Штамм saccharopolyspora erythraea c-77-продуцент антибиотика эритромицина

Штамм saccharopolyspora erythraea c-77-продуцент антибиотика эритромицина

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотика эритромицина, обладающего антимикробным действием и применяемым для изготовления лекарственных форм. Молекула эритромицина представляет большой интерес как основа для биологической и химической трансформации при получении новых эффективных биологически активных препаратов, которые находят широкое применение в медицине и ветеринарии, поэтому получение субстанции эритромицина имеет коммерческую перспективу.

Уровень синтеза антибиотиков микробной культурой зависит от особенностей штамма-продуцента и от условий, в которых проводят процесс культивирования.

При патентовании штаммов-продуцентов антибиотиков в качестве основного показателя, характеризующего штамм-продуцент, используется концентрация антибиотика в культуральной жидкости при определенной длительности процесса, которую обычно определяют в лабораторных условиях при ферментации в колбах. Этот показатель зачастую плохо воспроизводится в производственных условиях, особенно в случае использования обогащенных сред, содержащих нерастворимые в воде компоненты типа муки, мела и других веществ.

Кроме того, технология процесса ферментации, как правило, реализуется по схеме так называемой регулируемой ферментации, в которой первая фаза процесса используется для накопления биомассы продуцента, а вторая - проводится с подпитками субстратов и поддержанием параметров, оптимальных для процесса собственно биосинтеза антибиотика. Вторая стадия является определяющей для эффективности всего процесса в целом. Эффективность второй фазы определяется скоростью биосинтеза антибиотика в единицу времени, отнесенной к единице массы микроорганизма-продуцента. Высокое значение этой характеристики продуцента (удельной скорости антибиотикообразования) дает возможность получить значительное накопление антибиотика при относительно малой концентрации биомассы продуцента. Это позволит, в свою очередь, упростить технологию выделения продукта и облегчить решение вопросов, связанных с утилизацией накопившейся биомассы продуцента. Таким образом, при селекции продуцента эритромицина был использован способ отбора перспективных штаммов по принципиально новому, отличающемуся от ранее используемых, показателю - удельной скорости антибиотикообразования.

Известны штаммы-продуценты эритромицина с максимальным уровнем образования эритромицинов в процессе ферментации 4500-7500 мкг/мл на 168-204 час ферментации (1,2,3). К сожалению, в описаниях патентов не приводится данных по концентрации биомассы продуцентов, что не позволяет оценить значение интересующего нас показателя удельной скорости антибиотикообразования.

Целью изобретения является получение штамма с большей удельной скоростью накопления эритромицина и высоким уровнем продуктивности. Эта цель была достигнута в результате селекции штамма и отборе клонов с высокой скоростью образования антибиотика в процессе ферментации на комплексных средах. Штамм Saccharopolyspora erythraea C-77 получен из штамма S.erythraea ВНИИА 1658, который характеризовался активностью 7500 мкг/мл к 168 часу ферментации. Для исходного штамма были получены данные по максимальной удельной скорости синтеза эритромицина в пределах 0,9-1,1 мкг/мл·час.

Для получения штамма с более высокой удельной скоростью образования эритромицина споровый материал исходного штамма засевали последовательно в 2 посевные и ферментационную среды. Через 48 часов роста культуры в ферментационной среде на ротационной качалке культуральную жидкость разбавляли в 5 раз, снова помещали на качалку и инкубировали в течение 24 часов. В разбавленных суспензиях после суток культивирования определяли концентрацию эритромицина и отбирали варианты по максимальной концентрации эритромицина через 24 часа культивирования в разбавленной среде.

У отобранных вариантов, сохранивших максимальную удельную скорость накопления эритромицина при проведении их последовательно через 3 моноклоновых рассева, была подтверждена высокая удельная скорость образования антибиотика, превышающая таковую у исходного штамма. При последующих рассевах свойства отобранных клонов сохранялись. Лучший вариант использовали в качестве нового штамма-продуцента Saccharopolyspora erythraea C-77.

Споровую суспензию полученного штамма лиофильно высушили в обезжиренном молоке в качестве протектора, что позволит сохранить такой материал в холодильнике при +5°С до 10 лет.

Штамм Saccharopolyspora erythraea C-77 обладает основными типичными для вида S.erythraea культурально-морфологическими и биохимическими признаками и имеет следующие характеристики.

Воздушный мицелий разветвленный, диаметром 0,4-0,6 мкм, гифы спиральные, сегментированы в виде бус-цепочек, остающихся в чехле.

Вегетативный мицелий развитый, разветвленный, тонкий, базофилия протоплазмы снижается к концу ферментации.

На среде СР-15, содержащей соевую муку, кукурузный экстракт, мелассу, крахмал и соли, на 14 сутки колонии достигают 3-5 мм в диаметре. Преобладающий тип - колонии круглой формы с фестончатым краем и радиально складчатой поверхностью, слегка углублены в агар. Воздушный мицелий светло-бежевый или серый, субстратный мицелий светло-коричневый. При высеве культуры на твердую среду обычно происходит расщепление. В общей популяции присутствуют 7-13% колоний с темно-серым воздушным мицелием, выделяющих в агар темно-коричневый пигмент, и 8-15% желтоватых колоний с плохой споруляцией.

На овсяной среде на 14 сутки колонии основного типа достигают 2-3 мм в диаметре, имеют круглую форму с кратером по середине и белым субстратным мицелием. В общей популяции присутствуют колонии основного типа в количестве 80-86%, а также 8-12% колоний с темно-серым воздушным мицелием, которые выделяют в агар темно-коричневый пигмент, и 6-7% бежевых колоний с плохой споруляцией.

На среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт и соли, преобладают колонии круглой формы, диаметром 2-3 мм, матовые, белого цвета, углубленные в агар. Поверхность колонии радиально-складчатая, профиль выпуклый, без кратера, край фестончатый, консистенция сухая, плотная. В популяции 7-8% колоний светло-бежевого цвета, круглой формы, диаметром 4-5 мм, имеющих матовую концентрически-складчатую поверхность, с фестончатым краем и плоским профилем. Имеется 3-5% колоний коричневого цвета, диаметром 2-3 мм, не углубленных в агар.

На среде Ваксмана рост очень слабый. На 14 сутки колонии достигают максимального размера 0,5-0,8 мм, имеют круглую форму, белый воздушный мицелий, не выделяют пигмент и не углубляются в агар.

На среде Чапека с дрожжевым экстрактом, крахмалом и солями роста нет.

Температура для роста и ферментации 32-34°С.

Сбраживает глюкозу, арабинозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу, сорбит, инозит, рамнозу. Разжижение желатины наблюдается с 10 по 20 сутки, пептонизация молока - с 11 по 20 сутки, гидролиз крахмала - на 4 сутки.

Пример 1.

Исходный штамм 1658 (ВНИИА) и штамм Saccharopolyspora erythraea С-77 высевали на твердую среду СР-15, содержащую (%): соевую муку - 0.5, мелассу - 0,5, кукурузный экстракт - 0,5, крахмал - 0,5, сульфат аммония - 0,05, хлористый натрий - 0,05, сульфат магния - 0,07, мел - 0,1, агар - 2, рН среды 8.0. Готовым споровым материалом с каждого штамма засевали колбы емкостью 750 мл с 50 мл посевной среды №1 следующего состава (%): соевая мука - 4,0, глюкоза - 0,5, глицерин - 1,0, сульфат аммония - 0,25, фосфорнокислый аммоний - 0,06, мел - 0,8, рН 7,0-7,2. Выращивали на ротационной качалке при 200-220 об/мин и температуре 33±1°С в течение 48 часов.

Посевным материалом в количестве 10% от объема среды засевали такие же колбы с 50 мл посевной среды №2 следующего состава (%): соевая мука - 3,0, декстрин белый - 2,0, крахмал - 3,0, сульфат аммония - 0,2, фосфорнокислый калий однозамещенный - 0,015, мел - 1,0, рН 7,0. Инкубировали при тех же условиях 24 часа.

Для сравнения удельной скорости накопления антибиотика у селекционированного и исходного штаммов были использованы лабораторные ферментеры, вместимостью 3 литра с 1,5 литрами питательной ферментационной среды следующего состава (%): соевая мука - 3,0, декстрин белый - 4,0, крахмал - 3,0, сульфат аммония - 0,2, фосфорнокислый калий однозамещенный - 0,015, мел - 1,0, рН 7,0. Готовым вегетативным посевным материалом в количестве 5% засевали ферментеры. Ферментацию проводили при температуре 33±1°С, при перемешивании 900 об/мин и аэрации: 1 объем стерильного воздуха на 1 объем культуральной среды. Начиная с 48 часов, каждые 24 часа из ферментеров отбирали пробы культуральной жидкости, в которых определяли концентрацию эритромицинов методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus cereus var.mycoides.

Из-за сложных питательных сред, используемых для биосинтеза эритромицина, биомассу определить прямым весовым способом невозможно, поэтому этот параметр определяли косвенным методом по содержанию ДНК в мицелии продуцента. Сухой вес мицелия был равен количеству ДНК в мицелии, определенной по методике с дифениламином модификации Бартона (4), умноженному на переводной коэффициент. Удельную скорость образования антибиотика вычисляли как отношение концентрации эритромицина (отношение прироста концентрации эритромицина в сутки) к сухому весу в мицелии в единицу времени. В таблице 1 представлены показатели максимальной удельной скорости образования эритромицина для двух штаммов.

Таблица 1Максимальная удельная скорость образования эритромицина.
№ п/п	Штаммы	мг эритромицина/г сухой биомассы/час
1	S.erythraea 1658 (ВНИИА)	90±7
2	S.erythraea C-77	120±10

Для штамма Saccharopolyspora erythraea C-77 характерна повышенная удельная скорость синтеза антибиотика на протяжении всей ферментации по сравнению с исходным штаммом. При этом новый штамм C-77 образовывал биомассы на 15-20% меньше, чем контрольный, что способствует упрощению технологии выделения целевого продукта и облегчает решение вопросов, связанных с утилизацией накопившейся биомассы продуцента.

Ферментация в режиме периодического процесса с использованием штамма Saccharopolyspora erythraea C-77 показала уровень образования эритромицина 8250 мкг/мл к 7 суткам культивирования, что на 10% было выше продуктивности у контрольного штамма. При организации регулируемой ферментации возможны еще более высокие итоговые показатели процесса.

Таким образом, выделенный штамм S.erythraea C-77 имеет максимальную удельную скорость синтеза на 30% выше, а уровень образования эритромицинов на 10% выше по сравнению с исходным штаммом, при снижении на 15-20% количества образуемой биомассы.

Новый штамм Saccharopolyspora erythraea C-77 был депонирован и помещен на хранение в коллекцию микроорганизмов ООО ПКФ "БИГОР".

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1092951, приоритет 01.10.82, МКИ С 12 P 19/62. Опубл. 09.02.95 в Бюлл. №4. Штамм Streptomyces erythreus 85-1 - продуцент эритромицина.

2. Авторское свидетельство СССР №1651557, приоритет 28.08.89, МКИ С 12 Р 19/62. Опубл. 27.01.95 в Бюлл. №4. Штамм Streptomyces erythreus - продуцент эритромицина.

3. Патент RU №2142509, приоритет 19.05.99, МКИ С 12 Р 1/06. Опубл. 10.12.99 в Бюлл. №34. Штамм Saccharopolyspora erythraea 52 - продуцент антибиотика эритромицина.

4. Burton К., Biochem. J., 1956, №62, р.315.

Штамм Saccharopolyspora erythraea C-77 - продуцент эритромицина.