетка, эндотелиальная клетка опухолевых сосудов, клетка печени, клетка легкого, клетка костного мозга, антигенпредставляющая клетка, стромальная клетка, адипоцит, мышечная клетка, панкреатическая клетка, почечная клетка, яйцеклетка или сперматоцит (например, для получения трансгенных животных), клетка, образующая зародышевую линию, эмбриональная плюрипотентная стволовая клетка или ее предшественники, клетки крови, включая безъядерные клетки, такие как тромбоциты и эритроциты, и т.п. Предпочтительными являются эукариотическая клетка, многоклеточные микроорганизмы (в противоположность одноклеточным дрожжам, например) и даже более предпочтительно, клетки млекопитающих, например клетки человека.

Трансдуцируемая клетка может присутствовать как отдельная клетка или как часть более крупной коллекции клеток. Такая "более крупная коллекция клеток" может включать в себя, например, клеточную культуру (смешанную или чистую), ткань (например, эпителиальную, стромальную или другую ткань), орган (например, сердце, легкие, печень, желчный пузырь, мочевой пузырь, глаз и другие органы), систему органов (например, систему кровообращения, дыхательную систему, систему пищеварения, мочевыделительную систему, нервную систему, систему покровов тела или другую систему органов), бластоцист, зародышевую стволовую клетку плода (например, для лечения наследственного расстройства/заболевания или для создания трансгенных животных), пораженные ткани, такие как опухоль или очаг инфекции, или организм (например, птица, млекопитающее, морской организм, рыба, растение или т.п.). Предпочтительно, органами/тканями/клетками-мишенями являются система кровообращения (включая, например, но не ограничиваясь ими, сердце, кровеносные сосуды и кровь), дыхательная система (например, нос, глотка, гортань, трахея, бронхи, бронхиолы, легкие и т.п.), система пищеварения (включая, например, ротовую полость и ткани желудочно-кишечного тракта, глотку, пищевод, желудок, тонкий кишечник, слюнные железы, поджелудочную железу, печень, желчный пузырь и т.п.), система продуцирования молока (такая как эпителиальные клетки молочных желез и поддерживающие клетки (стромальные) в ткани), мочевыделительная система (такая как почки, мочеточники, мочевой пузырь, уретра и т.п.), нервная система (включая, но не ограничиваясь ими, головной и спинной мозг, и конкретные органы чувств, такие как глаза) и система покровов тела (например, кожа).

Еще более предпочтительно, если клетки, предназначенные для трансдукции, выбирают из группы, состоящей из клеток сердца, кровеносных сосудов, включая опухолевые кровеносные сосуды и кровеносные сосуды, ассоциированные с инфицированной или пораженной тканью, костного мозга, крови, головного мозга, лимфатической ткани, лимфатических узлов, селезенки, легких, печени, желчного пузыря, мочевого пузыря и глаз. В одном конкретном варианте осуществления изобретения могут быть использованы клетки, которые являются аутологичными по отношению к используемому хозяину, но аллогенными, частично не соответствующими, полностью не соответствующими или даже ксеногенными по отношению к данному хозяину. Кроме того, могут быть трансдуцированы универсальные донорные клетки, подходящие для использования в данном организме-хозяине, в родственной группе организмов или видов, таких как человек. Этот последний вариант осуществления изобретения является особенно важным при трансплантации клеток, тканей или органов, где источник трансдуцированных клеток может иметь критическое значение для полученного трансплантата.

Другой предпочтительной клеткой для трансдукции, осуществляемой способом согласно изобретению, является опухолевая клетка, патологическая клетка или клетка с риском стать аномальной с течением времени вследствие организации ее генетического материала или генетического материала другой клетки, присутствующей в том же самом организме. Этот последний вариант позволяет использовать трансдуцированные клетки согласно изобретению в профилактических целях. Рак молочной железы является одним из примеров патологического процесса, при котором прогностический показатель позволяет проводить лечение трансдуцированными клетками согласно изобретению в качестве ранней генетической манипуляции перед появлением негативных последствий. Однако методы согласно изобретению могут быть также использованы для терапевтического лечения рака молочной железы после обнаружения данного заболевания. Имеются и другие многочисленные применения согласно изобретению, и сам специалист, без излишнего экспериментирования, может использовать описанное здесь изобретение для лечения рака многих типов.

В качестве одного неограничивающего примера осуществления настоящего изобретения может служить лечение эстрогензависимого рака молочной железы. Раковые клетки эстрогензависимого рака молочной железы могут быть преимущественно трансдуцированы с использованием антител или лигандов, связывающихся с рецептором эстрогена, в комбинации с терапевтическим вирусным вектором. Этот вектор может содержать, например, ген ингибирования опухоли, такой как ген тимидинкиназы вируса герпеса. Таким образом, трансдуцированные клетки могут быть подвергнуты селективному лизису путем добавления ганцикловира, то есть пролекарства, которое может быть активировано тимидинкиназой вируса герпеса. Имеются и другие многочисленные примеры генов ингибирования опухоли и соответствующих пролекарств, которые хорошо известны специалистам и могут быть выбраны самим специалистом без излишнего экспериментирования. Использование активируемых пролекарств в комбинации с использованием способов трансдукции согласно изобретению может широко применяться в отношении других типов опухолей, и настоящее изобретение не ограничивается опухолями, рост или пролиферация которых зависят от гормонов или от определенного растворимого фактора.

Так, например, Her-2/neu-позитивные опухолевые клетки не являются эстрогензависимыми, и являются плохим прогностическим показателем, поскольку эстрогеннезависимые опухоли, содержащие такие клетки, являются в высокой степени резистентными к лечению лекарственными средствами, такими как таксол, антагонист эстрогена. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предусматривается использование антител или других молекул, которые обеспечивают связывание Her-2/neu или герегулина с векторными препаратами в процессе трансдукции контаминирующих опухолевых клеток, например, в соответствии с протоколом трансплантации костного мозга. Альтернативно, такая трансдукция может быть осуществлена непосредственно в области локализации опухоли или внутрисосудисто in vivo с использованием векторов, которые должны обеспечивать модуляцию онкогенеза.

Еще в одном варианте настоящее изобретение нацелено как отдельно на сосудистую сеть опухоли, так и на сосудистую сеть в комбинации с опухолевыми клетками. В работе St Croix и др., вводимой в настоящее описание посредством ссылки, с помощью SAGE-анализа были идентифицированы гены, которые подвергаются сверхэкспрессии преимущественно в опухолевых эндотелиальных клетках по сравнению с нормальным эндотелием. Многие из этих генов кодируют молекулы клеточной поверхности, такие как антиген Thy-1 клеточной поверхности или лектин Endo180. Все эти позитивно регулируемые факторы клеточной поверхности могут связываться с молекулами согласно изобретению, связывающимися с клеточной поверхностью, и, тем самым, обеспечивать эффективную стабильную трансдукцию гена. Таким образом, способ опухолевой терапии должен быть направлен на разрушение сосудистой сети опухоли путем лизиса опухолевых эндотелиальных клеток после их трансдукции терапевтическим вирусным вектором в присутствии связывающихся с клеточной поверхностью молекул, которые селективно связываются с сосудистой сетью опухоли, но не с нормальными эндотелиальными клетками.

Еще в одном варианте своего осуществления настоящее изобретение предусматривает экспрессию противопухолевого гена в сосудистой сети опухоли путем введения в вирусный вектор элементов (например, промоторов или цис-действующих элементов стабилизации/деградации на мРНК), которые селективно стимулируют экспрессию противоопухолевого гена в опухоли, но не в нормальном эндотелии сосудов. Такие способы могут быть осуществлены ex vivo, in vitro или in vivo. Способ in vivo является предпочтительным в случае, когда данная терапия направлена на эндотелий опухолевых сосудов. Альтернативно, если целью такой терапии является очистка костного мозга от контаминирующих опухолевых клеток, например, для трансплантации костного мозга, то предпочтительным способом является терапия ex vivo или in vitro.

Кроме того, способ in vitro не ограничивается патологическими состояниями и может быть использован для трансдукции нормальных клеток. Так, например, настоящее изобретение может быть использовано для трансдукции гемопоэтических стволовых клеток in vivo в костном мозге. Любая комбинация антител или других молекул, связывающихся с клеточной поверхностью, таких как лиганд FLT-3, ТРО и лиганд Kit, или их функциональные аналоги, или стромальные клетки, экспрессирующие связывающую молекулу клеточной поверхности, могут быть добавлены вместе с вектором после направленной инжекции в костный мозг для высокоэффективной трансдукции костного мозга. Термин "функциональный аналог" означает любую молекулу, которая сохраняет связывающую активность молекулы согласно изобретению, связывающуюся с клеточной поверхностью. Такими функциональными аналогами являются фрагменты лиганда FLT-3, ТРО и лиганда Kit; молекулы лиганда FLT-3, ТРО и лиганда Kit, содержащие одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций; и антитела, которые имитируют связывающую активность молекул, связывающихся с клеточной поверхностью.

Альтернативой вышеуказанному способу является использование стромальных клеток костного мозга в качестве клеток-продуцентов для вирусного вектора и, тем самым, получения вектора и молекул, связывающихся с клеточной поверхностью, посредством клеточной терапии, а не путем использования векторного препарата. Другим примером может служить трансдукция Т-клеток или дендритных клеток путем подкожной инъекции вектора при добавлении функциональных аналогов анти-CD3- или анти-CD28-антител или GM-CSF и IL-4, соответственно. Указанный вектор и стимуляторы проникают в лимфу подкожной ткани и в лимфатические узлы и обеспечивают эффективную трансдукцию клеток-мишеней.

Настоящее изобретение имеет то преимущество, что очистка трансдуцированных клеток не является обязательной и не имеет решающего значения. Трансдукция, главным образом, представляющих интерес клеток может быть осуществлена путем выбора той части клеточной поверхности, с которой связываются желаемые молекулы. Так, например, в смешанной популяции клеток крови трансдукция клеток, экспрессирующих CD3, например некоторых Т-клеток, может быть усилена путем использования CD3-специфических антител, которые взаимодействуют с этими клетками. Трансдукция этих клеток будет преимущественной по сравнению с клетками других типов в данной популяции, таких как гранулоциты и моноциты, которые не экспрессируют CD3.

Настоящее изобретение также относится к трансдукции очищенных или выделенных желаемых клеток, если это необходимо. Использование очищенных или выделенных клеток дает дополнительное преимущество, такое как более высокая эффективность трансдукции, которая обусловлена более высокими концентрациями вектора по отношению к трансдуцируемой клетке.

При трансдукции очищенных Т-клеток предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна молекула связывалась с молекулой клеточной поверхности, присутствующей на Т-клетках. Примерами таких молекул клеточной поверхности являются CD3, CD28, CD25, CD71 и CD69. Примерами молекул, которые связываются с этими молекулами клеточной поверхности, являются распознающие их антитела и моноклональные антитела, многие из которых являются коммерчески доступными или могут быть легко получены с использованием стандартной техники без излишнего экспериментирования. В предпочтительном варианте, относящемся к трансдукции CD4⁺- или CD8⁺-клеток, могут быть использованы моноклональные антитела, которые распознают CD3 и/или CD28. Коммерческими доступными примерами таких антител являются антитело ОКТ3 против CD3 и антитело CD28.2 против CD28. Эти молекулы антител могут быть использованы в растворимой форме, после чего могут быть, но необязательно, перекрестно связаны с другими молекулами, либо в иммобилизованной форме, например, они могут быть иммобилизованы на сферах или на других твердых поверхностях. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные антитела иммобилизуют на поверхности сосуда, такого как стенки лунки для культивирования тканей, планшет или пакет, используемого для трансдукции, опосредованной вирусным вектором. Не претендуя на конкретную теорию, можно сказать, что использование антител, иммобилизованных на поверхности, к которой прилипают или с которой контактируют клетки, может приводить к увеличению локальных концентраций взаимодействий с клеточной поверхностью.

При трансдукции гемопоэтических стволовых клеток антитела, специфичные к рецептору гемопоэтических стволовых клеток для лиганда FLT-3, ТРО (тромбопоэтин или фактор роста и развития мегакариоцитов) или лиганда Kit, могут быть использованы в качестве молекул, связывающихся с клеточной поверхностью. Альтернативно, могут быть использованы антитела, специфичные к клеточным маркерам, положительным в отношении стволовых клеток, включая, но не ограничиваясь ими, CD34 или АС133. Если в качестве молекулы, связывающейся с клеточной поверхностью, используется лигандсодержащее соединение или лигандсодержащая композиция, то целые нативные лигандсодержащие белки, лиганды или лиганды, связанные с гетерологичными белками, могут быть использованы либо в растворимой, либо в иммобилизованной форме. Иммобилизованные формы получают путем присоединения к микросферам прямым методом или опосредованно, с использованием, например, авидина/биотина.

Альтернативно, лиганд может быть экспрессирован в вирусной оболочке вирусного вектора, необязательно в форме химерных или гибридных белков, и/или комплексов (ковалентно или нековалентно связанных) с одним или несколькими другими белками. В таких вариантах осуществления изобретения молекула, связывающаяся с клеточной поверхностью, представлена в комбинации с вирусным вектором в виде одной композиции для трансдуцирования клеток. Другими примерами молекул, связывающихся с клеточной поверхностью, которые могут быть экспрессированы в вирусной оболочке, являются многочисленные поверхностные факторы, перечисленные выше.

Другими предпочтительными молекулами, связывающимися с клеточной поверхностью, такими как антитела или их фрагменты, являются молекулы, которые связываются с рецепторами Notch или Delta гемопоэтических стволовых клеток, либо сами белки Notch или Delta, либо лиганды Notch или Delta, которые связываются с гетерологичными белками. Notch и Delta кодируют белки клеточной поверхности, которые влияют на широкий ряд возможных решений судьбы клеток в развитии Drosophila. Гомологи Notch и Delta играют важную роль для нормального развития эмбриона. Важно вовлечение дельта-гомологов в регуляцию кроветворения. Delta-Serrate-lag2 (DSL), растворимая форма гомолога, усиливает размножение примитивных предшественников гемопоэтических клеток. При объединении с гемопоэтиче