Инактивированная эмульсионная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц
Патент 2283137
Авторы
- Борисов Александр Владимирович (RU)
- Кузнецов Василий Никифорович (RU)
- Михалишина Зоя Яковлевна (RU)
- Смоленский Владимир Иванович (RU)
Правообладатели
Классы МПК
Инактивированная эмульсионная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц, инактивант димер этиленимина и масляный адъювант в эффективном соотношении. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером «К-58 №122-ДЕП». Штамм репродуцируется на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 5,25-7,0 lg ЭИД50/0,2см 3. Вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета, состоящую из инактивированного антигена вируса ИББ птиц, эмульгированного в масляном адъюванте. Вакцину применяют клинически здоровой птице в возрасте 110-120 суток. Препарат вводят в объеме 0,5 см3 однократно. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ птиц родительской стаи и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, безвредна. 7 з.п. ф-лы, 5 табл.
Реферат
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц.
ИББ птиц (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) - широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят, преимущественно в возрасте 15-80 суток, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. ИББ поражает, в основном, (3-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов.
ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания, и субклинически. Субклиническая форма имеет широкое распространение.
При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднение при постановке диагноза. Поэтому проведение лабораторных исследований имеет решающее значение при постановке диагноза заболевания.
ИББ птиц зарегистрирована во всех странах мира. В последние годы ИББ получила широкое распространение в большинстве крупных птицеводческих хозяйств России. Применение отечественных и импортных биопрепаратов в очагах инфекции не обеспечило ожидаемого эффекта. Это объясняется тем, что их применению не предшествовало изучение антигенных свойств циркулирующих изолятов вируса, не определялись специфические антитела птицы до и после вакцинации, а также уровень пассивного материнского иммунитета у цыплят. Не учитывалась известная особенность возбудителя ИББ - его антигенная изменчивость в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки и на разных территориях и зависящая от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса, и множество других факторов.
В связи с этим выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц должен проводиться с учетом антигенной структуры эпизоотического изолята и для приготовления вакцинных препаратов необходимо использовать производственные штаммы, обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ.
Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью до 20-70% поголовья цыплят при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также в результате возникновения вторичных инфекций, очень велик.
В настоящее время общепризнано, что единственно правильным и надежным направлением в борьбе с инфекцией является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики ИББ используют живые и инактивированные вакцины из гомологичных штаммов возбудителя инфекции, выращенных в различных чувствительных биологических системах.
В большинстве птицехозяйств цыплят прививают 2-кратно живыми вакцинами, а ревакцинируют в 16-20-недельном возрасте инактивированной вакциной. Это обусловлено тем, что при ИББ введение живых вакцин взрослой птице не формирует у нее напряженный иммунитет, что связано с ее возрастными особенностями. По этой причине для специфической профилактики ИББ у взрослой птицы широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные (1).
При изготовлении инактивированной вакцины используют вирулентные штаммы вируса ИББ птиц.
Известна инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма BIA 52/70, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали ткань фабрициевых сумок 30-40-суточных цыплят (2).
Известна инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма BIA 52/70, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали аллантоисные мембраны куриных эмбрионов (3).
Известна инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма D78, ATCC №VR-2041, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении.
В качестве чувствительной биологической системы использовали 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур (4).
Известна инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма GP/82, NCAIM №V(Р)-001033, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали 10-суточные эмбрионы SPF-кур (5).
Известна инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма BIA 52/70, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали ткань фабрициевых сумок SPF-цыплят 30-40-суточного возраста (6).
Основной недостаток известных вакцин состоит том, что они являются импортными препаратами и не обеспечивают удовлетворительной защиты против вируса ИББ, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации.
Известна также инактивированная сорбированная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «БГ» №102-ДЕП», полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и адъюванты гидроокись алюминия и сапонин в эффективном соотношении.
В качестве чувствительной биологической системы использовали 10-суточные эмбрионы SPF-кур (7).
Недостаток данной вакцины состоит в ее низкой антигенной и иммуногенной активности.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма D78, АТСС №VR-2041, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении. В качестве чувствительной биологической системы использовали 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур (4).
Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной эмульсионной вакцины на основе нового штамма вируса ИББ птиц, обладающего более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью в нативном виде и после инактивации.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и имуногенной активности и безвредности предлагаемой вакцины.
Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
1. Инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц.
2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, в эффективном количестве.
3. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц.
4. В качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур.
5. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации.
6. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 29,9-49,7 мас.%.
7. Инактивант.
7.1. Из активантов димер этиленимина (ДЭИ).
7.2. ДЭИ в виде 15% водного раствора.
7.3. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.
8. Масляный адъювант.
8.1. Из масляных адъювантов масляный адъювант ВНИИЗЖ.
8.2. Масляный адъювант ВНИИЗЖ в количестве 50,0-70,0 мас.%.
8.3. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70.
8.4. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 50,0-70,0 мас.%.
8.5. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-206.
8.6. Масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве 50,0-70,0 мас.%.
9. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивантДЭИ и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
| Антигенный материал | 29,9-49,7 |
| ДЭИ | 0,1-0,3 |
| Масляный адъювант | 50,0-70,0 |
Предлагаемое изобретение содержит следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.
1. Инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц.
2. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации в эффективном количестве.
3. Инактивант.
4. Масляный адъювант.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.
1. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,2 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации.
2. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 29,9-49,7 мас.%.
3. Из инактивантов ДЭИ.
4. ДЭИ в виде 15% водного раствора.
5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.
6. Из масляных адъювантов масляный адъювант ВНИИЗЖ.
7. Масляный адъювант ВНИИЗЖ в количестве 50,0-70,0 мас.%.
8. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70.
9. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 50,0-70,0 мас.%.
10. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-206.
11. Масляный адъювант Montanide-206 в количестве 50,0-70,0 мас.%.
12. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
| Антигенный материал | 29,9-49,7 |
| ДЭИ | 0,1-0,3 |
| Масляный адъювант | 50,0-70,0 |
Признаки изобретения, характеризующие предлагаемую вакцину и совпадающие с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение:
1. Инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц.
2. Антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации.
3. Инактивант.
4. Масляный адъювант.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что она содержит эффективное количество антигенного материала из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования
1. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации.
2. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 29,9-49,7 мас.%.
3. Из инактивантов ДЭИ.
4. ДЭИ в виде 15% водного раствора.
5. ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.
6. Масляный адъювант в количестве 50,0-70,0 мас.%.
7. Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 Ig ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
| Антигенный материал | 29,9-49,7 |
| ДЭИ | 0,1-0,3 |
| Масляный адъювант | 50,0-70,0 |
По сравнению с вакциной-прототипом инактивированная эмульсионная вакцина на основе штамма «К-58 №122-ДЕП» обладает более высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной.
Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что в ее состав введен вирусный материал из нового аттенуированного штамма «К-58 №122-ДЕП», гомологичного возбудителю инфекции и не вызывающего иммуносупрессии у привитой птицы.
Исходный вирус (авторское наименование изолята «К-58») для получения штамма «К-58 №122-ДЕП» выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров на птицефабрике «Васильевская» Пензенской области в 1994 году. Вакцинный штамм «К-58 №122-ДЕП» получен путем многократных последовательных пассажей исходного изолята на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур и SPF-цыплятах.
Штамм «К-58» депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером - штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц.
Штамм «К-58 №122-ДЕП» не вызывает иммунодепрессии и обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц.
Штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц относится к семейству Birnavindae, роду Avibirnavirus, серотипу I и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона икосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид Т13, оболочка отсутствует.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм «К-58 №122-ДЕП» относится к сероварианту I. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых РДП в разведении 1:4-1:64, в ИФА - 1:400-1:10000 и более, при гипериммуннизации в РДП до 1:4096 и выше, в ИФА>1:10000. Для определения генотаксономической гомологии вакцинного штамма «К-58 №122-ДЕП» и полевых изолятов вируса ИББ сравнили вариабельные области VP2 полевых изолятов (37 образцов, выделенных в 1993-1996 гг. на территории РФ и странах СНГ) и вакцинных штаммов (7 образцов коммерческих живых вакцин). Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакцинного штамма ИББ. Установлено, что большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм «Рон-Мерье» (Франция), «Интервет» (Голландия), «Солвей-Дюфар» (США), «Сафит» (Израиль) на 5-8% и имеют структуру, близкую к вакцинному штамму «К-58 №122-ДЕП».
Биотехнологические характеристики
Штамм «К-58 №122-ДЕП» предназначен для изготовления живой и инактивированной вакцин и диагностических биопрепаратов. Штамм «К-58 №122-ДЕП» репродуцируется в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур при температуре 37,7°С и влажности 55-64%. В течение 72-96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,25-7,0 lg ЭИД50/2,0см 3.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм «К-58 №122-ДЕП» является РНК-содержащим вирусом с мол. массой РНК 2,16×106 Da. Нуклеотидная кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирус имеет белковую оболочку, образованную 5 видами белков (VP1, VP2, VP3, VP4 И VP5):
VP1 - РНК-зависимая РНК-полимераза;
VP2, VP3 - структурные белки;
VP4 - протеаза;
VP5 - не идентифицирован.
Липиды отсутствуют.
Штамм «К-58 №122-ДЕП» проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в области РНК, кодирующей VP2. Мутации, ведущие к замене аминокислот, определяют антигенную вариабельность VP2.
Штамм «К-58 №122-ДЕП» проявляет высокую степень гомологии (98%) по сравнению с многочисленной группой изолятов (30), выделенных на территории РФ в 1993-1996 гг.
Физические свойства
Масса вириона составляет 55,0×106 Da. Коэффициент седиментации 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33-1,34 г/см3 в градиенте CsCl. Устойчивость к внешним факторам
Штамм «К-58 №122-ДЕП» устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению и высыханию.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность -100%.
Реактогенность - отсутствует.
Патогенность - отсутствует.
Вирулентность - отсутствует.
Онкогенность - отсутствует.
Контагиозность - отсутствует.
Штамм «К-58 №122-ДЕП» является стабильным и не вызывает иммуносупрессии.
По безопасности и иммуногенности штамм «К-58 №122-ДЕП» полностью отвечает требованиям О.I.E. (МЭБ).
Комиссионные испытания подтвердили полное соответствие штамма «К-58 №122-ДЕП» предъявляемым требованиям и явились основанием для его депонирования во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) МСХ РФ 1 июня 2004 года под регистрационным номером штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц.
На основании приведенных сведений можно утверждать, что штамм «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц по антигенному и иммуногенному спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса птиц.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».
Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Матровую расплодку вируса штамма «К-58 №122-ДЕП» в эмбрионах SPF-кур получают следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки (ХАО) делают насечку, не повреждая ХАО, и затем с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в количестве 0,2 см3 на ХАО. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С. Вирусосдержащий материал размораживают, измельчают, экстрагируют при температуре 4°С в течение 45 минут, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5, центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Полученную вируссодержащую жидкость с инфекционной активностью 5,25-7,0 Ig ЭИД50/0,2см 3 используют в качестве матровой расплодки.
Пример 2
На первом этапе готовят матровой материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц так, как описано в примере 1. Полученную вируссодержащую жидкость используют для массового заражения 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур. Вирусный материал в количестве 0,2 см3 вводят на ХАО и инкубируют при температуре 37,7°С в течение 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при температуре минус 40°С и полученное сырье используют для изготовления вакцины. Вируссодержащий материал размораживают, измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют в течение 45 минут при температуре 4°С, дважды промораживают - оттаивают, добавляют фосфатный буфер рН 7,5 и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин, очищая его таким образом от балластных примесей. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор для инактивации вируса. Из инактивантов используют ДЭИ в виде 15% водного раствора, рН 7,9-8,0. В подогретую до 27°С вируссодержащую суспензию с инфекционной активностью 5,25-7,0 Ig ЭИД50/0,3см 3 вносят ДЭИ в количестве, соответствующем его 0,1-0,3, мас.% содержанию в готовом препарате. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 27°С в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С. Полученный антиген смешивают с масляным адъювантом, который берут в количестве, соответствующем его 50,0-70,0 мас.% содержанию в готовом препарате. Из масляных адъювантов можно использовать масляный адъювант ВНИИЗЖ (пат. РФ №2108111; А 61 К 39/39, А 61 К 39/00, А 61 К 39/102, А 61 К 39/12, А 61 К 39/135; 10.04.98г.), а также масляные адъюванты марок Montanide ISA-70 и Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета. Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность и фасуют в стерильные флаконы.
Авирулентность препарата определяют методом трехкратных «слепых» пассажей вакцины на 10-суточных эмбрионах SPF-кур.
Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89.
Безвредность препарата определяют путем введения 10-кратной иммунизирующей дозы (5,0 см3) полученной вакцины 100-110-суточным цыплятам.
Иммуногенную активность препарата определяют путем внутримышечного введения 0,5 см3 полученной вакцины 30-40-суточным цыплятам.
Стабильность вакцины определяют путем выдерживания образцов вакцины в термостате при температуре 37°С в течение месяца и сравнивают с исходными образцами. Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Птиц вакцинируют в возрасте 110-120 суток однократно. Препарат вводят внутримышечно в объеме 0,5 см3.
Иммунитет у вакцинированной птицы наступает на 21 сутки после вакцинации и сохраняется до 12 месяцев. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против ИББ у птиц родительской стаи и обеспечивает надежный пассивный иммунитет у молодняка до 15-25-дневного возраста, что позволяет защитить его от полевого вирулентного вируса ИББ в ранний период жизни.
Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав (мас.%), представленный в таблице 1.
Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.
Пример 3
Определена иммуногенная активность инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
| Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |
| вируса ИББ птиц, полученный в 10-суточных эмбрионах | |
| SPF-кур с инфекционной активностью 5,25 Ig ЭИД50/0,2см3 | |
| и подвергнутый инактивации | 29,9 |
| ДЭИ | 0,1 |
| Масляный адъювант | 70,0 |
Иммуногенную активность определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 см3. Через 21 сутки у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц.
Пример 4
Определена иммуногенная активность инактивированой эмульсионной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
| Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |
| вируса ИББ птиц, полученный в 10-суточных эмбрионах | |
| SPF-кур с инфекционной активностью 6,0 Ig ЭИД50/0,2см3 | |
| и подвергнутый инактивации | 39,8 |
| ДЭИ | 0,2 |
| Масляный адъювант | 60,0 |
Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили по 0,5 см3 в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител против ИББ. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58№122-ДЕП».
Пример 5
Определена иммуногенная активность инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:
| Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |
| вируса ИББ птиц, полученный в 10-суточных эмбрионах | |
| SPF-кур с инфекционной активностью 6,0 Ig ЭИД50/0,2см3 | |
| и подвергнутый инактивации | 49,7 |
| ДЭИ | 0,3 |
| Масляный адъювант | 50,0 |
Иммуногенную активность определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 см3. Через 21 сутки у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58 №122-ДЕП».
Пример 6
Проведена сравнительная оценка иммуногенной активности вакцины-прототипа и инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, содержащей, мас.%:
| Антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |
| вируса ИББ птиц, полученный в 10-суточных эмбрионах | |
| SPF-кур с инфекционной активностью 6,5 Ig ЭИД50/0,2см3 | |
| и подвергнутый инактивации | 39,8 |
| ДЭИ | 0,2 |
| Масляный адъювант | 60,0 |
Иммуногенную активность вакцин определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ птиц. Вакцины вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 см3. Через 21 сутки у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в РДП и ИФА на наличие антител.
Результаты исследований представлены в таблице 5.
Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ, изготовленная из аттенуированного штамма «К-58 №122-ДЕП», значительно превосходит вакцину против ИББ (титр антител выше в 1,88 раза), изготовленную из штамма D78, АТСС №VR-2041, и обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 15-25-суточного возраста, что позволяет защитить его от заболевания ИББ в ранний период жизни.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ птиц, приготовленная из штамма «К-58 №122-ДЕП» в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью, является безвредной и стабильной при хранении. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
Источники информации, принятые во внимание
1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998, 64-84.
2. Wyeth P.J. The veterinary Record,1979, 104, 188-193.
3. Lucia B.e.a. Avian Diseases. 1979, 23, 2, 466-478.
4. Пат. США №4530831, 425-89, 23.07.85 г.
5. Пат. Венгрии №203781; С 12 N 7/00 А 61 К 39/12; 28.08.90 г.
6. Пат. Румынии №100319, А 61 К 39/12, 29.10.90 г.
7. Пат РФ №2127603; А 61 К 39/12, C 12 N 7/00; 20.03.99 г.
8. Пат. США №4530831, 425-89, 23.07.85 г. (прототип).
| Таблица 1Оптимальный компонентный состав (мас.%) инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц, изготовленной на основе штамма «К-58 №122-ДЕП» | |||
| Ингредиенты | Минимум | Средний | Максимум |
| Антигенный материал | 29,9 | 39,8 | 49,7 |
| ДЭИ | 0,1 | 0,2 | 0,3 |
| Масляный адъювант | 70,0 | 60,0 | 50,0 |
| Таблица 2Определение иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |||
| №№ п/п | Наименование материала | Титр антител | |
| РДП | ИФА | ||
| 1 | Сыворотка вакцинированных птиц | 1:16 | 1:4850 |
| 2 | -«- | 1:32 | 1:5200 |
| 3 | --«- | 1:64 | 1:5500 |
| 4 | -«- | 1:64 | 1:5850 |
| 5 | -«- | 1:64 | 1:7200 |
| 6 | -«- | 1:64 | 1:7370 |
| 7 | -«- | 1:64 | 1:7600 |
| 8 | -«- | 1:64 | 1:8100 |
| 9 | -«- | 1:64 | 1:8500 |
| 10 | -«- | 1:128 | 1:9220 |
| Таблица 3Определение иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |||
| №№ п/п | Наименование материала | Титр антител | |
| РДП | ИФА | ||
| 1 | Сыворотка вакцинированных птиц | 1:32 | 1:4500 |
| 2 | -«- | 1:32 | 1:4800 |
| 3 | -«- | 1:64 | 1:5000 |
| 4 | -«- | 1:64 | 1:6200 |
| 5 | -«- | 1:64 | 1:6800 |
| 6 | -«- | 1:64 | 1:7200 |
| 7 | -«- | 1:64 | 1:7550 |
| 8 | -«- | 1:128 | 1:8000 |
| 9 | -«- | 1:128 | 1:8500 |
| 10 | -«- | 1:128 | 1:9800 |
| Таблица 4Определение иммуногенной активности «Инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58 №122-ДЕП» | |||
| №№ п/п | Наименование материала | Титр антител | |
| РДП | ИФА | ||
| 1 | Сыворотка вакцинированных птиц | 1 32 | 1:5500 |
| 2 | -«- | 1:32 | 1:5100 |
| 3 | -«- | 1:32 | 1:5650 |
| 4 | -«- | 1:64 | 1:6800 |
| 5 | -«- | 1:64 | 1:7200 |
| 6 | -«- | 1:64 | 1:7420 |
| 7 | -«- | 1:64 | 1:8550 |
| 8 | -«- | 1:256 | 1:9100 |
| 9 | -«- | 1:256 | 1:9210 |
| 10 | -«- | 1:256 | 1:10520 |
| Таблица 5Сравнительная оценка иммуногенной активности инактивированных эмульсионных вакцин из штамма D 78 и штамма «К-58 №122-ДЕП» | |||
| № п/п | Наименование штаммов | ||
| D78 | «К-58 №122-ДЕП» | ||
| Титр антител | Титр антител | ||
| 1 | 1:1600 | 1:2700 | |
| 2 | 1:1750 | 1:3320 | |
| 3 | 1:2050 | 1:4000 | |
| 4 | 1:3500 | 1:4360 | |
| 5 | 1:3200 | 1:4800 | |
| 6 | 1:2500 | 1:5850 | |
| 7 | 1:1800 | 1:5950 | |
| 8 | 1:4200 | 1:5500 | |
| 9 | 1:2000 | 1:6480 | |
| 10 | 1:2880 | 1:5020 | |
| Средний | 1:2548 | 1:4798 |
1. Инактивированная эмульсионная вакцина против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц, содержащая антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма, полученный в чувствительной биологической системе и подвергнутый инактивации, инактивант и масляный адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигенного материала она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц (Bursitis infectiosa gallinae), семейства Birnaviridae, рода Avibirnavirus, серотипа 1, коллекция ФГУ ВГНКИ «К-58 №122-ДЕП», в эффективном количестве.
2. Инактивированная эмульсионная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации.
3. Инактивированная эмульсионная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/2,0см 3 и подвергнутый инактивации, в количестве 29,9-49,7 мас.%.
4. Инактивированная эмульсионная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из инактивантов она содержит димер этиленимина (ДЭИ).
5. Инактивированная эмульсионная вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит ДЭИ в виде 15%-ного водного раствора.
6. Инактивированная эмульсионная вакцина по п.5, отличающаяся тем, что она содержит ДЭИ в количестве 0,1-0,3 мас.%.
7. Инактивированная эмульсионная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит масляный адъювант в количестве 50,0-70,0 мас.%.
8. Инактивированная эмульсионная вакцина по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что содержит антигенный материал из штамма «К-58 №122-ДЕП» вируса ИББ птиц, полученный в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 5,25 lg ЭИД50/0,2см 3 и подвергнутый инактивации, инактивант ДЭИ и масляный адъювант в соотношении, мас.%:
| Антигенный материал | 29,4-47,7 |
| ДЭИ | 0,1-0,3 |
| Масляный адъювант | 50,0-70,0 |