Способ определения белковосвязанного йода в слюне

Способ определения белковосвязанного йода в слюне

Реферат

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике.

Синтез тиреоидных гормонов протекает в щитовидной железе путем йодирования тирозиновых остатков тиреоглобулина.

Под влиянием тироксина в организме повышается активность около 100 различных ферментов, оказывающих влияние на множество физиологических функций, регулирующих скорость обмена белков, углеводов, липидов, воды, электролитов, рост и дифференцировку тканей, транспорт электронов в митохондриях и другие процессы. Поэтому и гипо-, и гиперфункция щитовидной железы вызывает глубокие расстройства физиологического статуса организма.

Определение концентрации тиреоидных гормонов применяется для диагностики нарушений функции щитовидной железы.

Для оценки функции щитовидной железы необходимо определение концентрации тироксина в крови. Количественное определение белковосвязанного йода является адекватным тестом, поскольку 99,95% тироксина содержится в крови в соединении с тироксинсвязывающим глобулином.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения белковосвязанного йода в плазме крови (Еремин Ю.Н., Проскурякова Г.Ф., Точарина М.Г. Определение йода, связанного с белком, в малых количествах сыворотки (или плазмы) крови // Лабораторное дело, 1980, №7, с.428-430).

Данный способ основан на том, что белки плазмы осаждают и затем сжигают при нагревании в муфельной печи. Это необходимо для того, чтобы весь йод перешел в ионы J^-. Далее для количественного определения ионов йода используют свойство этих ионов ускорять реакцию разложения роданида железа в присутствии нитратов и нитритов в кислой среде. Величина ускорения названной реакции пропорциональна концентрации йода. Количество роданида железа, имеющего оранжевую окраску, измеряют колориметрически. По определенной оптической плотности и калибровочной кривой определяют концентрацию йода, повышение концентрации которого свидетельствует об усилении функции щитовидной железы, а снижение его концентрации - о снижении функции щитовидной железы.

Недостатком известного способа является то, что в качестве биологического материала, который берется у людей при обследовании, используют кровь, забор который является травматичным для человека и требует специально подготовленного помещения, обученный медицинский персонал, стерильные инструменты. При массовых обследованиях на предприятиях многие люди отказываются от этой услуги. При этом известный способ определения белковосвязанного йода в крови человека является недостаточно чувствительным для определения этого показателя в слюне.

В основу изобретения положена задача упрощения и удешевления способа определения белковосвязанного йода, снижение травматичности исследования при заборе биологической жидкости, повышение эффективности диагностирования.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе определения белковосвязанного йода в слюне пациента перед забором пробы обследуемый промывает ротовую полость кипяченой водой, просушивая полость салфеткой, сбор слюны производят в химически чистые пробирки в количестве 0,5-1 мл, для анализа в центрифужные пробирки наливают 4 мл воды, добавляют 0,2 мл исследуемой слюны, 0,4 мл 10% раствора сульфата цинка, 0,2 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость, осадку приливают 5 мл воды, перемешивают, центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 0,1 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, 0,2 мл 20% раствора нитрата калия, помещают пробирки в термостат с температурой 70-75°С на 2-3 часа до полного высыхания, нагревают пробирку в пламени спиртовки до полного сгорания содержимого, о чем свидетельствует светлая окраска содержимого без черных пятен, наливают в пробирки по 10 мл воды, перемешивают и центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин, 2 мл надосадочной жидкости переносят в чистые пробирки, добавляют 0,3 мл 0,006 М роданида калия, 0,5 мл 2% нитрита натрия, 0,8 мл 10% раствора железоаммонийных квасцов в 2н. азотной кислоте и помещают в водяную баню с температурой 37°С на 30 минут, затем пробирки помещают в воду со льдом на 1-2 минуты, затем производят измерение оптической плотности проб на спектрофотометре при длине волны 440 нм и концентрацию белковосвязанного йода определяют по калибровочной кривой.

Способ определения белковосвязанного йода в слюне пациента осуществляют следующим образом.

В качестве биологической жидкости используют слюну человека, перед забором пробы которой обследуемый промывает ротовую полость кипяченой водой, просушивая полость салфеткой.

Сбор слюны производят в химически чистые пробирки в количестве 0,5-1 мл.

Для анализа в центрифужные пробирки наливают 4 мл воды, добавляют 0,2 мл исследуемой слюны, 0,4 мл 10% раствора сульфата цинка, 0,2 мл 1 н. раствора гидроксида натрия. Далее центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость.

К осадку приливают 5 мл воды, перемешивают, центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин, и удаляют надосадочную жидкость.

Затем к осадку добавляют 0,1 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, 0,2 мл 20% раствора нитрата калия, помещают пробирки в термостат с температурой 70-75°С на 2-3 часа до полного высыхания.

После этого нагревают пробирку в пламени спиртовки до полного сгорания содержимого, о чем свидетельствует светлая окраска содержимого без черных пятен. Далее наливают в пробирки по 10 мл воды, перемешивают и центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин.

Затем 2 мл надосадочной жидкости переносят в чистые пробирки, добавляют 0,3 мл 0,006 М роданида калия, 0,5 мл 2% нитрита натрия, 0,8 мл 10% раствора железоаммонийных квасцов в 2н. азотной кислоте и помещают в водяную баню с температурой 37°С на 30 минут. После этого пробирки помещают в воду со льдом на 1-2 минуты. Затем производят измерение оптической плотности проб на спектрофотометре при длине волны 440 нм.

По определенной оптической плотности и калибровочной кривой определяют концентрацию белковосвязанного йода.

Повышенная концентрация белковосвязанного йода свидетельствует об увеличении концентрации тиреоидных гормонов, а сниженная его концентрация - о снижении концентрации тиреоидных гормонов. При возрастании концентрации гормонов щитовидной железы в исследуемой слюне делают вывод об усилении функции щитовидной железы, а при уменьшении концентрации гормонов в слюне делают вывод о снижении функции щитовидной железы.

В результате проведенных заявителем экспериментальных исследований выявлены ранее неизвестные свойства слюны человека, а именно существует положительная корреляционная связь между концентрациями белковосвязанного йода в крови и в слюне, определяемыми по способности ионов йода, образующихся при минерализации белковосвязанного йода, ускорять реакцию разложения роданида железа в присутствии нитратов и нитритов в кислой среде. Коэффициент корреляции составлял 0,94 у практически здоровых лиц и 0,76 у больных тиреотоксикозом. Было установлено, что у практически здоровых людей концентрация белковосвязанного йода в слюне, определяемая заявленным способом, составляла от 1,1 до 2,2 мкг%, у больных тиреотоксикозом - от 2,3 до 6,2 мкг%.

В связи с этим установлена возможность и целесообразность использования слюны в качестве биологической жидкости для оценки функции щитовидной железы по определению в слюне концентрации белковосвязанного йода.

В связи с тем, что концентрация белковосвязанного йода в слюне ниже, чем в крови, заявителем были внесены изменения, направленные на повышение чувствительности метода определения белковосвязанного йода в слюне, для чего было изменено соотношение концентрации нитратов и нитритов в реакционной смеси и подобрано их оптимальное соотношение для определения белковосвязанного йода в слюне. Сжигание исследуемого материала заявители производили вместо муфельной печи в пробирке на спиртовке. Это приводит к удешевлению заявляемого способа для лабораторий, не имеющих муфельной печи.

Было установлено, что скорость реакции разложения роданида железа в присутствии нитратов, нитритов и ионов йода существенно зависит от температуры реакционной смеси, поэтому реакцию проводят в термостате при температуре 37°С. Известный метод не предусматривает остановки реакции, что может приводить к ошибкам при большом количестве проб. Помещение проб в воду со льдом в заявляемом способе позволяет уменьшить скорость реакции настолько, что дает возможность произвести измерение нескольких проб без существенного изменения их оптической плотности. Это позволяет повысить эффективность выполнения анализов, поскольку дает возможность производить исследование нескольких проб одновременно.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому техническому результату отличительных признаков в заявляемом способе оценки функции щитовидной железы, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "Новизна".

Для проверки соответствия заявляемого изобретения условию "Изобретательский уровень" заявитель провел дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого изобретения. Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителем. Следовательно, заявляемое изобретение "Способ определения белковосвязанного йода в слюне" соответствует критерию "Изобретательский уровень".

Критерий "Промышленная применимость" подтверждается тем, что предлагаемое изобретение может быть успешно использовано при массовом обследовании населения в диагностических целях для оценки состояния щитовидной железы и эффективно внедрено в систему здравоохранения России и СНГ.

Способ определения белковосвязанного йода в слюне пациента, отличающийся тем, что перед забором пробы которой обследуемый промывает ротовую полость кипяченой водой, просушивая полость салфеткой, сбор слюны производят в химически чистые пробирки в количестве 0,5-1 мл, для анализа в центрифужные пробирки наливают 4 мл воды, добавляют 0,2 мл исследуемой слюны, 0,4 мл 10%-ного раствора сульфата цинка, 0,2 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, и удаляют надосадочную жидкость, к осадку приливают 5 мл воды, перемешивают, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин, и удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 0,1 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, 0,2 мл 20%-ного раствора нитрата калия, помещают пробирки в термостат с температурой 70-75°С на 2-3 ч до полного высыхания, нагревают пробирку в пламени спиртовки до полного сгорания содержимого, о чем свидетельствует светлая окраска содержимого без черных пятен, наливают в пробирки по 10 мл воды, перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин, 2 мл надосадочной жидкости переносят в чистые пробирки, добавляют 0,3 мл 0,006 М роданида калия, 0,5 мл 2%-ного нитрита натрия, 0,8 мл 10%-ного раствора железоаммонийных квасцов в 2н. азотной кислоте и помещают в водяную баню с температурой 37°С на 30 мин, затем пробирки помещают в воду со льдом на 1-2 мин, затем производят измерение оптической плотности проб на спектрофотометре при длине волны 440 нм и концентрацию белковосвязанного йода определяют по калибровочной кривой.