Рекомбинантные вирусы гриппа а

Рекомбинантные вирусы гриппа а

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к области создания и применения вакцин и относится к векторам аттенуированных живых вакцин, более конкретно к таким векторам, которые созданы на основе или же получены из генетически модифицированных штаммов вируса гриппа А, а также к производству рекомбинантных вирусов гриппа и вакцин.

Предпосылки изобретения

Вирусы гриппа представляют собой сегментированные вирусы отрицательной нити РНК и принадлежат семейству Orthomyxoviridae. Вирус гриппа А состоит из 9 структурных белков и дополнительно кодирует один неструктурный белок NS1 с регуляторными функциями. Неструктурный белок NS1 в процессе репродуктивного цикла синтезируется в большом количестве и локализуется в цитозоле и ядре инфицированных клеток. Сегментированная природа вирусного генома дает возможность реализации механизма генетической пересортировки (обмен геномными сегментами) в процессе смешанного инфицирования клетки различными штаммами вирусов. Наличие некоторых признаков делает вирусы гриппа привлекательными кандидатами для создания векторов эффективных живых вакцин против различных заболеваний: (i) вирусы гриппа индуцируют мощный клеточный и гуморальный иммунный ответы, на системном уровне и на уровне слизистой, против вирусных белков, сопровождающих инфекцию; (ii) вирус гриппа, будучи РНК-вирусом, в своем репликативном цикле не содержит фазу ДНК. Следовательно, можно исключить хромосомную интеграцию вирусных генов у хозяина; (iii) множество различных подтипов вируса гриппа является доступным. Поскольку антитела против разновидности указанных подтипов не обладают перекрестной реактивностью, предсуществующий иммунитет к вирусному вектору у хозяина, что зачастую является проблемой в случае других живых векторов, можно обойти. Возможны также эффективные бустерные иммунизации различными подтипами вирусов гриппа, экспрессирующими одни и те же антигены; и (iv) аттенуированные вирусы гриппа в качестве живых вакцин гриппа, которые, как было показано, сохраняются и остаются иммуногенными у человека, являются доступными.

До сих пор основная проблема в использовании вируса гриппа в качестве вектора была связана с размером вирусного генома и его ограниченной способностью "терпеть" (не отвечать на) чужеродные последовательности. Среди десяти белков вируса гриппа только для поверхностных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) с помощью генной инженерии была достигнута стабильная экспрессия чужеродных эпитопов. Поскольку вирус гриппа "терпит" включение всего лишь приблизительно 10 аминокислот в свою молекулу гемагглютинина, возможности влиять на конформационные свойства включенных эпитопов, которые, вероятно, могли бы быть лучше представлены, если бы было возможно включение более длинных последовательностей, достаточно ограничены. Кроме того, поверхностные гликопротеины вируса гриппа, такие как НА или NA, не могут считаться оптимальными мишенями для представления чужеродных последовательностей, поскольку они ассоциированы с антигенными свойствами вирусов. Конструкция НА живого вируса, содержащая необходимый чужеродный антиген, неприменима для бустерных иммунизации (например, путем второго и дальнейших введений) из-за предсуществующего иммунитета против НА, вызываемого первой иммунизацией или естественной вирусной инфекцией. Бустерная иммунизация была бы возможна только при введении необходимой антигенной структуры в другую молекулу НА, принадлежащую вирусу гриппа другого подтипа. Очевидно, что этот способ является сложным, трудоемким и исключительно длительным, и следовательно, трудно представить себе, чтобы им можно было воспользоваться в процессе рутинного изготовления вакцин.

Предшествующие настоящему изобретению исследования в данной области показали, что ген NS вируса гриппа А может оказаться многообещающей альтернативой [гену] гемагглютинина как вирусному носителю для представления необходимого чужеродного антигена иммунной системе животного или человека. В настоящее время установили, что метод обратной генетики (Egorov et al., 1998, J Virol 72 (8), 6437-41) позволяет спасти вирусы гриппа, содержащие длинные делеции или вставки чужеродных последовательностей со стороны карбокси-конца неструктурного Белка 1 (Белок NS1). Белок NS1 в изобилии представлен в клетках, инфицированных вирусом гриппа и стимулирует ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) так же, как и антительные ответы, в ходе естественного протекания инфекции вируса гриппа.

Дополнительные подробности, связанные с геном NS вируса гриппа, можно почерпнуть в международной заявке WO 99/64571. Кроме того, в международной заявке WO 99/64571 показано, что трансфектанты аттенуированного вируса гриппа А, содержащие делеции "knockout" полного гена NS1, обладают фенотипом, который способен интенсивно индуцировать интерферон (IFN). Это заключение было основано на том наблюдении, что такие трансфектанты были способны расти на интерферон-дефицитных клетках Vero, но не могли расти на куриных яйцах или же клетках MDCK.

Белок NS1 вируса гриппа представляет собой РНК-связывающий белок, который участвует в целом ряде регуляторных функций в процессе [развития] инфекции вируса гриппа. Этот белок синтезируется в больших количествах и обнаруживается главным образом в ядре на ранних стадиях инфицирования, а позже, в вирусном цикле, в цитоплазме инфицированных клеток. Отличный от белка NS1 вируса гриппа другой регуляторный вирусный белок, так называемый белок Nef вируса ВИЧ-1, который является миристилированным белком, локализован в цитозоле и ассоциирован с клеточной мембраной.

Иммунный ответ, направленный против ранне экспрессируемых регуляторных белков ВИЧ-1, мог бы даже вызывать элиминацию инфицированных вирусом клеток хозяина в процессе репликативного цикла, до высвобождения новых инфекционных вирусных частиц. Поскольку белок Nef относится к числу первых высвобождаемых белков, а в дальнейшем является одним из основных белков ВИЧ-1, продуцируемых в процессе [развития] инфекции, можно полагать, что он играет решающую роль в эффективности получаемой вакцины против СПИДа.

"Отрицательный фактор" (Nef) ВИЧ-1 кодируется открытой рамкой считывания, которая локализована на 3'-конце вируса, частично перекрывая район U3 длинного 3'-концевого повтора. Вплоть до 80% раннего, подвергнутого многократному сплайсингу, класса вирусных транскриптов кодирует Nef. Продукт гена Nef представляет собой NH₂-концевой миристилированный белок в 27-30 кДа, который преимущественно локализован в цитоплазме и ассоциирован с мембраной и цитоскелетным матриксом. Он является высококонсервативным в ряду различных вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и обезьян (SIV).

Тесная эколюционная взаимосвязь между этими лентивирусами приматов предполагает, что белок Nef играет важную роль в вирусной инфекции и патогенезе, хотя и следует отметить, что конкретная роль в жизненном цикле вируса, а также в его функционировании на клеточном уровне в настоящее время все еще является предметом изучения.

Тем не менее многие подробности, связанные с белком Nef и его эффектами, уже известны. Например, имеются сообщения о том, что некоторые люди, инфицированные ВИЧ, из которого был удален Nef, оставались здоровыми, с нормальным содержанием CD4 в течение 10-14 лет после инфицирования, хотя и удаление Nef нельзя считать универсальным [условием] отсутствия прогрессии [заболевания] в течение длительного периода. Кроме того, Nef-дефицитный вирус иммунодефицита обезьян (SIV) не способен вызывать СПИД у инфицированных взрослых макак. Мутанты SIV с делецией гена Nef способны даже вырабатывать защитную реакцию против вирулентной стимуляции (контрольного заражения). Было показано, что Nef стимулирует синтез провирусной ДНК ВИЧ-1, и было также показано, что ее экспрессия индуцирует эффективную интернализацию и деградацию СD4-рецептора ВИЧ-1 клеточной поверхности. Такая регуляция по типу отрицательной обратной связи Nef-индуцированного CD4, которая придает клеткам резистентность к суперинфекции вирусом, потенциально должна увеличивать вирусную репликацию путем облегчения высвобождения потомства вирионов. Было показано далее, что внеклеточный белок Nef способен активировать ВИЧ-1 из латентного состояния до состояния, когда продуцируется инфекция как в инфицированных T-клеточных линиях, так и в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), полученных у асимптоматических носителей. Далее было показано, что цитотоксические лимфоциты (CTL) оказались неэффективными в лизисе первичных клеток, инфицированных ВИЧ-I, когда экспрессировался продукт гена Nef.

Защита ВИЧ-инфицированных клеток от эффективного узнавания и уничтожения цитотоксическими лимфоцитами (CTL) коррелирует с опосредованной Nef регуляцией по типу отрицательной обратной связи молекул МНС класса I. Nef также мешает индукции мРНК IL-2 в T-клеточных линиях. Более того, существует большое количество клеточных партнеров, которые, как было показано, ассоциированы с экспрессией Nef, включая киназы семейства Src, β-COP, серин-треониновую киназу, тиоэстеразу и р53.

Сообщалось также, что у большей части (приблизительно 2/3) ВИЧ-1-серопозитивных больных вырабатывались Nef-специфические цитотоксические лимфоциты.

В [последовательности] белка Nef были идентифицированы два центральных мультирестрицированных иммунодоминантных района (аминокислоты со 66 до 100 и со 115 до 146) и карбокси-концевой район (аминокислоты со 182 до 206). Эти три мультирестрицированных иммунодоминантных района (аминокислотные последовательности, содержащие более одного T-клеточного эпитопа) узнаются CD8 + CTL человека в ассоциации по меньшей мере с 14 различными молекулами МНС класса I, включая важные гаплотипы МНС HLA-AL, -A3, -A11, -В8, -В17, -В18 и -В37.

Два центральных мультирестрицированных домена белка Nef являются наиболее высококонсервативными районами в ряду различных изолятов ВИЧ-1 и являются иммунодоминантными для большинства из протестированных асимптоматичных ВИЧ-1-серопозитивных доноров. Вдобавок к иммуногенности белка Nef вируса ВИЧ-1, для которого была продемонстрирована его способность индуцировать мощные T-клеточные иммунные ответы, в литературе были опубликованы также данные о Nef-специфических B-клеточных иммунных ответах.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение связано с областью создания векторов аттенуированных живых вакцин, более конкретно - с такими векторами, которые созданы на основе или же получены из генетически модифицированных штаммов вируса гриппа А. Оно связано, кроме того, с конструкцией и модификацией полученных методами генной инженерии неструктурных генов вирусов гриппа А, в частности, сегмента гена NS1, причем модификации включают в себя делеции выборочных частей сегмента гена NS1 и/или вставок гетерологичных, предпочтительно антигенных, последовательностей в выборочные сайты гена NS1. Другим объектом настоящего изобретения является обеспечение химерных вирусов гриппа, которые содержат такие модифицированные сегменты гена NS1, но для которых не является помехой то, что они являются интерферон-чувствительными, в отличие от трансфектантов, описанных в международной заявке WO 99/64571. Настоящее изобретение связано, далее, с рекомбинантными белками, полученными из NS1-модифицированных вирусов путем экспрессии в системе соответствующего хозяина, а кроме того, с вакциной, содержащей NS1-модифицированные вирусы согласно изобретению.

Еще одним аспектом данного изобретения является обеспечение способа получения рекомбинантного вируса гриппа, а также аттенуированных вакцин гриппа на основе получения стабильных клеточных линий (штаммов) (например, Vero, MDCK и т.д.), экспрессирующих искусственные гены гриппа (антисмысловая РНК), содержащие природные или полученные генноинженерным способом искусственные последовательности [вируса] гриппа (делеции или вставки). Эти клеточные линии, продуцирующие такие гены в больших количествах, могут быть использованы для инфицирования вирусом гриппа, а затем подвергнуты процедурам отбора с целью получения искомого гена, встроенного в потомство вирусов.

Авторам настоящего изобретения удалось установить систему обратной генетики на клетках Vero, позволяющих манипулировать вирулентностью штамма PR8 вируса гриппа А путем изменения длины транслируемого белка NS1. В процессе исследований, которые привели в результате к данному изобретению, изучали способность вируса гриппа А проявлять толерантность и быть устойчивым к включению длинных вставок в ген NS. В результате была получена коллекция нескольких химерных конструкций гена NS1 с помощью гетерологичных последовательностей, включая последовательности, полученные из HIV-1, кодирующие ELDKWA белков gp41 или Nef, путем включения одной или более гетерологичных последовательностей или - необязательно - нескольких повторов любой такой последовательности в рамку считывания белка NS1.

Указанные выше гетерологичные последовательности были вставлены вниз по течению в положении нуклеотида 400 (соответствующее положению аминокислоты 124) и - необязательно - предварялись последовательностью 2А сайта ауторасщепления и/или лидерной последовательностью, полученной из молекулы гемагглютинина вируса гриппа. Остальные конструкции дополнительно содержали якорную последовательность, полученную из молекулы гемагглютинина вируса гриппа, в качестве вставки непосредственно после требуемой антигенной последовательности(ей), образуя таким образом конец гетерологичной вставки как целого. В каждом случае после вставок следовал стоп-кодон для предотвращения транскрипции и трансляции оставшейся части сегмента гена NS1 (включая эффекторный домен), при этом сайт расщепления для сплайсинга NS (необходимый для транскрипции и трансляции сегмента гена NS2=NEP) сохранялся полностью функциональным.

Уцелевшие (спасенные) вирусы вызывали экспрессию и аккумуляцию чужеродных антигенов в цитозоле и/или на поверхности инфицированных клеток. Авторам настоящего изобретения удалось также успешно сохранить вирусы-трансфектанты, собирая мультирестрицированный иммунодоминантный район, обогащенный T-клеточными эпитопами белка Nef вируса ВИЧ-1 (136 аминокислот).

Все трансфектанты проявляли нормальные характеристики роста в клетках Vero, в подвергнутых эмбриогенезу куриных яйцах и в клетках MDCK, однако были аттенуированы у мышей. Химерные вирусы гриппа NS1-Nef не реплицировались в дыхательных путях инфицированных мышей, однако индуцировали выраженный Nef-специфический ответ цитотоксических лимфоцитов после однократной интраназальной иммунизации. Кроме того, после трех иммунизации наблюдали Nef-специфический антительный ответ. Перенос рекомбинантного гена NS-nef путем пересортировки из вирусного вектора PR8 (грипп A/PR/8/34; Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205) в остальные штаммы гриппа давал в результате одинаковый уровень аттенуации и иммуногенности. Обнаружение этого явления позволило авторам настоящего изобретения предпринять успешные повторные иммунизации (бустер-иммунизации) с использованием ряда аттенуированных векторов различных подтипов антигенов.

Таким образом, авторам настоящего изобретения удалось показать, что такой подход, связанный с созданием набора химерных штаммов вируса гриппа, принадлежащих различным подтипам гриппа, но несущих идентичный рекомбинантный химерный ген NS1, дает возможность создания целого ряда штаммов для бустер-иммунизации. Далее, им удалось доказать, что, уцелев однажды, конструкция нового химерного гена NS1 может быть рутинно перенесена в другой штамм вируса гриппа путем генетической пересортировки.

Описание графического материала

На фиг.1 показана функциональная карта полученного генно-инженерным путем белка NS1 [вектора] PR8.

На фиг.2 показана структура рекомбинантных белков NS1 уцелевших вирусов-трансфектантов гриппа, экспрессирующих пептиды gp-41 и IL-1β.

На фиг.3 показана структура рекомбинантного белка NS1 уцелевшего трансфектанта PR82Anef (PR8/Nef), экспрессирующего аминокислоты 70-206 белка Nef штамма NL4-3 вируса ВИЧ-1.

На фиг.4 показана репликация химерных вирусов гриппа/Nef в нижних дыхательных путях мышей.

На фиг.5 показано число клеток, секретирующих интерферон-гамма, полученных у иммунизированных мышей, на 10⁶ клеток селезенки, определяемое после того, как иммунные клетки селезенки инкубировали в присутствии пептида Nef, пептида NP или в отсутствие пептида в качестве индикатора T-клеточных ответов.

На фиг.6 показано число клеток, секретирующих интерферон-гамма, полученных из лимфатических узлов, дренирующих дыхательные пути иммунизированных мышей, на 10⁶ клеток селезенки, определяемое после того, как иммунные клетки селезенки инкубировали в присутствии пептида Nef, пептида NP или в отсутствие пептида в качестве индикатора T-клеточных ответов.

На фиг.7 показаны IgG-иммунные ответы Nef-специфической сыворотки после второй и третьей иммунизации мышей рекомбинантными вирусами гриппа/Nef.

На фиг.8 представлены результаты анализа снижения бляшкообразования.

На фиг.9 представлены результаты анализа индукции интерферона.

На фиг.10а-10с показана иммунофлуоресценция клеток Vero, предварительно инфицированных рекомбинантным вирусом PR8/Nef (10a, 10b) и вирусом гриппа дикого типа PR8 (10с).

На фиг.11 показаны пептид Nef-специфический и пептид NP-специфический иммунные ответы в виде количества клеток, секретирующих интерферон-гамма, в селезенке мышей.

На фиг.12 показаны пептид Nef-специфический и пептид NP-специфический иммунные ответы в виде количества клеток, секретирующих интерферон-гамма, в лимфатических узлах, дренирующих дыхательные пути иммунизированных мышей.

На фиг.13 показаны пептид Nef-специфический и пептид NP-специфический иммунные ответы в виде количества клеток, секретирующих интерферон-гамма, в моноклональных популяциях клеток мочеполовой системы иммунизированных мышей.

На фиг.14 представлены результаты анализа ELISA, определяющего Nef-специфический IgG в сыворотках мышей через две недели после третьей иммунизации вектором PR8/NS-Nef или Aichi/NS-Nef.

Фиг.15 являет собой схематическое представление системы транскрипции вируса гриппа NS антисмысловой РНК для применения при получении рекомбинантных вирусов гриппа.

Подробное описание изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение связано с полученными генно-инженерным путем конструкциями гена NS вируса гриппа А, содержащими модификации последовательности, т.е. делении или вставки, между нуклеотидами в положениях 400 и 525 сегмента гена NS1 (нумерация основана на [последовательности] гена NS вируса гриппа A/PR/8/34). Неожиданно оказалось, что сохранение функциональности сегмента гена NS1 вплоть до положения нуклеотида 400 (соответствующего аминокислоте в положении 124 в белке NS1) при сопутствующей делеции остального отрезка или по меньшей мере основной его части или при вставке чужеродной нуклеотидной последовательности в этот район после положения нуклеотида 400 или смещения рамки считывания, чтобы вызвать ошибочную транскрипцию или трансляцию оставшегося отрезка NS1, приводило в результате к спасению конструкций гена NS, а следовательно, к тому, что их вирусные векторы становились интерферон-индуцирующими, но не интерферон-чувствительными.

Это неожиданное открытие было подтверждено экспериментами, когда генно-инженерные химерные вирусы гриппа согласно настоящему изобретению не только способствовали развитию сильной реакции на интерферон в клетках MDCK и в куриных яйцах, но и приобретали также способность расти на субстрате этих хозяев с эффективностью, сравнимой с таковой вируса PR8 дикого типа. И, наоборот, химерные вирусы гриппа, содержащие делеции первой трети гена NS1 или делеции полного гена NS1, отличались индукцией гамма-интерферона, а также интерферон-чувствительным фенотипом. Они не обладали способностью расти на куриных яйцах или клетках MDCK, и следовательно, их не удавалось культивировать на интерферон-дефицитных линиях клеток, таких как клетки Vero. Химерные вирусы гриппа последнего типа были описаны в международной заявке WO 99/64571. Подразумевается, что вирусы согласно данному изобретению, которые не столь аттенуированы, как вирусы, описанные в международной заявке WO 99/64571, являются более иммуногенными, а следовательно, и более подходящими для производства высокоэффективных живых вакцин против различных типов вирусных инфекций.

В другом аспекте данного изобретения использовали генно-инженерный ген NS в качестве геномного фрагмента вируса гриппа А в способе, где он переносится в любой желаемый штамм вируса гриппа А или живые вакцины гриппа путем генетической пересортировки. В данном контексте, предпочтительно, чтобы полученный генно-инженерным путем ген NS был создан в виде клона кДНК, который может быть перенесен в любой штамм вируса гриппа А или живую вакцину гриппа в виде геномного фрагмента с помощью методов обратной генетики. Например, этим способом может быть получен другой вектор, такой как Aichi/NS-Nef, принадлежащий подтипу H3N2, но содержащий тот же самый рекомбинантный NS-ген. В отличие от стратегии получения рекомбинантных вирусов гриппа, экспрессирующих чужеродные антигены в контексте молекул гемагглютинина или нейраминидазы, этот подход делает возможным быстрое получение перекрестно-нереактивных векторов для оптимальных бустер-иммунизаций.

В предпочтительном аспекте данного изобретения ген NS, полученный генно-инженерным путем, сконструирован таким образом, чтобы экспрессировались вирусные антигены, в частности, для экспрессии последовательностей Nef вируса ВИЧ-1 или гликопротеина gp-41 ELDKWA.

В другом аспекте данного изобретения ген NS, полученный генно-инженерным путем, сохраняется в виде геномного фрагмента вируса гриппа, экспрессия которого служит фактором, способствующим сверхэкспрессии и активации протеинкиназы р-68 (PKR) в инфицированных клетках или выявляющим ее.

В другом аспекте данного изобретения химерный ген NS является частью аттенуированного (адаптированного к холоду) вектора живой вакцины гриппа, где ген NS, полученный генно-инженерным путем, является основным или дополнительным аттенуирующим фактором. Это особенно ценно для производства безопасных и высокоэффективных вакцин на основе вируса гриппа, включая, но не ограничиваясь ими, анти-ВИЧ-1-вакцины, где конструкция перенесенного химерного гена NS включает в себя последовательности гена nef, 2A, и/или gp-41 или других вирусных антигенов, для индукции сильного антительного и/или B- и T-клеточного иммунного ответа.

Вакцина, включающая в себя аттенуированный (адаптированный к холоду) вектор живой вакцины гриппа, может быть получена в виде подходящей фармацевтической композиции и может быть использована для профилактических иммунизации, а также и для терапевтической вакцинации, включая индукцию высвобождения интерферона в комбинации со стимуляцией B- и T-клеточного ответов. В таких композициях векторы гриппа могут быть использованы в комбинации с любым другим вектором, экспрессирующим аналогичные антигены, с тем, чтобы обеспечить максимальный бустерный эффект. Таким образом, выработка аттенуированных векторов NS гриппа предоставляет возможность получения новых рекомбинантных вакцин приблизительно с оптимальным балансом безопасности и иммуногенности, направленной против широкого класса патогенов.

В особом аспекте данного изобретения полученный генно-инженерным путем ген NS вируса гриппа А содержит вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности, полученной из гена nef ВИЧ-1 (нуклеотиды 210-618 гена nef клона NL4-3 ВИЧ-1), плюс вставку ауторасщепляемой последовательности 2А (54 нуклеотида), расположенную ближе к N-концу полученной из ВИЧ-1 вставки в положении 400 белка NS. Элиминация первых 68 аминокислот белка Nef была произведена с целью исключения доменов, содержащих миристоилированный сайт, и других доменов, ассоциированных с патогенными свойствами мультифункционального белка Nef ВИЧ-1.

В последующих экспериментах авторы данного изобретения обнаружили, что вирус гриппа PR8/Nef и вирус гриппа Aichi/Nef вызывают образование высокого титра антител против вирусного вектора и в меньшей степени, но все еще значительного титра антител против гена nef. Вирус PR8/Nef представляет собой вирус PR8-124 с усеченным NS1, содержащим ауторасщепляемую последовательность 2А после положения 124 в белке NS1, который дополнительно содержит последовательность nef (аминокислоты 70-206 белка Nef ВИЧ-1) после ауторасщепляемого сайта. Вирус Aichi пересортирован таким образом, что, за исключением гена NS, все гены, включая гены, кодирующие белки оболочки гемагглютинин и нейраминидазу, происходят из штамма H3N2 вируса Aichi дикого типа, в то время как рекомбинантный ген NS происходит из вируса PR8/Nef. Было обнаружено также, что вирусы PR8/Nef и Aichi/Nef вызывают сильные T-клеточные ответы против гена nef, так же как и против вирусного вектора. Этот эксперимент доказал, что можно перенести химерный ген NS в другой штамм вируса гриппа и обеспечить тем самым получение по существу такого же иммунного ответа. Это открытие является очень важным, поскольку создает возможность обеспечить бустер-иммунизации и создавать сезонные вакцины гриппа с варьирующими иммуногенными подтипами, но константной активностью на основе химерного гена NS1.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения рекомбинантных вирусов гриппа путем конструирования вектора, содержащего модифицированный ген NS, где последовательность гена NS1 частично или полностью удалена или усечена, смешивания указанного вектора с липидами, чтобы предоставить возможность для самоассоциации комплексов липид-ДНК и переноса комплексов липид-ДНК в нужную стабильную клеточную линию, например линию клеток Vero или MDCK, и селекции клонов, в которых модифицированный ген NS стабильно интегрирован и реплицируется и которые затем инфицируют любым необходимым штаммом гриппа, и в частности, штаммом гриппа дикого типа, вызывающим эпидемию, для получения аттенуированного потомства вирусов, содержащих указанный модифицированный ген NS. В этом способе модифицированный ген NS может, кроме того, включать в себя вставки гетерологичных генных последовательностей, кодирующих, например, другие вирусные антигены или патогены, например, такие, которые описаны в настоящей заявке.

Другим объектом данного изобретения является способ быстрого производства вакцины, включающий в себя стадии трансформации стабильной клеточной линии с тем, чтобы она продуцировала необходимый искусственный вирусный ген, в частности, модифицированный ген NS вируса гриппа А, где последовательность гена NS1 частично или полностью удалена или усечена, инфицирования трансформированной клеточной линии необходимым вирусом, и в частности, штаммом гриппа дикого типа, вызывающим эпидемию, для получения аттенуированного потомства вирусов, содержащих указанный модифицированный ген NS, селекции аттенуированных рекомбинантных вирусов и размножения указанных вирусов в условиях, подходящих для эффективной репликации вирусов, предпочтительно с использованием интерферон-дефицитных субстратов, и комбинирования полученного вирусного материала с фармацевтически приемлемым носителем, в результате чего получают антивирусную вакцину. В таком способе модифицированный ген NS может, кроме того, включать в себя вставки гетерологичных генных последовательностей, кодирующих, например, другие вирусные антигены или патогены, например, такие, которые описаны в настоящей заявке.

Дальнейшие аспекты данного изобретения определены в зависимых пунктах формулы изобретения. Для того, чтобы достичь более полного понимания описанного здесь изобретения, ниже приведены следующие примеры. Эти примеры представлены с целью иллюстрации изобретения, но не с целью какого бы то ни было его ограничения.

Пример 1: Получение рекомбинантной антисмысловой нити вирусов гриппа А ("метод обратной генетики")

Плазмидные клоны, содержащие последовательность nef, были получены на основе существующего плазмидного клона гена NS гриппа pUC19/NSPR (Egorov et al., 1998, J Virol 72/8,6437-41). Последовательность nef вставляли в белок NS1 ORF, вниз по течению (от) дополнительной последовательности: узнаваемую протеиназой последовательность Р2А (NFDLLKLAGDVESNPG/P), полученную из вызывающего ящур вируса, который посттрансляционно расщеплен широко распространенной клеточной протеиназой (Mattion et al., 1996, J Ivrol 70 (11), 8124-7; Percy et al., 1994, J Virol 68 (7), 4486-92), так, чтобы молекула gp-41 была отщеплена от полипептида NS1 и транспортирована к клеточной поверхности. Плазмидный клон использовали для синтеза химерной РНК, с тем, чтобы ее перенести в клетки Vero для дальнейшего сохранения (спасения) рекомбинантных вирусов гриппа. В функциональной карте белка NS1, полученного генно-инженерным способом, согласно изобретению (Фиг.1), указано, что вставки вводятся после аминокислоты в положении аа124 и завершаются стоп-кодоном, с помощью которого достигается то, что остальной прилегающий отрезок генного сегмента NS1 (включая эффекторный домен) остается нетраслированным. Из Фиг.2 становится понятным, каким образом могут быть расположены необходимые антигенные или иные гетерологичные последовательности (например, последовательности gp-41 и IL-1β), чтобы получились иммуногенные конструкции, которые после трансфекции в подходящий вирусный вектор, предпочтительно адаптированный к холоду вирус гриппа, могли бы служить основой эффективной вакцины против различных типов инфекционных заболеваний.

Аналогично, на фиг.3 показано расположение вставки из аминокислот аа70-206 белка Nef вируса ВИЧ-1 NL4-3 в белок NS1 уцелевшего (спасенного) трансфектанта гриппа PR82Anef (PR8/Nef).

Как правило, в экспериментах выявлялась тенденция, при которой длина гетерологичной вставки или вставок была прямо пропорциональна степени аттенуации полученного вирусного штамма. Кроме того, иммуногенный потенциал продуктов экспрессии более крупных вставок обычно превосходил таковой более мелких вставок. Следовательно, согласно данному изобретению, предпочтительно создавать вставки, кодирующие по меньшей мере приблизительно около 80 аминокислот.

Для создания химерного вируса Aichi/NS-Nef РНК, представляющую рекомбинантный сегмент NS вируса PR8/NS-Nef, вводили в геном вируса A/Aichi/1/68 (H3N2) путем стандартной генетической пересортировки, предпринятой на клетках Vero с использованием поликлональной кроличьей гипериммунной антисыворотки против вируса PR8 для селекции. Генотипирование пересортировок было предпринято путем амплификации ОТ-ПЦР (полимеразно-цепьевая реакция с обратной транскрипцией) и анализа сравнительной рестрикции копий кДНК, полученных из каждого геномного сегмента.

Пример 2: Трансфекция рекомбинантных вирусов в клетках Vero

Искусственная отрицательно-смысловая РНК была получена из плазмидных клонов путем транскрипции Т3 в присутствии очищенного вирусного рибонуклеопротеина (РНП). Клетки Vero были предварительно инфицированы хелперным пересортированным штаммом вируса гриппа 25А-1 (H1N1, (Egorov et al., 1994, Vopr Virusol 39 (5), 201-5), а затем трансфицированы комплексами РНК путем DEAE-декстрановой трансфекции (Egorov et al., 1998, J. Virol 72 (8), 6437-41; Luytjes et al., 1989, Cell 59 (6), 1107-13). Уцелевшие (спасенные) вирусы-трансфектанты были подвержены бляшкообразованию, были трижды очищены на клетках Vero, амплифицированы на клетках Vero и затем были протестированы их биологические свойства.

На Фиг.10а-с показана иммунофлуоресценция клеток Vero, предварительно инфицированных рекомбинантным вирусом PR8/Nef (MOI 0,01 на 10а и 0,1 на 10b) и вирусом гриппа дикого типа PR8 (10с). Через 24 часа после инфицирования клетки были трипсинизированы и фиксированы на покровных стеклах 100% ацетоном. После нескольких этапов промывки в PBS покровные стекла инкубировали в течение 40 минут при 37°С в присутствии разбавленного 1:50 мышиного моноклонального антитела против Nef (эпитоп аа179-195), затем дважды промывали в PBS и инкубировали в присутствии разбавленного 1:100 козьего антитела против IgG мыши, конъюгированного с ФИТЦ.

Пример 3: Иммунизация мышей BALB/c

Мышей BALB/c в группе, каждая из которых состояла из трех особей, иммунизировали вирусами гриппа PR8/Nef, Aichi/Nef; PR8-124 в количестве 2-5×10⁵ PFU (бляшкообразующие единицы)/мышь и штаммом PR8wt в количестве 4×10⁴ PFU/мышь, как показано на фиг.5. Клетки селезенки были получены у мышей через 9 дней после иммунизации и использованы в качестве эффекторных клеток в анализе ELISPOT. На фиг.5 показано число клеток, секретирующих интерферон-гамма, на 10⁶ клеток селезенки, определяемое после того, как иммунные клетки селезенки инкубировали в присутствии пептида EWRFDSRLAFHHVAREL (пептид Nef), пептида TYQRTRALVRTMGD (пептид NP) или в отсутствие пептида (без пептида, б/п). Результаты выражены в виде среднего значения +/-SEM для параллельных культур.

Мышей BALB/c в группах, каждая из которых состояла из трех особей, иммунизировали вирусами гриппа PR8/Nef, Aichi/Nef; PR8-124 в количестве 2-5×10⁵ PFU/мышь, и штаммом PR8wt в количестве 2×10⁴ PFU/мышь, как показано на фигуре 6. Простые клеточные суспензии из лимфатических узлов, дренирующих дыхательные пути иммунизированных мышей, были получены у мышей через 9 дней после иммунизации и использованы в качестве эффекторных клеток в анализе ELISPOT (Power et al, J Immunol Methods 227: 99-107): Вкратце, трехкратные серийные разведения клеточных популяций, полученных из мышиных селезенок, дренирующих лимфатических узлов и мочеполовых путей, переносили в лунки, покрытые моноклональными антителами против интерферона-гамма (анти-IFN-γ-mAb (R4-6A2; BD PharMingen)). Клетки инкубировали в течение 22 часов при 37°С и 5% СО₂ в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС), IL-2 (30 ед/мл), пенициллин, стрептомицин и 50 мкМ 2-ME, в присутствии синтетических пептидов. Биотинилированные анти-IFN-γ-mAb (XMG1.2; BD PharMingen) были использованы в качестве конъюгирующего антитела, затем планшеты инкубировали в присутствии стрептавидин-пероксидазы (0.25 ед/мл; Boehringer Mannheim Biochemica). Пятна колонии, представляющие собой секретирующие гамма-интерферон клетки CD8⁺, культивировали, используя субстрат 3-амино-9-этилкарбазол (Sigma), содержащий перекись водорода в 0.1 М натрий-ацетате, рН 5.0. Пятна просчитывали с помощью аналитического микроскопа, и результаты выражали в виде среднего числа секретирующих гамма-интерферон клеток +/- SEM, из трех повторов. Клетки, инкубируемые в отсутствие синтетических пептидов, давали <10 пятен/10⁶ клеток. В связи с тем, что истощение СD8⁺-клеток приводило обычно к более чем 92% уменьшению образования пятен, в большинстве анализов процедуру разделения клеток опускали. На фигуре 6 показано число клеток, секретирующих интерферон гамма, на 10⁶ клеток селезенки, регистрируемое после того, как клетки селезенки были проинкубированы в присутствии пептида EWRFDSRLAFHHVAREL (пептид Nef), пептида TYQRTRALVRTMGD peptide (пептид NP) или же в отсутствие пептида (без пептида, б/п).

Из фигуры 4, на которой показана репликация химерных вирусов гриппа/Nef в нижних дыхательных путях у мышей, становится ясно, что вирусы PR8/Nef и Aichi/Nef в этой ткани не реплицировались, а следовательно, были сильно аттенуированы, тогда как в то же самое время они были высокоиммуногенными для мышей, вызывая сильный T-клеточный и B-клеточный иммунные ответы (как показано на фигурах 5, 6 и 7). Для того, чтобы охарактеризовать специфический ответ CD8⁺-Т-клеток на вставку (Nef-пептида) и на вектор (NP-пептида), самок мышей BALB/c единожды или дважды иммунизировали интраназально без наркоза 10⁶ PFU на животное вирусами дикого типа PR8/NS-Nef, Aichi/NS-Nef; PR8/NS-124 или PR8.

По три мыши BALB/c в каждой группе иммунизировали единожды или дважды интраназально без наркоза 10⁶ PFU на животное вирусами дикого типа PR8/NS-Nef, Aichi/NS-Nef; PR8/NS-124 или PR8, как показано на фиг.11. Бустерную иммунизацию предпринимали на 21 день после примирования. Суспензии клеток-потомков одной клетки, полученные из селезенок мышей через 10 дней после иммунизации, оценивали методом ELISPOT на [наличие] Nef-пептид-специфических (А) или NP-пептид-специфических (В) IFN-γ-секретирующих СD8⁺-Т-клеток. На фиг.11 показано среднее количество антиген-специфических IFN-γ-секретирующих клеток +/- SEM по трем параллельным культурам.

Лимфатические узлы, дренирующие дыхательные пути (медиастинальные и ретробронхиальные лимфатические узлы) собирали через 10 дней после иммунизации у иммунизированных мышей BALB/c, как п