Способ получения диагностикума для обнаружения дифтерийного токсина

Способ получения диагностикума для обнаружения дифтерийного токсина

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении экспресс-анализов в обнаружении дифтерийного токсина, продуцируемого токсигенными культурами коринебактерии дифтерии.

В настоящее время, несмотря на наметившуюся тенденцию к снижению заболеваемости, эпидемическое неблагополучие в стране сохраняется, о чем свидетельствуют высокие показатели тяжести течения дифтерии и смертности от нее.

Лабораторная диагностика дифтерии до настоящего времени представлена традиционными бактериологическими методами - выделением возбудителя в чистой культуре, идентификацией ее по биохимическим признакам и определением токсигенности культуры в реакции преципитации в агаре. Используемые методы не отвечают современным требованиям проведения анализа в связи с трудоемкостью, низкой чувствительностью (невозможность выявления токсигенных штаммов при невысоком уровне токсинообразования) и выдачей окончательного результата исследования лишь на 4-5 сутки.

Для сокращения сроков диагностики дифтерии и повышения чувствительности метода необходима разработка препаратов и методов исследования, направленных на индикацию патогенного агента - дифтерийного токсина.

В настоящее время значительное внимание уделяется получению полимерных латексных носителей антигенов и антител, которые отличаются от биологических (эритроцитарных) носителей отсутствием собственной антигенности, стабильностью при длительном хранении, постоянными физическими параметрами и химическим (ковалентным) взаимодействием с лигандами.

Известны способы обнаружения дифтерийного токсина (см. «Лабораторная диагностики дифтерийной инфекции» Руководство. - М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1995. - стр.42-61), заключающиеся в проведении ускоренных методов диагностики дифтерийной инфекции посредствам постановки иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции непрямой гемагглютинации для выявления дифтерийного токсина (РНГА).

Однако, несмотря на достаточно высокую чувствительность, эти способы имеют недостатки, а именно:

- для проведения ИФА требуется дорогостоящие реагенты и аппаратурное оснащение;

- при РНГА характерна нестабильность и нестандартность свойств эритроцитарного биологического носителя, а также отсутствие лиофилизированного эритроцитарного диагностического препарата, срок хранения выпускаемого жидкого эритроцитарного диагностикума один год.

За прототип выбран способ получения препарата для индикации токсина возбудителя дифтерии в жидкой питательной среде (см. пат. RU №2104714, 20.02.98 г.), включающий обработку глицино-солевым буферным раствором с молярностью 0,05, рН 8,2 гамма глобулина, иммунного к дифтерийному токсину с последующей его иммобилизацией на смесь полистирольного латекса с дисперсностью 1,1-1,2 мкм, активированного метакрилатом цинка при объемном включении, и карбоксилированного полистирольного латекса с дисперсностью 0,2-0,25 мкм, а для стабилизации диагностикума в него добавляют 20 мл 0,1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,05 М глицино-солевом буферном растворе с рН 8,2, содержащего 12% полиэтиленгликоля - 6000.

Однако известный способ имеет ряд недостатков:

- во-первых, в качестве носителя используют смесь латексов разной дисперсности и требующих дополнительного активирования метакрилатом цинка и метакриловой кислотой для создания реакционно-способных групп для взаимодействия с белковыми молекулами дифтерийного иммуноглобулина, что усложняет технологию диагностикума;

- во вторых, серологическую реакцию выполняют на стекле, результаты в виде неокрашенных агглютинантов (частиц) указывают на отсутствие какой-либо демонстративности реакции, при этом чувствительность (РЛА) составляет 10^-3-10^-4 Lf/мл.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке диагностикума для обнаружения дифтерийного токсина с высокой чувствительностью, стабильностью свойств и высокой демонстративностью.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения диагностикума для обнаружения дифтерийного токсина, включающем отмывание полимерного носителя буферным раствором, иммобилизацию иммуноглобулина к дифтерийному токсину на частицах упомянутого носителя и последующую стабилизацию, в качестве носителя используют полимерный носитель, полученный методом анионной полимеризации мономера-акрилового альдегида в присутствии инициатора полимеризации - едкого натрия и представляющий окрашенные монодисперсные частицы сферической формы диаметром 2±0,5 мкм с реакционными альдегидными группами на поверхности частиц в количестве 1,3-1,6 мкмоль/г носителя, отмывают носитель 0,1 М карбонатным буферным раствором с рН 9,0-9,2, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут и иммобилизацию проводят суспензированием отмытого носителя в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,0-9,2 и добавлением к нему дифтерийного антитоксического иммуноглобулина, оставляют для контакта в течение 2-х часов при 20°С, охлаждают до 7°С и выдерживают 16-18 часов, стабилизацию проводят введением в суспензию 1% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия, оставляют при перемешивании при 20°С в течение 2-х часов, проводят лиофилизацию диагностикума, а обнаружение дифтерийного токсина осуществляют в реакции агломерации объемной.

Кроме того, лиофилизацию осуществляют путем введения в осадок диагностикума до (20-22) мл 3% желатозно-сахарозной среды, затем розливом в ампулы и последующим высушиванием при конечной температуре 22°С в течение суток.

Реакцию агломерации объемную осуществляют в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1,0% нормальной кроличьей сыворотки, 50 мкл взвеси исследуемой культуры и 25 мкл диагностикума с последующим перемешиванием в течение 1 минуты и контактированием при температуре (20-22)°С в течение 1,5-2 часов.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа необходим полимерный носитель, который в соответствии с регламентом производства (РП) №979-00 от 20.06.2000 г. получают методом анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида (акролина) в присутствии инициатора полимеризации - едкого натра. В результате синтеза получают монодисперсные частицы сферической формы одинакового диаметра в пределах от (2±0,5) мкм с реакционными альдегидными группами на поверхности сферических частиц (микросфер). Количество альдегидных групп составляет 1,3-1,6 мкмоль/г носителя и определяют их по специальной методике с помощью фотоэлектроколориметра по изменено оптической плотности. При этом на стадии полимеризации добавляют краситель - сафранин, который окрашивает микросферы в сиреневато-розовый цвет.

Пример получения диагностикума.

Первоначально 100 мг носителя помещают в центрифужный стакан и дважды отмывают 0,1 М карбонатным буферным раствором по 10 мл, рН 9,0-9,2 при (3000±100) об/мин в течение 10 минут. Отмытый носитель суспендируют в 1,5 мл 0,1 М карбонатного буферного раствора. Затем к суспензии микросфер для проведения иммобилизации добавляют 1,5 мл буферного раствора и 450 мкг/мл дифтерийного антитоксического иммуноглобулина и, перемешивая, оставляют для контакта в течение 2 часов при температуре 20°С, в результате альдегидные реакционные группы на поверхности частиц специфически взаимодействуют с аминогруппами белковых молекул дифтерийного иммуноглобулина.

После этого суспензию охлаждают до 7°С и выдерживают 16-18 часов.

Следующий этап получения диагностикума заключается в стабилизации полученной суспензии, для этого в нее добавляют 2 мл 1,0%-ного раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании в течение 2 часов при температуре 20°С.

В результате стабилизации желатоза позволяет блокировать реакционные группы на частицах, не связавшиеся с раствором специфического антитоксического иммуноглобулина в процессе иммобилизации.

Затем суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 минут, получая осадок.

Заключительным этапом в получении диагностикума является лиофилизация, при которой осадок препарата доводят до 20 мл 3%-ной желатозно-сахарозной средой высушивания, и разливают шприцем в ампулы по 1 мл. Лиофилизацию проводят в течение 23 часов при конечной температуре (22±2)°С.

Содержимое ампул замораживают спиртовым охлаждением при температуре (-45)°С в течение 10 минут. Замороженный диагностикум помещают в низкотемпературный шкаф при температуре (-50)°С и выдерживают в течение 17 часов, после чего ампулы с замороженным диагностикумом помещают в камеру вакуум-сушильного аппарата.

Методика постановки реакции

Пример 1

Исследование материала с плотной питательной среды в реакции агломерации объемной (РАО). Для проведения реакции предварительно проводят подготовку исследуемого материала, для этого патологический материал из ротоглотки, миндалин, носа, взятый сухим тампоном, засевают на чашку с кровяно-теллуритовым агаром, инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 часов, из подозрительных колоний готовят взвесь в пробирке добавлением 1-2 мл 0,9% раствора хлорида натрия.

Параллельно исследуют микробную взвесь контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии с концентрацией 10⁹ мк/мл. Для проведения РАО в лунки планшета для иммунологических реакций (см. таблицу 1) в ряды А, В, С, Д вносят по 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС). Затем в две первые лунки ряда А вносят пипеткой-дозатором по 50 мкл коммерческого дифтерийного анатоксина (в разведении 1:1000 или 0,3 Lf в 1 мл) и, начиная со второй лунки, титруют, т.е. делают последовательные двукратные разведения по 12 лунку. После этого переносят на ряд В и титруют до 11 лунки. В ряд С в первые две лунки вносят по 50 мкл микробной взвеси контрольного токсигенного штамма С. diphtheria mitis 1092 (tox⁺) (10⁹ мк/мл) и титруют двукратным шагом по 12^ю лунку.

Затем в 2 первые лунки ряда Д вносят по 50 мкл взвеси исследуемой культуры и титруют двукратно до 12^ой лунки.

После этого в каждую лунку (рядов А, В, С, Д) добавляют пипеткой по 1 капле (25 мкл) диагностикума.

Содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 минуты и оставляют при температуре (20-22)°С на 1,5-2 часа. Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агломерации в ряд В лунки 11-12 вносят только НКС и диагностический препарат.

За положительный результат (+) принимают цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунки равномерно. В отрицательных (-) случаях и в контроле образуется компактное колечко или «точка» в центре лунки.

Таким образом из таблицы 1 видно:

- ряд А - указывает на наличие дифтерийного токсина в пробе (+) (розовый агломерат);

- ряд В - до 7 лунки реакция положительна, а с 7 по 10 лунки указывают на отрицательный результат (розовые колечки);

- ряд С - 6 лунок положительны с контрольным штаммом (токсигенным) (+), а с 7 лунки (-), т.е. содержание токсина в контрольном токсигенном штамме соответствует 1,9×10^-4 Lf/мл;

- ряд Д - исследуемая культура с дифтерийным токсином подтверждается до 6 лунки (+), а с 6 лунки (-).

Чувствительность реакции с коммерческим дифтерийным анатоксином составляет 3×10^-6 Lf/мл (ряд В) - минимальная выявляемая концентрация анатоксина. Чувствительность с контрольным токсигенным штаммом С. diphtheria mitis 1092 составила 1,9×10^-4 Lf/мл (ряд С), т.е. содержание токсина в контрольном токсигенном штамме соответствует 1,9×10^-4 Lf/мл. Положительная реакция (РАО) с исследуемой культурой (ряд Д) свидетельствует о том, что культура токсигенная, а продукция токсина в культуре в количественном отношении соответствует 3,8×10^-4 Lf/мл (5 лунок).

Пример 2

Отличается от примера 1 тем, что исследуемый патологический материал засевают в жидкую питательную среду (бульон Хоттингера, теллурит калия, КРС) и через 18 часов инкубации в термостате при 37°С исследуют надосадочную жидкость среды культивирования (см. таблицу 2, ряд С). Ряды А и В - положительный контроль РАО с коммерческим дифтерийным анатоксином, как в примере 1. Ряд С - бульонная культура исследуемого возбудителя. Ряд Д - бульонная питательная среда без возбудителя - контроль среды культивирования.

Исходя из таблицы 2:

- ряд А - указывает на наличие дифтерийного токсина проба (+) - разовые агломераты;

- ряд В - с 7-10 лунки указывают на (-) отрицательный результат (розовые «колечки»);

- ряд С - указывают на наличие токсина в 6 лунках в разведении (1:64), чувствительность РАО с исследуемой культурой составила 1,9×10^-4 Lf/MA;

- ряд Д - отрицательные результаты, т.к. со средой культивирования без возбудителя диагностикум не реагирует.

Пример 3

Отличается от примера 1 тем, что в качестве исследуемой культуры используют дифтероиды, не продуцирующие токсин: С. xerosis 127 (ряд С) (см. таблицу 3), С. hofmanii «Алешин» (ряд Д). Ряды А и В положительный контроль РАО с коммерческим дифтерийным анатоксином.

Анализ реакции показал, что с дифтероидами, а именно С. xerosis 127 (ряд С) и С. hofmanii «Алешин» (ряд Д) наблюдается четкая отрицательная реакция РАО, так как дифтероиды не продуцируют дифтерийный токсин.

Исходя из приведенных примеров, можно сделать вывод, что разработанный специалистами Ростовского НИПЧИ диагностикум применяют для исследования культур, выращенных как на плотных, так и на жидких питательных средах, что обеспечивает более широкий спектр его использования в лабораторной диагностике дифтерии.

Кроме того, в примерах наблюдается специфичность диагностикума, так как отсутствуют перекрестные реакции с атоксигенными штаммами коринебакгерий близкородственными дифтероидами (С. xerosis, С. hofmanii).

Предлагаемый способ получения диагностикума позволяет ковалентно взаимодействовать реакционным альдегидным группам, находящимся на сферической поверхности частиц носителя, с аминогруппами белковых молекул дифтерийного иммуноглобулина, что обеспечивает диагностикуму высокую чувствительность (10^-5-10^-6 Lf/мл) и специфичность.

Диагностикум в лиофилизированном виде имеет стабильные свойства, так как в течение 4 лет сохраняет первичную активность.

Кроме того, полученный диагностикум экономичен, так как 1 ампулы достаточно для проведения 50 анализов, прост в постановке, не требует специальной подготовки медицинского персонала и отличается высокой воспроизводимостью и демонстративностью результатов реакции за счет яркой окраски.

Таблица 1
Ряды	Лунки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
В	+	+	+	+	+	+	±	-	-	-	К-	К-
С	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
Д	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-

Таблица 2
Ряды	Лунки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
В	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	К-	К-
С	+	+	+	+	+	+
Д	-	-	-	-	-	-	-

Таблица 3
Ряды	Лунки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
В	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	К-	К-
С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Д	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

1. Способ получения диагностикума для обнаружения дифтерийного токсина, включающий отмывание полимерного носителя буферным раствором, иммобилизацию иммуноглобулина к дифтерийному токсину на частицах упомянутого носителя и последующую стабилизацию, отличающийся тем, что в качестве носителя используют полимерный носитель, полученный методом анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида в присутствии инициатора полимеризации - едкого натрия и представляющий окрашенные монодисперсные частицы сферической формы диаметром 2±0,5 мкм с реакционными альдегидными группами на поверхности частиц в количестве 1,3-1,6 мкмоль/г носителя, отмывают носитель 0,1 М карбонатным буферным раствором с рН 9,0-9,2, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и иммобилизацию проводят суспензированием отмытого носителя в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,0-9,2, и добавлением к нему дифтерийного антитоксического иммуноглобулина, оставляют для контакта в течение 2 ч при 20°С, охлаждают до 7°С и выдерживают 16-18 ч, стабилизацию проводят введением в суспензию 1%-ного раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия, оставляют при перемешивании при 20°С в течение 2 ч, проводят лиофилизацию диагностикума, а обнаружение дифтерийного токсина осуществляют в реакции агломерации объемной.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофилизацию осуществляют путем введения в осадок диагностикума до (20-22) мл 3%-ной желатозо-сахарозной среды, затем розливом в ампулы и последующим высушиванием при конечной температуре 22°С в течение суток.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию агломерации объемную осуществляют в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, 50 мкл взвеси исследуемой культуры и 25 мкл диагностикума с последующим перемешиванием в течение 1 мин и контактированием при температуре (20-22)°С в течение 1,5-2 ч.