Антигенные пептиды neisseria

Антигенные пептиды neisseria

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к антигенным пептидным последовательностям из бактерии Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

N. meningitidis является неподвижным грамотрицательным диплококком, который является патогенным для человека.

На основании капсулярного полисахарида указанного организма было идентифицировано 12 серологических групп N. meningitidis. Группа А является патогеном, наиболее часто участвующим в эпидемическом заболевании в лежащей южнее Сахары Африке. Серологические группы В и С являются ответственными за огромное большинство случаев в Соединенных Штатах и наиболее развитых странах. Серологические группы W135 и Y являются ответственными за остальные случаи в Соединенных Штатах и развитых странах.

Применяемая в настоящее время менингококковая вакцина является четырехвалентной полисахаридной вакциной, состоящей из серологических групп А, С, Y и W135. Однако менингококк В остается проблемой. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая присутствует также в ткани млекопитающих. Один подход к вакцине menB использует смеси наружных мембранных белков (ОМР). Для преодоления антигенной вариабельности были сконструированы поливалентные вакцины, содержащие до девяти различных поринов [например, Poolman JT (1992) Development of meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4:13-28]. Дополнительными белками, используемыми в вакцинах на основе белков наружной мембраны, были белки ора и орс, но ни один из этих подходов не был в состоянии преодолеть антигенную вариабельность [например, Ala'Aldeen & Borriello (1996)]. Менингококковые трансферринсвязывающие белки 1 и 2 находятся на поверхности и генерируют бактерицидные антитела, способные убивать гомологичные и гетерологичные штаммы. [Vaccine 14 (1):49-53].

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении представлены фрагменты белков, описанных в международных патентных заявках WO 99/57280 и WO 00/22430 (далее: «Международные заявки»), причем эти фрагменты содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту. При этом последовательностям No. 2370 и No. 2372 Международной заявки WO 99/57280 соответствуют в списке последовательностей, прилагаемом к описанию настоящей заявки, последовательности 998 и 999.

Так, если длина любой конкретной белковой последовательности, описанной в Международных заявках, составляет х аминокислот, то в данном изобретении представлены фрагменты самое большее в х-1 аминокислот этого белка. Фрагмент может быть более коротким (например, х-2, х-3, х-4,...) и предпочтительно имеет 100 аминокислот или менее (например, 90 аминокислот, 80 аминокислот и т.д.). Этот фрагмент может составлять в длину даже 3 аминокислоты, но предпочтительно является более длинным (например, до 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот).

Предпочтительные фрагменты содержат менингококковые пептидные последовательности, описанные в таблице 1, или их субпоследовательности. Фрагменты могут быть более длинными, чем приведенные в таблице 1, например, в случае, когда фрагмент в таблице 1 простирается от аминокислотного остатка р до остатка q белка, данное изобретение относится также к фрагментам от остатка (р-1), (р-2) или (р-3) до остатка (q+1), (q+2) или (q+3).

В данном изобретении представлены также полипептиды, которые являются гомологичными (т.е. имеют идентичность последовательности) относительно этих фрагментов. В зависимости от конкретного фрагмента степень идентичности последовательности является предпочтительно большей, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Эти гомологичные полипептиды включают мутанты и аллельные варианты этих фрагментов. Идентичность между двумя последовательностями предпочтительно определяют обычно с использованием алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, обеспеченного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинного гэпа с параметрами пенальти (штраф) открывания гэпа = 12 и пенальти (штраф) удлинения гэпа = 1.

В данном изобретении представлены также белки, содержащие один или более определяемых выше фрагментов.

Данное изобретение подчиняется условию, что оно не включает в свой объем белки, ограничиваемые любой из полноразмерных белковых последовательностей, описанных в Международных заявках (т.е. четных последовательностей SEQ ID NO:2-3020 WO 99/57280 и нечетных SEQ ID NO:963-1045 WO 00/22430).

Белки согласно изобретению могут, конечно, быть получены различными способами (например, путем рекомбинантной экспрессии, очистки из культуры клеток, путем химического синтеза и т.д.) и в различных формах (например, в нативном виде, в виде С-концевых и/или N-концевых гибридов и т.д.). Предпочтительно их получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащими других белков Neisseria или клетки-хозяина). Короткие белки получают предпочтительно при помощи химического синтеза пептидов.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к антителам, которые узнают фрагменты согласно изобретению, при условии, что данное изобретение не включает в свой объем антитела, которые узнают любую из полноразмерных белковых последовательностей, представленных в Международных заявках. Эти антитела могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть получены любым подходящим способом.

Данное изобретение представляет также белки, содержащие пептидные последовательности, узнаваемые этими антителами. Эти пептидные последовательности будут, конечно, включать фрагменты менингококковых белков в Международных заявках, но будут также включать пептиды, которые имитируют антигенную структуру менингококковых пептидов, будучи связанными с иммуноглобулином.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую фрагменты и белки данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в свой объем нуклеиновую кислоту, кодирующую любую из полноразмерных белковых последовательностей в Международных заявках. Нуклеиновые кислоты могут быть не длиннее 10 нуклеотидов, но предпочтительно являются более длинными (например, до 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 нуклеотидов).

Кроме того, данное изобретение представляет нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность последовательности) этим последовательностям. Степень идентичности последовательности предпочтительно является большей, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Кроме того, данное изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая может гибридизоваться с этими последовательностями, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, 65°С в растворе 0,1×SSC, 0,5% ДСН).

Должно быть понятно, что данное изобретение представляет нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности, комплементарные описанным выше последовательностям (например, для применения в качестве антисмысловых последовательностей или зондов).

Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть, конечно, получена многочисленными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и может принимать различные формы (например, одноцепочечные, двухцепочечные, векторы, зонды и т.д.). Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные скелеты молекул, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д..

Согласно следующему аспекту, данное изобретение представляет векторы, содержащие нуклеотидные последовательности данного изобретения (например, экспрессирующие векторы), и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение представляет композиции, содержащие белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением. Эти композиции могут быть пригодными, например, в качестве вакцин или в качестве диагностических реагентов или в качестве иммуногенных композиций.

Данное изобретение представляет также нуклеиновую кислоту, белок или антитело согласно данному изобретению для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин или в качестве иммуногенных композиций) или в качестве диагностических реагентов. Оно представляет также применение нуклеиновой кислоты, белка или антитела в соответствии с данным изобретением в производстве: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных в отношении бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут быть любым видом или штаммом (таким как Neisseria gonorrhoeae), но предпочтительно являются N. meningitidis, в частности, штаммом А или штаммом В.

Данное изобретение представляет также способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела данного изобретения.

Согласно следующим аспектам, данное изобретение представляет различные способы, например:

представлен способ получения белков данного изобретения, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с данным изобретением в условиях, которые индуцируют экспрессию белка;

представлен способ получения белка или нуклеиновой кислоты данного изобретения, в котором белок или нуклеиновую кислоту синтезируют с использованием частично или полностью химических способов;

представлен способ обнаружения полинуклеотидов данного изобретения, включающий стадии: (а) контактирования зонда нуклеиновой кислоты данного изобретения с биологической пробой в условиях гибридизации с образованием дуплексов; и (b) обнаружения указанных дуплексов; и

представлен способ обнаружения белков данного изобретения, включающий стадии: (а) контактирования антитела в соответствии с данным изобретением с биологической пробой в условиях, подходящих для образования комплексов антитело-антиген; и (b) обнаружения указанных комплексов.

Далее следует краткое описание стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (например, для использования описанных последовательностей для вакцинации или для диагностических целей). Это краткое изложение не является ограничением данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но которые не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет использовать, если нет других указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках квалификации в данной области. Такие способы объясняются в полном виде в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed, 1984); Vucleic Acid Hybridisation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilised Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), в частности тома 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds 1986).

В данной заявке используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу общего количества X+Y в этой композиции составляет X. Предпочтительно, Х составляет по меньшей мере около 90% по весу общей суммы X+Y в композиции, более предпочтительно по меньшей мере около 95% или даже 99% по весу.

Термин "содержащий" означает "включающий", а также "состоящий", например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из Х или может включать что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин "антигенная детерминанта" включает В-клеточные эпитопы и Т-клеточные эпитопы.

Термин "гетерологичный" относится к двум биологическим компонентам, которые не находятся вместе в природе. Этими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные участки, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, как, например, когда промотор, гетерологичный для гена, функционально связан с этим геном. Другим примером является случай, когда менингококковая последовательность является гетерологичной для мышиной клетки-хозяина. Дополнительными примерами могли бы быть два эпитопа из одного и того же или различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, не обнаруживаемом в природе.

"Точка начала репликации" является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Точка начала репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способной к репликации под его собственным контролем. Точка начала репликации может быть необходимой для репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. С определенными точками начала репликации экспрессирующий вектор может быть репродуцирован в высоком числе копий в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами точек начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые являются эффективными в дрожжах; и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Системы экспрессии

Менингококковые нуклеотидные последовательности могут быть экспрессированы в разнообразных системах экспрессии;

например, системах экспрессии, которые используются клетками млекопитающих, бакуловирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Системы экспрессии млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь участок инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, обычно расположенный на 25-30 пар нуклеотидов (п.н.) слева (против хода транскрипции) от сайта инициации транскрипции. Предполагается, что ТАТА-бокс определяет начало синтеза РНК РНК-полимеразой II в правильном месте. Промотор млекопитающих содержит также левый промоторный элемент, обычно расположенный в 100-200 п.н. слева от ТАТА-бокса. Левый промоторный элемент определяет скорость, при которой инициируется транскрипция и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Гены вирусов млекопитающих часто являются высокоэкспрессируемыми и имеют широкий спектр хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор мышиного вируса опухоли молочной железы, основной поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, произведенные из не-вирусных генов, такие как ген мышиного металлотионеина, также представляют применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцируемой), в зависимости от того, может ли данный промотор индуцироваться глюкокортикоидом в чувствительных к гормону клетках.

Наличие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни транскрипции. Энхансер является регулярной последовательностью ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичным или гетерологичным промоторами, причем синтез начинается в нормальном стартовом (инициирующем) сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены против хода транскрипции (слева) или по ходу транскрипции (справа) от сайта инициации транскрипции, либо в нормальной, либо в обратной ориентации, или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Albertis et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, произведенные из вирусов, могут быть особенно применимыми, так как они обычно имеют широкий спектр хозяев. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, произведенные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1989) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с этой молекулой ДНК, и в этом случае первая аминокислота на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионином, который кодируется инициирующим кодоном ATG. Если желательно, этот N-конец может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая представляет секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно, имеются сайты процессинга, кодируемые между этим лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут быть отщеплены in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые регулируют секрецию белка из клетки. Аденовирусный. состоящий из трех частей лидер является примером лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации и полиаденилирования, узнаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными участками, расположенными 3' (справа) относительно стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой мРНК образуется сайт-специфическим посттрансляционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3'end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают сигналы, произведенные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Обычно, описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным сайгами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессионную конструкцию, если желательно. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Репликационные системы млекопитающих включают системы, происходящие из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазмиды, содержащие репликационные системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] или полиомавирус, реплицируются до исключительно высокой копийности в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают репликоны, происходящие из бычьего папилломавируса и вируса Эпстайна-Барр. Дополнительно, репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов млекопитающее-бактерии включают рМТ2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и рНЕВО [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от подлежащего трансформации хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, кальций-фосфатную преципитацию, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в данной области и включают многочисленные иммортализованные клеточные динии из Американской Коллекции Типовых культур (АТСС), в том числе, но не только, клетки яичника китайского хомячка (СНО), HeLa-клетки, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2) и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомого и функционально связан с регуляторными элементами в этом векторе. Конструирование векторов использует способы, которые известны в данной области. Обычно, компоненты экспрессионной системы включают вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, который содержит как фрагмент бакуловирусного генома, так и удобный сайт рестрикции для встраивания гетерологичного гена или гетерологичных генов, которые должны быть экспрессированы; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это позволяет осуществить гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомого и среды для выращивания.

После встраивания ДНК-последовательности, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, этот вектор и геном вируса дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где этому вектору и вирусному геному дают рекомбинироваться. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, и рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и способы для систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме набора от, помимо прочего, Invitrogen, San Diego CA (набор "МахВас"). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и в полном виде описаны в Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin NO. 1555 (1987) (далее называемом "Summers and Smith").

Перед встраиванием ДНК-последовательности, кодирующей данный белок, в бакуловирусный геном, описанные выше компоненты, в том числе промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно собирают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик). Эта конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый со своим собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время, наиболее обычно используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Многие другие векторы, известные специалистам в данной области, также могут быть сконструированы. Они включают, например, pVL985 (который изменяет инициирующий кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI в 32 п.н. по ходу транскрипции (справа) от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Эта плазмида обычно содержит также сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (атр) и точку начала репликации для отбора и размножения в Е.coli.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать по ходу транскрипции (5'→3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь участок инициации транскрипции, который обычно помещен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который, в случае его присутствия, находится обычно дистально от структурного гена. Экспрессия может быть либо регулируемой, либо конститутивной.

Структурные гены, многокопийно транскрибируемые в поздние периоды цикла вирусной инфекции, представляют особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, происходящие из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрон, Friesen et al., (1986) "Regulation of Baculovirus Gene Expression," in The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127 839 and 155476; и гена, кодирующего белок р10, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как ген полиэдрина бакуловируса (Carbonell et al., (1988) Gene, 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модицикаций клеток млекопитающих (таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое расщепление и фосфорилирование) узнаются, по-видимому, клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, являются консервативными между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, лидеры, происходящие не из насекомых, такие как полученные из генов, кодирующих -интерферон человека, Maeda et al., (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Lebacq-Verheyden et al., (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3 (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может быть секретирован. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, находящиеся впереди стартового (инициирующего) сигнала ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут быть секретированы из клетки насекомого посредством создания химерных ДНК-молекул, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который обеспечивает секрецию чужеродного белка в насекомых. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией этого белка в эндоплазматический ретикулум.

После встраивания последовательности ДНК и/или гена, кодирующего экспрессионный продукт-предшественник этого белка, клетку-хозяина насекомого котрансформируют с гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно посредством котрансфекции. Промотор и последовательность терминации транскрипции этой конструкции будет обычно содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусе известны в данной области. (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, встраивание может производиться в ген, такой как ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; встраивание может производиться также в сайт рестрикционного фермента (рестриктазы), введенный генной инженерией в желаемый ген бакуловируса. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в экспрессирующий вектор, фланкирована как 5', так и 3' специфическими последовательностями полиэдрина и расположена справа (по ходу транскрипци) от промотора полиэдрина.

Затем новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (между около 1% и около 5%); таким образом, большая часть вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, необходим способ для идентификации рекомбинантного вируса. Преимуществом этой экспрессионной системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется при очень высоких уровнях в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусного инфицирования. Накопленный белок полиэдрин образует тела включения, которые также содержат уложенные в них частицы. Эти тельца включения, размером до 15 являются высокопреломляющими свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализируется под световым микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантными вирусами, не имеют телец включения. Для отличения рекомбинантного вируса от вируса дикого типа супернатант после трансфекции наносят в виде пятен на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие (являющееся признаком рекомбинантного вируса) телец включения. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. eds) at 16.8 (Suppl. 10, 1990); Summers and Smith, выше; Miller et al. (1989).

Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были разработаны для инфицирования в некоторых клетках насекомых. Например, рекомбинантные бакуловирусы были разработаны для, помимо прочего: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; и см. в общем, Fraser, et al., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культур клеток являются коммерчески доступными как для прямой, так и для гибридной экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток в общем известна специалистам в данной области. См., например. Summers and Smith, выше.

Затем модифицированные клетки насекомых могут выращиваться в подходящей питательной среде, которая позволяет стабильное поддержание плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может выращиваться до высокой плотности и затем экспрессию индуцируют. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна постоянно циркулироваться, удаляя представляющий интерес продукт и увеличивая количество истощаемых питательных веществ. Продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например, ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. В случае необходимости, продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, с тем, чтобы удалить по существу любые белки насекомого, которые также секретируются в среду или происходят из лизиса клеток насекомых, с тем, чтобы получить продукт, который по существу не содержит по меньшей мере клеточного дебриса хозяина, например, белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию кодирующей рекомбинантный белок последовательности. Эти условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако, эти условия могут быть легко определены специалистами в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существует много генетических экспрессионных систем с использованием культуры клеток растений и целого растения, известных в данной области. Примеры генетических экспрессионных систем с использованием клеток растений включают системы, описанные в патентах, таких как: патент США US 5693506; патент США US 5659122, патент США US 5608143. Дополнительные примеры генетической экспрессии в культуре клеток растений были описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме ссылок, описанных выше, в Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al.. Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, можно найти в R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins: in: Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно, с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессионную кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Экспрессионную кассету вставляют в желаемый экспрессирующий вектор с вспомогательными последовательностями против хода транскрипции и по ходу транскрипции от этой экспрессионной кассеты, пригодными для экспрессии в растении-хозяине. Эти вспомогательные последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые характеристики вектору для создания возможности этим векторам перемещать ДНК из исходного клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательное растение-хозяин. Основная конструкция бактериального/растительного вектора будет предпочтительно обеспечивать прокариотическую точку начала репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и, для трансформаций с использованием Agrobacterium, Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Если гетерологичный ген не поддается легко детектированию, эта конструкция будет предпочтительно иметь также ген селектируемого маркера, пригодный для определения, трансформировано ли растение. Общий обзор подходящих маркеров, например, для членов семейства злаковых, можно найти в Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2):165-185.

Рекомендуются также последовательности, подходящие для интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут содержать последовательности транспозонов и т.п. для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможной случайное встраивание гетерологичной экспрессионной кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин или тетрацик