Способ экспресс-обнаружения возбудителя внутрибольничных инфекций burkholderia cepacia и дифференциации его от других видов буркхольдерий и псевдомонад

Изобретение относится к области медицины. Изобретение характеризуется иммунолюминесцентным исследованием мазков-препаратов из исследуемых проб, окрашенных иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против В.cepacia, взаимодействующими с В.cepacia и не реагирующими на присутствие других видов буркхольдерий и псевдомонад. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие получают на основе гамма-глобулиновой фракции, изолированной из гипериммунной сыворотки кролика против В.cepacia методом переосаждения сульфатом аммония и меченной флуорохромом. Гипериммунную сыворотку выделяют из крови кроликов, которых иммунизируют смесью антигенов В.cepacia и адъюванта Фрейнда. Антигены получают из клеток штамма B.cepacia 25416 АТСС, которые выращивают на твердой питательной среде, смывают 0,9% раствором NaCl pH 7,2, стерилизуют охлажденным до -40°С ацетоном и высушивают под тягой. Затем сухие клетки B.cepacia суспендируют в 0,9% растворе NaCl, обрабатывают ультразвуком. Дезинтегрант используют для иммунизации кроликов. Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с антигенным комплексом. Животных обескровливают при титре сыворотки 1:32. Изобретение обеспечивает простоту и эффективность дифференциации, позволяет в течение 2-4 ч дать предварительный ответ о наличии/отсутствии в пробе исследуемого материала B.cepacia. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Реферат

Изобретение относится к медицине и касается лабораторной диагностики возбудителя внутрибольничных инфекций B.cepacia и дифференциации его от близкородственных микроорганизмов рода буркхольдерий (В. mallei, В. pseudomallei, B.thailandensis, В. gladioli) и псевдомонад.

Среди микроорганизмов рода Burkholderia важное медицинское значение имеют В.mallei и В.pseudomallei - возбудители тяжелых заболеваний человека и животных - сапа и мелиоидоза и B.cepacia - возбудитель внутрибольничных инфекций у больных с кистозным фиброзом легких и хроническим гранулематозом. B.thailandensis, В. gladioli являются возбудителями редко встречающихся оппортунистических инфекций. Патогенные свойства первых двух микроорганизмов, как представителей 2 группы патогенности, изучены довольно полно. Свойства B.cepacia и механизмы его взаимодействия с макроорганизмом изучены слабо. Описаны многочисленные случаи инфекций, вызываемых этим микроорганизмом. Отмечено, что внутрибольничное инфицирование пациентов происходило при использовании катетеров, дезинфектантов и растворов для внутривенных инъекций, которые были контаминированы B.cepacia. Установлено, что этот микроорганизм обладает высокой резистентностью к антибиотикам (аминогликозидам, колистину, карбенициллину, тикарциллину и имипенему). Благодаря геному большого размера (длина хромосомы B.cepacia в 1,5 раза больше длины хромосомы Pseudomonas aeroginosa) этот микроорганизм быстро адаптируется к внешним условиям при смене экологических ниш.

Идентификация бактерий B.cepacia является многоэтапной, с применением методов определения фенотипических и генотипических признаков. На первом этапе проводится выделение комплекса бактерий B.cepacia с помощью селективных сред. Далее идентифицируют с применением коммерческих систем API 20 NE, Cristal N/F и др., дополнительных фенотипических тестов, выявляют эпидемически значимые штаммы ПЦР-тест-системами и пульс-электрофорезом. Большое значение при лечении инфекций, вызываемых B.cepacia, ввиду высокой их резистентности к антибиотикам имеет быстрота идентификации этого микроорганизма. Вышеперечисленные методы требуют дорогостоящих препаратов и оборудования и продолжительны по времени. Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является «Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики, организации генома и метаболизма» Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Молек. генетика микробиол. вирусол. 2002. - N 2. - С.7-11. В статье описаны применяемые способы идентификации бактерий комплекса B.cepacia. В доступных источниках литературы сведений о способах идентификации с применением сывороток против B.cepacia не обнаружено.

Целью предлагаемого изобретения является способ экспресс-обнаружения B.cepacia и дифференциации этого микроорганизма от других видов буркхольдерий (В. mallei, В. pseudomallei, B.thailandensis, В. gladioli) и псевдомонад на основе полученных иммуноглобулинов.

Поставленная цель достигается иммунолюминесцентным исследованием мазков-препаратов из исследуемых проб, окрашенных иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против B.cepacia, взаимодействующими с B.cepacia и не реагирующими на присутствие других видов буркхольдерий и псевдомонад.

Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие получают на основе гамма-глобулиновой фракции, изолированной из гипериммунной сыворотки кролика против B.cepacia методом переосаждения сульфатом аммония и меченной флуорохромом. Гипериммунную сыворотку выделяют из крови кроликов, которых иммунизируют смесью антигенов B.cepacia и адъюванта Фрейнда. Антигены получают из клеток штамма B.cepacia 25416 АТСС, которые выращивают на твердой питательной среде, смывают 0,9% раствором NaCl pH 7,2, стерилизуют охлажденным до -40°С ацетоном и высушивают под тягой. Затем сухие клетки B.cepacia суспендируют в 0,9% растворе NaCl, обрабатывают ультразвуком. Дезинтегрант используют для иммунизации кроликов. Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с антигенным комплексом. Животных обескровливают при титре сыворотки 1:32.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Получение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против B.cepacia.

Для получения антигенного материала бактерии B.cepacia выращивают на плотной питательной среде (F - агаре "Difco", USA) при 37°С в течение 18 ч. Микробные клетки (м.к.) смывают 0,9% раствором NaCI, pH 7,2. Полученную взвесь бактерий обеззараживают охлажденным до -40°С ацетоном при соотношении компонентов 1:3. Гибель бактерий завершается через 3 суток инкубации взвеси в условиях холодильника. Затем стерильную бактериальную массу освобождают от ацетона центрифугированием в течение 20 мин при 8000 g и 4°С. Осадок высушивают под тягой и растирают до гомогенного состояния.

Для иммунизации кроликов готовят суспензию сухих клеток в 0,9% растворе NaCl, pH 7,2, с концентрацией 20 мг/мл. Полученную взвесь бактерий подвергают обработке ультразвуком мощностью 100 Вт и частотой 20 кГц. Проводят 5 циклов обработки (1 цикл: 1 мин - воздействие ультразвуком, 3 мин - охлаждение).

Для получения гипериммунных сывороток используют кроликов массой 2 -3 кг в возрасте до двух лет. Животных иммунизируют ультразвуковым дезинтегратом бактерий B.cepacia, проводя три цикла введения данного антигена. Антиген для иммунизации готовят на 0,9% растворе NaCI, pH 7,2 с добавлением неполного адъюванта Фрейнда ("Difco", USA) в соотношении 1:1 в объеме 2,0 мл. В первый и третий циклы антигены вводят в объеме 1 мл в возрастающих дозах: 1,25, 2,5, 5, 10 млрд м.к. по стандарту мутности. Во втором цикле антигены вводят в объеме 1 мл в уменьшающих дозах: 10, 5, 2,5, 1,25 млрд. м.к. Одно введение состоит из паравертебральных внутрикожных инъекций 0,2 мл приготовленной смеси антигена и адъюванта в 10 точек каждому животному. Интервалы между введениями составляют 7 суток, между циклами - 30 суток. Активность сывороток оценивают после каждого цикла в реакции иммунодиффузии в геле с антигенным комплексом (разведение 1:2). Животных обескровливают при титре сыворотки 1:32.

Из гипериммунной сыворотки методом осаждения белка сульфатом аммония изолируют фракцию гамма-глобулинов. На основе выделенных антител против B.cepacia готовят препарат иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих. Гамма-глобулин метят флуорохромом флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). Конъюгирование белка с флуорохромом проводят в течение 2,5 ч в условиях постоянного перемешивания реагентной смеси на магнитной мешалке при pH среды 9,0-9,5 и нагрузке ФИТЦ 25 мг на 1 г белка. Полученный конъюгат ФИТЦ-белок освобождают от непрореагировавших компонентов смеси на колонке с сефадексом G-25. Очищенный препарат иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих ампулируют по 0,2-0,5 мл и хранят в холодильнике при +4°С в течение месяца. Хранение в течение более длительного промежутка времени осуществляют при -20°С.

Пример 2. Оценка специфической активности сырья для изготовления иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против В. cepacia с помощью непрямого метода флуоресцирущих антител (НМФА).

НМФА проводится в стандартных условиях. Все микроорганизмы выращивают в идентичных условиях на плотной питательной среде в течение 18 ч при 37°С. Мазки-препараты готовят из клеточных суспензий в 0,9% растворе NaCl, pH 7,2 с концентрацией 5-108 м.к./мл по ОСО мутности. Сыворотку против B.cepacia разводят 1:200, 1:400, 1:800 и т.д. 0,9% раствором NaCl, pH 7,2, обрабатывают ей мазки-препараты исследуемых штаммов и окрашивают конъюгатом флуоресцирующих антител против иммуноглобулинов кролика. В качестве конъюгата используют коммерческий препарат производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи. Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1Диагностические возможности гипериммунной сыворотки против B.cepacia.
№№п/пОбъект исследованияМинимальные разведения сыворотки, обеспечивающие получение положительного результата НМФА (идентификация вида)
1B.cepacia 254161:4000
2B.cepacia 82351:2500
3B.cepacia 82361 800
4B.cepacia 82371 800
5B.cepacia 82381 800
6B.cepacia 82401 800
7B.cepacia 31811 1000
8B.cepacia 31891 800
9B.cepacia Vang1 800
10B.pseudomallei 568301 200
11B.mallei 102301 200
12B.thailandensis 2641 200

Установлено, что использование полученной сыворотки в разведении 1:800 и более против В. cepacia в НМФА позволяет идентифицировать 90% имеющихся типичных штаммов (представлены в Коллекционном центре ВолгНИПЧИ). При разведении 1:800 возможно дифференцировать B.cepacia от B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis.

Пример 3. Применение предлагаемого способа для идентификации B.cepacia.

В качестве диагностического препарата используют иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие к антигенам B.cepacia, полученные на основе гамма-глобулиновой фракции, изолированной из гипериммунной сыворотки кролика против B.cepacia 25416 методом трехкратного переосаждения сульфатом аммония. Гамма-глобулиновую фракцию метят ФИТЦ. Концентрация белка в препарате составляет 5,8 мг/мл. Соотношение МФИТЦбелок - 6,5. Рабочее разведение конъюгата - 1:32. Мазки-препараты окрашивают полученным конъюгатом и просматривают на люминесцентном микроскопе (метод флуоресцирующих антител).

Данные по идентификации музейных культур B.cepacia приведены в таблице 2.

Таблица 2 Определение рабочего разведения препарата иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих к антигенам B.cepacia
№№п/пНазвание микроорганизмовРазведения конъюгата
48163264128256
1B.cepacia 25416444/33/43/43/22
2B.cepacia 82354443/433/22
3B.cepacia 82373333/2---
4B.cepacia 82383333/2---
5B.cepacia 824033333/2--
6B.cepacia 31813333333/2
7B.cepacia 31893/4333332/3
8B.cepacia Vang333332/3-

Как следует из представленных данных, применение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против B.cepacia позволяет достоверно идентифицировать большинство штаммов этого вида, имеющихся в Коллекционном центре ВолгНИПЧИ, при разведении конъюгата 1:32. Это разведение принимают в качестве рабочего.

Пример 4. Экспресс-обнаружение B.cepacia предлагаемым способом из группы видов родов Burkholderia, Pseudomonas.

Для идентификации микроорганизмов мазки-препараты, окрашенные иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против B.cepacia 25416 в рабочем разведении (1:32), просматривают на люминесцентном микроскопе.

Результаты опытов приведены в таблице 3.

Из представленных в таблице 3 данных следует, что предлагаемый способ экспресс-обнаружения B.cepacia позволяет при применении иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих при рабочем разведении 1:32 идентифицировать штаммы этого вида из группы видов рода Burkholderia, Pseudomonas.

Таблица 3Сводные данные по идентификации B.cepacia иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими против B.cepacia
№№п/пОбъекты исследованияРезультаты МФА
1B.cepacia 25416+
2B.cepacia 8235+
3B.pseudomallei 56830-
4B.pseudomallei 57576-
5B.pseudomallei С-141-
6В. pseudomallei 56770-
7В. pseudomallei 56738-
8В. mallei 10230-
9В. mallei Muksuwar-
10В. mallei 8-
11В. mallei ц-4-
12В. mallei ц-5-
13Р. aeruginosa 249-
14Р. aeruginosa BP-5812-
15Р. aeruginosa H-1-
16Р. aeruginosa H-6-
17Р. aeruginosa 4000-
18Р. maltophilia4131-
19Р. alcaligenes BKMB 4138-
20Р. mendocina 972-
21Р. marginata 1298-
22P. myxogenes 878-
23P. putida 1608-
24P. putida 973-
25P. tactorolens BKMB 904-
26P. fragia 4002-
27P. stutzeri 903-
28P. fluorescens A-4125-
29Р. fluorescens В-1602-
Примечание: "+" - положительный результат МФА"-" - отрицательный результат МФА.

Таким образом, из приведенных примеров следует, что предложенный способ эффективен при экспресс-обнаружении B.cepacia и идентификации этого микроорганизма от B.pseudomallei, В.mallei, B.thailandensis, В.gladioli. Он позволяет в течение 2-4 ч дать предварительный ответ о наличии/отсутствии в пробе исследуемого материала B.cepacia, имея существенные преимущества в скорости получения ответа по сравнению с бактериологическим методом, требующим для своего воспроизведения в полном объеме не менее 3 суток.

1. Способ экспресс-обнаружения возбудителя внутрибольничных инфекций Burkholderia cepacia и дифференциации его от других видов буркхольдерий и псевдомонад, включающий приготовление мазков из материала, подозрительного на зараженность этим возбудителем и последующее их иммунолюминесцентное исследование, отличающийся тем, что для выявления искомых бактерий применены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие, взаимодействующие с микробными клетками В.cepacia, выделенные из гипериммунной сыворотки кролика, иммунизированного антигенами В.cepacia 25416 АТСС, которые получают из взвеси бактерий, приготовленной суспендированием в 0,9%-ном растворе NaCl, рН 7,2, сухих микробных клеток (м.к.) в концентрации 20 мг/мл 18-часовой культуры В.cepacia, выращенной на твердой питательной среде (F-агаре «Difco», USA) при 37°С, смытой 0,9%-ным раствором NaCl, рН 7,2, и стерилизованной охлаждением до -40°С ацетоном в соотношении 1:3 в течение 3 сут., приведенной до сухого состояния освобождением от ацетона центрифугированием в течение 20 мин при 8000 g, +4°С и высушиванием под тягой, и обработанной ультразвуком мощностью 100 Вт, частотой 20 кГц за 5 циклов (1 цикл 1 мин - обработка ультразвуком, 3 мин - охлаждение), и полученные в результате такой обработки антигены используют для трех циклов иммунизации кроликов, из крови которых получают гипериммунную сыворотку, затем из сыворотки методом трехкратного переосаждения сульфатом аммония выделяют иммуноглобулины и при взаимодействии диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов с антигенами B.cepacia обнаруживают этот возбудитель внутрибольничных инфекций.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что цикл иммунизации включает 4-кратное в течение месяца введение антигена, каждое из которых имеет суммарный объем 2 мл смеси, 1 мл антигенного комплекса B.cepacia и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, и состоит из инъекций по 0,2 мл внутрикожно паравертебрально в 10 точек каждому животному с интервалами между введениями 7 сут, между циклами - 30 сут, при этом в первом и третьем циклах отдельное введение содержит антиген в объеме 1 мл в возрастающих дозах: 1,25; 2,5; 5; 10 млрд м.к. по стандарту ОСО мутности ГИСК им. Тарасевича, во втором цикле отдельное введение содержит антиген в 1 мл в уменьшающей дозе 10; 5; 2,5; 1,25 млрд. м.к.