Штамм гибридных культивируемых клеток rattus norvegicus 122н9 - продуцент перекрестно-реактивных нейтрализующих моноклональных антител против ортопоксвирусов, патогенных для человека

Штамм гибридных культивируемых клеток rattus norvegicus 122н9 - продуцент перекрестно-реактивных нейтрализующих моноклональных антител против ортопоксвирусов, патогенных для человека

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Rattus norvegicus - продуцента перекрестно-реактивных нейтрализующих моноклональных антител (МКА) против ортопоксвирусов. МКА могут найти применение в медицине, иммунологии и биотехнологии с целью разработки и усовершенствования средств вакцинопрофилактики и терапии заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами, патогенными для человека, - это вирусы натуральной оспы (ВНО), оспы обезьян (ВОО), осповакцины (ВОВ) и оспы коров (ВОК).

Известны зарубежные коллекции мышиных моноклональных антител (МКА) к ортопоксвирусам [1-5], продуцируемые штаммами гибридных клеток животного Mus musculus.

Однако аналоги штаммов гибридных клеток животного Rattus norvegicus - продуцентов моноклональных антител к ортопоксвирусам неизвестны.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9, секретирующих МКА, которые обладают перекрестной реактивностью с ВЭ, ВОВ, ВОК и ВНО и нейтрализующей активностью против ВОК и вируса натуральной оспы. Указанный технический результат достигается слиянием клеток крысиной миеломы 210RC.Y3-Ag1.2-3. с клетками селезенки крысы LOU, иммунизированной очищенным вирусом эктромелии (штамм К-1), который был получен в результате культивирования и очистки вируса.

Заявляемый штамм гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9 получен в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ "Вектор") Минздрава Российской Федерации и депонирован в НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" под №НИИМБ-281. Авторское название гибридомной клеточной линии - 122Н9.

Штамм Rattus norvegicus 122H9 характеризуется следующими признаками:

Родословная штамма. Штамм гибридных культивируемых клеток получен путем слияния клеток крысиной миеломы 210RC.Y3-Ag1.2.3. (Y-3) с клетками селезенки крыс LOU, иммунизированных очищенным препаратом вируса эктромелии. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля фирмы Sigma с молекулярным весом 2000. Штамм выращивали на селективной среде ГАТ, затем трижды клонировали методом предельных разведений, используя в качестве клеток-кормилок перитонеальные макрофаги крыс LOU. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%.

Число пассажей к моменту депонирования - -12 пассажей.

Маркерные признаки и методы их оценки. Штамм секретирует крысиные иммуноглобулины, специфически взаимодействующие с ВЭ. Анализ крысиных иммуноглобулинов проводят методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена 200 нг очищенного ВЭ. Взаимодействие МКА с ВЭ выявляют с помощью конъюгата антител против крысиных IgG, меченных пероксидазой хрена.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой Y-3. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - среда Игла MEM в модификации Дульбекко, содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES. Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют 80 мкг/мл сульфата гентамицина. Гибридома 122H9 растет в виде монослойно-суспензионной культуры. Посевная доза 100-200 тыс.клеток в миллилитре, кратность рассева - 1:5-1:6 через 3-4 дня.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самок крыс Lou (ГНЦ ВБ "Вектор") сенсибилизируют внутрибрюшинным введением 5 мл вазелинового масла или пристана. Через 2-4 недели животным вводят 10 млн гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется через 10-12 дней. От одного животного можно получить 20-50 мл асцитической жидкости. Гибридома прививается в 100% случаев.

Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом иммунодиффузии по Оухтерлони. МКА относятся к классу IgG. Они специфически взаимодействуют с белком 12,8 кДа (ген 214L) вируса эктромелии в реакции иммуноблоттинга. Титр МКА в асците составляет не менее 1:2200000 в ИФА с ВЭ. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 5-7 мг очищенных моноклональных антител. Штамм стабильно продуцирует МКА на протяжении одного месяца непрерывного перевивания в культуре.

Криоконсервирование. Среда для замораживания: среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. Клеточную суспензию в объеме 0,5-1 мл переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1-1,5 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота. Через сутки пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят в 5 мл среды ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч клеток в миллилитре. Жизнеспособность после размораживания составляет 60-80% (окраска 0,25% трипановым синим).

Методика получения заявляемого штамма

Штамм гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9 получают следующим образом.

Самок крыс LOU, массой 180-200 г (виварий ГНЦВБ «Вектор») иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице 1.

Для слияния используют 150 млн селезеночных клеток и 50 млн клеток Y3. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 2000. Смесь центрифугируют 15 мин при 600g. После 3-5 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют раствором версена, после чего осадок ресуспендируют и суспензию центрифугируют. Клетки распределяют в пять культуральных 96-луночных микроплат по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде НАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 15% фетальной сыворотки коров, 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01мМ аминоптерина.

Таблица 1Схема иммунизации
Дни	Раствор для разведения антигена	Доза антигена (мкг/крысу)	Область инъекции
0	Полный адьювант Фрейнда	7,5	Внутрибрюшинно
7	Неполный адьювант Фрейнда	7,5	Внутрибрюшинно
10	Физиологический раствор	75	Внутривенно
11	Физиологический раствор	75	Внутривенно
14	Гибридизация	(Забор селезенки)

Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА), используя в качестве антигена 200 нг очищенного вируса эктромелии. Места неспецифического связывания насыщают 0,5% раствором казеина (ICN). Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 45 мин (при 37°С). После инкубации лунки промывают 3-5 раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% твин-20 (Sigma). В планшеты вносят по 100 мкл антивидового конъюгата (иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов крысы, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 45 мин при 37°С. Затем планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию окрашивания. Результаты анализа определяют на спектрофотометре MULTISCAN при длине волны 492 нм.

Гибридный штамм 122Н9 дважды клонируют методом предельных разведений, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте.

Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9, секретирующего МКА против ортопоксвирусов, в организме крыс LOU.

Культивируемые клетки 122H9, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок суспензируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Предварительно крысам LOU (ГНЦВБ "Вектор"), весом 180-200 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 5 мл вазелинового масла или пристана. Суспензию культивируемых клеток штамма-продуцента 122H9, приготовленную, как описано выше, прививают животным внутрибрюшинно, 10 млн клеток в 1-3 мл среды без сыворотки или раствора Эрла. Через 10-14 дней после прививки гибридомных клеток образуется 15-30 мл асцитической жидкости, которая используется для получения препаратов моноклональных антител.

Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9, из асцитической жидкости.

Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводят 4 объемами 0,6М ацетатного буфера (0,04М лимонной кислоты, 0,2М натрия ацетата), рН 4,0 и доводят рН до 4,5 с помощью 0,1N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют 30 мин при +4°С. Затем центрифугируют 30 мин при 8000g и осадок удаляют, а надосадок смешивают с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают рН 7,4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем (V:V) насыщенного раствора сульфата аммония добавляют к этому раствору, встряхивают и выдерживают ночь при 4°С или 30 мин при 20-25°С. Центрифугируют 15 мин при 5000 g.

Надосадок сливают, а осадок ресуспендируют в ФСБ, рН 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, рН 7,4.

Пример 3. Определение методом ИФА перекрестного взаимодействия МКА, продуцируемых штаммом Rattus norvegicus 122H9, с ортопоксвирусами.

ИФА проводился на полистироловых планшетах; антиген (очищенный вирус) сорбировали в ФСБ, рН 7,4, в объеме 100 мкл/лунку. Места неспецифического связывания насыщали 45 минут при 37°С 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH 7.4). В планшеты вносили МКА (45 минут при 37°С) и связывание МКА с антигеном выявляли меченными пероксидазой антителами против иммуноглобулинов крысы. Далее добавляли хромоген, 0,1% О-фенилендиамин, в цитратно-фосфатном буфере (0.2 М лимонной кислоты, 0.5 М Na₂HPO₃, рН 5.0) с 0.03% перекиси водорода. Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1N HCl и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Multiscan" (Финляндия) с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали соответственно гомологичные неиммунную (нормальную) и гипериммунную сыворотки.

Пример 4. Выявление в иммуноблоте взаимодействия МКА, продуцируемых штаммом-продуцентом Rattus norvegicus 122H9, с белком 12,8 кДа (ген 214L) вируса эктромелии, штамм К-1.

Вирусные белки после 12% ПААГ-электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH 7.4) 2 часа при 37°С. Затем отдельные полоски мембраны инкубировали с моноклональными антителами 4 часа при 20-22°С. Специфическое связывание антител, взаимодействующих с вирусными белками, выявляли с помощью конъюгата антител против IgG крысы, меченных пероксидазой хрена. В качестве отрицательного контроля использовали Y3-асцитическую жидкость в разведении 1/5000, в качестве положительного контроля сыворотку к ВЭ в разведении 1/5000 от крыс, используемых для получения гибридом. Результаты представлены на чертеже, касающиеся выявления методом иммуноблота белков ВЭ (К-1), взаимодействующих с антителами иммунной сыворотки против ортопоксвирусов и МКА 122Н9. Где цифрами представлены следующие обозначения:

1 - антисыворотка крысы к ВЭ (К-1) (1/5000), нередуцирующие условия;

2 - антисыворотка крысы к ВЭ (К-1) (1/5000), редуцирующие условия;

3 - МКА 122Н9(1/5000), нередуцирующие условия;

4 - МКА 122Н9(1/5000), редуцирующие условия;

5 - асцитическая жидкость крысиной миеломы Y3(1/5000);

6 - нормальная сыворотка мыши (1/5000).

В скобках указаны разведения используемых препаратов. Справа указано местоположение маркерных белков 10, 20, 30, 40, 50, 60,70 кДа, слева обозначены белки вируса эктромелии.

Пример 5. Изучение нейтрализующей активности МКА 122Н9 на культуре клеток Vero При постановке реакции нейтрализации (РН) использовали вирусы осповакцины (штамм ЛИВП) и натуральной оспы (штамм Индия За). Работа с вирусом натуральной оспы проводилась в условиях максимальной защиты (BSL-4) с использованием защитных костюмов с положительным давлением в сотрудничающем центре ВОЗ, Кольцово. Новосибирской области. Характер проводимых работ с вирусом натуральной оспы предварительно был одобрен ВОЗ. Инфекционность вируса определяли методом бляшек на культуре клеток Vero. Вируснейтрализующую активность МКА определяли в монослое культуры клеток Vero, в 96-луночных планшетах, используя асцитическую жидкость или очищенные МКА. Серийные двукратные разведения МКА в поддерживающей среде (50 мкл) вносили в лунку планшета, содержащую 100 мкл поддерживающей среды, после чего вносили 1000 БОЕ инфекционного вируса в объеме 50 мкл. Начальное разведение МКА в лунке составляло 1:40-1:50 для ВОВ и 1:400-1:500 для ВНО. Планшеты инкубировали в течение 3-х суток в СО₂-инкубаторе при 37°С с ВОВ и при 35°С с вирусом натуральной оспы. После этого клетки прокрашивали 0,1% раствором кристаллического фиолетового с 10% формалина и количество бляшек учитывали визуально. О наличии нейтрализации судили по отсутствию или снижению количества бляшек. В качестве положительного контроля использовали моноклональное антитело J2D5, любезно предоставленное Ichihashi Y [4], в качестве отрицательного - асцитическую жидкость NSO миеломы. Результаты показаны в таблице 2. Как видно из представленных данных, МКА 122Н9, секретируемые штаммом-продуцентом Rattus norvegicus НИИМБ-281, ингибировали размножение ВОВ и ВНО в культуре клеток Vero.

Таблица 2Определение нейтрализующей активности МКА 122Н9
МКА	Белок-мишень (кДа)	Вирус-иммуноген	Титр МКА в РН (обр. величины)*.
ВОВ	ВНО
100%	≥50%	≥50%
122Н9	12,8	ВЭ	50	12000	500
* - в % указано подавление бляшкообразования.

Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток Rattus norvegicus 122Н9 позволяют заключить, что впервые на основе крысиной миеломы получена гибридома Rattus norvegicus 122H9 - продуцент перекрестно-реактивных нейтрализующих МКА к белкам ортопоксвирусов. Штамм гибридных клеток обеспечивает получение крысиных иммуноглобулинов IgG класса в количестве 7,5 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости. Использование для получения моноклональных антител гибридомы крысиного происхождения имеет свои преимущества перед мышиными гибридомами в объеме продуцируемой асцитической жидкости. Известно, что выход асцитической жидкости от одной мыши составляет от 3 до 5 мл. Использование штамма гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9 позволяет получать 15-30 мл асцитической жидкости от одного животного. Очищенные МКА 122H9 специфично реагировали в ИФА с вирусом эктромелии (титр МКА составлял 1:2200000) и выявляли в иммуноблоте белок 12,8 кДа ВЭ, штамм К-1, (ген 214L). полученные МКА проявляли также перекрестную реактивность в ИФА с вирусами осповакцины, оспы коров и натуральной оспы. Кроме того, как показали результаты реакции нейтрализации, МКА 122H9 обладали вируснейтрализующей активностью против ВОВ и ВНО (штамм Индия За), наиболее патогенного представителя ортопоксвирусов. Вышеуказанные свойства штамма Rattus norvegicus 122H9 отличают его от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам ортопоксвирусов.

Источники информации

1. Baker O.R., Bray M., Huggins J.W.//Antiviral. Research - 2003 - Vol.53 - P.13-23.

2. Czemy C.P., Johann S., Holzle L., Meyer H. //Virology - 1994 - Vol.200, N2 - P.764-77.

3. Dallo S, Rodriguez JF, Esteban M.A //Virology - 1987. - Vol.159, №2 - P.423-32.

4. Ichihashi Y., Oie M. //Virology - 1988. - Vol.163, №1 - P.133-44.

5. Hooper J.W., Schmaljohn A.I., Schmaljohn C.S.//Prophylactic and therapeutic monoclonal antibodies. - Patent Number: 6, 451, 309 В2 (US)., Sep. 17, 2002.

6. Meyer H, Osterrieder N, Czemy CP. // Virology - 1994 - Vol.200, №2 - P.778-83.

Штамм гибридных клеток Rattus norvegicus 122H9, депонированный в НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор" под №НИИМБ-281, используемый для получения перекрестно-реактивных нейтрализующих моноклональных антител против ортопоксвирусов, патогенных для человека.