Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы

Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот путем ферментации пентоз и более конкретно к способу получения L-аминокислот с использованием бактерии с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы путем ферментации смеси арабинозы и/или ксилозы с глюкозой в качестве источника углерода. Недорогой источник углерода, представляющий собой смесь гексоз и пентоз из гемицеллюлозной фракции целлюлозной биомассы, может быть использована для промышленного производства L-аминокислот, например L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты получают промышленным способом с помощью ферментации штаммов различных микроорганизмов. Используемая при этом ферментационная среда обычно содержит достаточное количество различных источников углерода и азота.

Общепринятыми источниками углерода являются различные углеводы, такие как гексозы, пентозы, триозы; различные органические кислоты и спирты. К гексозам относятся глюкоза, фруктоза, манноза, сорбоза, галактоза и подобные им. Пентозы включают в себя арабинозу, ксилозу, рибозу и подобные им. Тем не менее, вышеупомянутые углеводы и другие традиционные источники углерода, такие как меласса, зерно, сахарный тростник, крахмал, их гидролизаты, и т.д., используемые в современной промышленности, достаточно дороги. Таким образом, необходим альтернативный более дешевый вариант источника углерода для получения L-аминокислот.

Целлюлозная биомасса является перспективным субстратом для продукции L-аминокислот благодаря как своей готовности к применению, так и дешевизне по сравнению с чистыми углеводами, зерном, сахарным тростником или другими источниками углерода. Среднее содержание целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина в целлюлозной биомассе составляет примерно 40-60% целлюлозы, 20-40% гемицеллюлозы 10-25% лигнина и 10% других соединений. Целлюлозная фракция состоит из полимеров гексозных сахаров, обычно глюкозы. Гемицеллюлозная фракция состоит в основном из пентозных сахаров, включая ксилозу и арабинозу. Состав различных сырьевых биомасс приведен в Таблице 1 (http://www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html).

Таблица 1.
Исходный	Шестиуглеродные	Пятиуглеродные	Лигнин	Зольный
материал	сахара	сахара		остаток
Твердая	39-50%	18-28%	15-28%	0.3-1.0%
древесина
Мягкая	41-57%	8-12%	24-27%	0.1-0.4%
древесина

Более детальную информацию о составе более 150 образцов биомассы можно получить в сводной таблице "Biomass Feedstock Composition and Property Database" (http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/searchl.cgi).

В ближайшем будущем ожидается разработка промышленного процесса для эффективной конверсии целлюлозной биомассы в готовый к применению компонент ферментационной среды - как правило, это смесь углеводородов. Следовательно, вскоре ожидается также увеличение масштаба использования возобновляемых источников энергии, таких как целлюлоза и гемицеллюлоза, для продукции полезных веществ (Aristidou A., Pentila. M., Curr. Opin. Biotechnol, 2000, Apr., 11:2, 187-198). Тем не менее, подавляющее большинство опубликованных статей и патентов или патентных заявок описывают утилизацию целлюлозной биомассы с помощью биокатализа (бактерии и дрожжи) для получения этанола, который в перспективе должен стать альтернативным топливом. Такие процессы включают в себя ферментацию целлюлозной биомассы с использованием различных модифицированных штаммов Zymomonas mobilis (Deanda К. et al., Appl. Environ. MicrobioL, 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100:885-98; Lawford H.G., Rousseau J.D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100:429-48; PCT applications WO 95/28476, WO 98/50524), модифицированных штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56:1-2, 120-5; патент США 5000000). В качестве продукта ферментации ксилозы из гемицеллюлозных сахаров с помощью дрожжей Candida tropicalis может быть получен ксилитол (Walthers Т. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93:423-35). 1,2-Пропандиол может быть получен путем ферментации арабинозы, фруктозы, галактозы, глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, ксилозы и их комбинаций с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli (патент США 6303352). Также было показано, что 3-дегидрошикимовая кислота может быть получена путем ферментации глюкозо/ксилозо/арабинозной смеси с использованием штамма Escherichia coli. Максимальные концентрации и конверсии 3-дегидрошикимовой кислоты были получены в опыте, когда в качестве источника углерода использовали глюкозо/ксилозо/арабинозную смесь, по сравнению с использованными в том же качестве чистых ксилозы или глюкозы (Kai Li and J.W.Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883).

Также было показано, что Escherichia coli способна утилизировать пентозы, такие как L-арабиноза и D-ксилоза (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Транспорт L-арабинозы в клетку осуществляется двумя индуцируемыми системами: (1) пермеазой с низким сродством к субстрату (K_m около 0.1 мМ), кодируемой геном araE, и (2) системой с высоким сродством к арабинозе (К_m от 1 до 3 μM), кодируемой опероном araFG, Ген araF кодирует периплазматический связывающий белок (306 аминокислот) с функцией хемотактического рецептора, а локус araG кодирует белок, расположенный на внутренней стороне клеточной мембраны. Сахар утилизируется группой ферментов, кодируемых опероном araBAD: изомеразой (кодируемой геном araA), которая обратимо превращает альдозу в L-рибулозу; киназой (кодируемой геном araB), которая фосфорилирует кетозу, образуя L-рибулозо 5-фосфат; и L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразой (кодируемой геном araD), которая катализирует образование D-ксилозо-5-фосфата (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Большинство штаммов Е.coli растет на D-ксилозе, но штамм К-12 без мутации не способен расти на этом сахаре. Утилизация этой пентозы происходит через индуцируемый и регулируемый также катаболитной репрессией путь, включающий в себя транспорт через плазматическую мембрану двумя индуцируемыми пермеазами (неактивными при росте на D-рибозе или D-арабинозе), изомеризацию в D-ксилулозу, и АТФ-зависимое фосфорилирование этой пентулозы с образованием D-ксилулозо 5-фосфата. Транспортная система с высоким сродством к субстрарту (K_m 0.3 до 3 μM) зависит от связывающего белка, расположенного в периплазме (37000 Da) и, возможно, запускается высокоэнергетическим веществом. Транспортная система с низким сродством к субстрарту (К_m около 170 μМ) получает энергию за счет энергии переноса протона. Эта система симпорта D-ксилозы-протона кодируется геном xylE. Основным кластером генов, определяющим утилизацию D-ксилозы, является оперон xylAB(RT). Ген xylA кодирует изомеразу (54000 Da) и ген xylE кодирует киназу (52000 Da). Оперон имеет две точки начала транскрипции, одна из которых расположена перед открытой рамкой считывания xylB. Поскольку пермеаза с низким сродством к субстрату кодируется не входящим в оперон геном xylE, то локус xylT, также обозначаемый как xylF (xylFGHR), возможно, кодирует транспортную систему с высоким сродством к субстрату и, таким образом, должен состоять как минимум из двух генов (один, кодирующий периплазматический белок, и другой, кодирующий мембранный белок) (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Гены xylFGH кодируют АВС транспортеры ксилозы, при этом ген xylF кодирует гипотетический ксилозосвязывающий белок, ген xylG кодирует гипотетический АТФ-связывающий белок, ген xylH кодирует гипотетический мембранный компонент, и ген xylR кодирует ксилозный транскрипционный активатор.

Введение вышеупомянутых генов Е.coli, кодирующих L-арабинозоизомеразу, L-рибулокиназу, L-рибулозо 5-фосфат 4-эпимеразу, ксилозоизомеразу и ксилулокиназу в дополнение к трансальдолазе и транскетолазе в микроорганизм, такой как Zymomonas mobilis, позволяют этому микроорганизму перерабатывать арабинозу и ксилозу в этанол (WO/9528476, WO 98/50524). И, наоборот, гены Zymomonas, кодирующие алкогольдегидрогеназу (ADH) и пируватдекарбоксилазу (PDH), повышают продукцию этанола у штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; патент США 5000000).

Процесс получения L-аминокислот, таких как L-изолейцин, L-гистидин, L-треонин и L-триптофан, с помощью ферментации на смеси глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза, был уже раскрыт ранее авторами настоящего изобретения (патентная заявка России 2003105269).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих бактерии с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы, таких как локус xylABFGHR, или описывающих использование этих генов для получения L-аминокислот из смеси сахаров - гексоз и пентоз.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является повышение продукции штамма-продуцента L-аминокислоты, предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы и предоставление способа получения L-аминокислот из смеси сахаров - гексоз, таких как глюкоза, и пентоз, таких как ксилоза или арабиноза, с использованием вышеупомянутой бактерии. Продукт переработки целлюлозной биомассы может быть использован как компонент ферментационной среды в качестве источника углерода. Данная цель была достигнута путем обнаружения того факта, что локус xylABFGHR, клонированный на низкокопийном векторе, повышает продукцию L-аминокислот, например L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана. Для этой цели использовался микроорганизм, способный расти на продукте переработки целлюлозной биомассы и являющийся продуцентом L-аминокислот. Продукт переработки целлюлозной биомассы состоит из ксилозы и арабинозы в смеси с глюкозой и служит источником углерода. Штаммы - продуценты L-аминокислоты представлены штаммом Escherichia coli. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты, при этом указанная бактерия принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и обладает повышенной активностью любого из ферментов, участвующих в утилизации ксилозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активности ферментов, утилизирующих ксилозу, повышены за счет усиления экспрессии локуса xylABFGHR.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активности ферментов, утилизирующих ксилозу, повышены путем увеличения количества копий локуса xylABFGHR или модификации нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию этих генов таким образом, что экспрессия указанных генов усиливается.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой количество копий указанных генов в клетке увеличено за счет трансформации бактерии низкокопийным вектором, содержащим локус xylABFGHR.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой локус xylABFGHR получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции L-аминокислот, включающего в себя выращивание описанной выше бактерии в культуральной жидкости, содержащей смесь сахаров - глюкозы и пентоз, и выделение из культуральной жидкости накопленной в ней L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором пентозами являются арабиноза и ксилоза.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанная смесь сахаров является продуктом переработки целлюлозной биомассы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-гистидин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-гистидина усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-треонин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-треонина усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-лизин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-лизина усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-аргинин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-аргинин усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-глутаминовой кислоты усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-триптофан.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-триптофана усилена.

Указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-гистидина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-треонина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-лизина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-аргинина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-триптофана с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Указанная смесь сахаров - глюкозы и пентоз, используемая как компонент ферментационной среды, может быть получена из продуктов переработки растительной биомассы, таких как целлюлозная биомасса, предпочтительно гидролизат целлюлозы.

Краткое описание рисунков

На чертеже изображена структрура локуса xylABFGHR на хромосоме штамма Е.coli MG1655. Стрелки на диаграмме указывают позиции праймеров, использованных для ПЦР.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Согласно настоящему изобретению "бактерия - продуцент L-аминокислоты" означает бактерию, обладающую способностью к накоплению этой L-аминокислоты в питательной среде в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в питательной среде в количествах, больших, чем природный или родительский штамм, и, предпочтительно, означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в ферментационной среде целевую L-аминокислоту в концентрациях не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно - не менее 1.0 г/л.

Термин «L-аминокислоты» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, Erwinia, Pantoea, Providencia и Serratia. Роды Escherichia и Pantoea предпочтителены.

Термин «обладает повышенной активностью ферментов утилизации ксилозы» означает то, что удельная активность становится выше, чем у немодифицированного штамма, например природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул фермента в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы фермента увеличена и так далее. Количество белка, кодируемого геном, может быть измерено известными методами, включающими SDS-электрофорез в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом (Western blotting analysis). Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности ферментов утилизации ксилозы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.

"Ферменты утилизации ксилозы" включают в себя белки транспорта ксилозы, ферменты, катализирующие изомеризацию и фосфорилирование ксилозы, а также регуляторные белки. Более конкретно эти ферменты включают в себя ксилозоизомеразу, ксилулокиназу, транспортеры ксилозы и ксилозный транскрипционный активатор. Ксилозоизомераза катализирует реакцию изомеризации D-ксилозы в D-ксилулозу. Ксилулокиназа катализирует реакцию фосфорилирования D-ксилулозы с использованием АТФ, в результате чего образуется D-ксилулозо-5-фосфат и АДФ. Доказательством наличия активности ферментов утилизации ксилозы в клетке, таких как ксилозоизомераза, ксилулокиназа, определяется комплементацией соответствующих мутантов Е.coli, дефективных по ксилозоизомеразе или ксилулокиназе соответственно.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia», означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Термин «увеличение экспрессируемого количества гена(ов)» означает, что экспрессируемое количество гена(ов) в клетке выше, чем количество этих генов в немодифицированном штамме, например природном. Примерами таких модификаций могут являться: увеличение количества экспрессируемых гена(ов) в пересчете на клетку, повышение уровня экспрессии этого(их) гена(ов) и так далее. Количество копий экспрессируемого гена измеряют, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК и последующей гибридизацией по Саузерну, при этом используется зонд, синтезированный на основе последовательности указанного гена, флюоресцентной гибридизацией in situ (FISH) и подобными им. Уровень экспрессии гена может быть измерен с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественный ПЦР с обратной транскрипцией и подобные им. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности ферментов утилизации ксилозы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.

Увеличение активности в клетке бактерии может быть достигнуто путем увеличения уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты утилизации ксилозы. Гены утилизации ксилозы могут включать в себя любые гены, выделенные как из бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, так и из других бактерий, таких как коринеформные бактерии. Гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, предпочтительны.

Ген, кодирующий ксилозоизомеразу из Е.coli (ЕС номер 5.3.1.5), известен и получил название xylA (номера нуклеотидов с 3727072 по 3728394 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131436). Ген, кодирующий ксилулокиназу (ЕС номер 2.7.1.17) известен и получил название xylB (номера нуклеотидов с 3725546 по 3727000 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131435). Ген, кодирующий белок транспортной системы, связывающий ксилозу, известен и получил название xylF (номера нуклеотидов с 3728760 по 3729752 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131437). Ген, кодирующий гипотетический АТФ-связывающий белок транспортной системы ксилозы, известен и получил название xylG (номера нуклеотидов с 3729830 по 3731371 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131438). Ген, кодирующий пермеазную составляющую транспортной системы ксилозы АВС-типа, известен и получил название xylH (номера нуклеотидов с 3731349 по 3732530 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131439). Ген, кодирующий регулятор транскрипции xyl оперона известен и получил название xylR (номера нуклеотидов с 3732608 по 3733786 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131440). Таким образом, все вышеупомянутые гены могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; refer to White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), используя праймеры, синтезированные на основе нуклеотидных последовательностей этих генов.

Гены, кодирующие ферменты утилизации ксилозы у других микроорганизмов, могут быть получены аналогичным способом.

Ген xylA из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (А) или (В):

(A) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2); или

(B) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2), который обладает активностью ксилозоизомеразы.

Ген xylB из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (С) или (D):

(C) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO: 4); или

(D) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO: 4), который обладает активностью ксилулокиназы.

Ген xylF из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (Е) или (F):

(Е) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID N: 6); или

(F) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID NO: 6), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylGHR.

Ген xylG из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (G) или (Н):

(G) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO: 8); или

(Н) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO: 8), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFHR.

Ген xylH из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (I) или (J):

(I) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO: 10); или

(J) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO: 10), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFGR.

Ген xylR из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (К) или (L):

(К) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO: 12); или

(L) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO: 12), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-амминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFGH.

ДНК, кодирующая ксилозоизомеразу, включает в себя ДНК, кодирующую белок, содержащий делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одной или нескольких положениях в белке (А) при условии, что указанный белок не теряет своей активности. Несмотря на то что количество «нескольких» аминокислот может быть различным в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре указанного белка, это количество может варьировать от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 20, и, более предпочтительно от 2 до 10 аминокислотных остатков для белка (А). Этот объясняется тем фактом, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и замена таких аминокислот не оказывает существенного влияния на трехмерную структуру белка и его активность. Таким образом, белок (В) может иметь гомологию, не меньшую, чем от 30 до 50%, предпочтительно от 50 до 70%, более предпочтительно от 70 до 90% и наиболее предпочтительно - более 90%, по отношению к общему количеству аминокислотных остатков, входящих в состав ксилозоизомеразы, и обладающий активностью ксилозоизомеразы. Те же критерии и степень гомологии могут быть применены к остальным белкам (С), (Е), (G), (I) и (К).

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). Способ поиска FASTA описан W.R.Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).

ДНК, кодирующая практически такие же белки, как белок, описанный в пункте (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей белок, описанный в пункте (А), например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков могут быть делегированы, заменены, вставлены или добавлены. ДНК, модифицированная, как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработками с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ излучения или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая ксилозоизомеразу, включает также ДНК, которая может быть получена из различных штаммов бактерий, принадлежащих к роду Escherichia ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая такие белки, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется геном xylA или его частью в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью ксилозоизомеразы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга и, как правило, рекомендована изготовителем. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном xylA, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO: 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO: 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером SEQ ID NO: 1, в качестве матрицы. В случае когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°, 2×SSC и 0.1% SDS.

ДНК, кодирующие практически такие же белки, как другие белки утилизации ксилозы, могут быть получены с применением методик, аналогичных тем, которые применяли для получения ксилозоизомеразы, как описано выше.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами для увеличения экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.

Бактерия согласно настоящему изобретению также включает в себя бактерию, в которой активность белка согласно настоящему изобретению повышена благодаря трансформации указанной бактерии ДНК, кодирующей такой же белок, как описанный в пунктах (А) или (В), (С) или (D), (Е) или (F), (G) или (Н), (I) или (J), и (К) или (L), или благодаря усилению последовательности, регулирующей экспрессию вышеупомянутой ДНК на хромосоме указанной бактерии.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы векторы разной копийности. Более предпочтительно использование низкокопийных векторов. Примерами низкокопийных векторов являются pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Термин "низкокопийный вектор" используется для обозначения векторов, количество копий которых на клетку не превышает 5. Способы трансформации включают в себя все возможные способы, известные специалисту в данной области. Например, может быть использован способ обработки клеток-реципиентов хлоридом кальция для повышения проницаемости клеточных стенок для ДНК, опубликованный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol, 53, 159 (1970)).

Кроме того, усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения нескольких копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграцией или подобными им. К примеру, один цикл Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3-х копий указанного гена.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль более сильного промотора взамен природного. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Методы оценки силы промотера и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Например, P_R промотор известен как сильный конститутивный промотор. В качестве сильных промоторов известны P_L промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор, фага лямбда и подобные им.

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgamo (SD последовательности) вместо природной SD последовательности. SD последовательностью является область, находящаяся на цепи ДНК перед старт-кодоном мРНК и взаимодействующая с 16SPHK рибосомы (Shine J. and Dalgamo L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71,4, 1342-6).

Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, введением мутации в последовательность промотора для повышения уровня транскрипции гена, расположенного за промотором. Уже известно, что замена нескольких нуклеотидов в спейсерном участке между сайтом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном и, в частности, в последовательностях, расположенных непосредственно перед старт кодоном, серьезно влияет на уровень трансляции мРНК. Например, была обнаружена 20-кратная разница в уровне экспрессии гена в зависимости от состава последовательности из трех нуклеотидов, находящихся перед старт кодоном (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403,1981; Hui et al; EMBO J., 3, 623-629, 1984).

Методами получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и подобным ей.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты.

Примеры бактерий - продуцентов L-аминокислоты, принадлежащих к роду Escherichia, приведены ниже.

Бактерия - продуцент L-гистидина

Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают в себя штаммы бактерии - продуцента L-гистидина, принадлежащих к роду Escherichia, такие как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, Российский патент 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, Российский патент 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейская патентная заявка 1085087А2); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была в дальнейшем модифицирована для усиления экспрессии одного или более генов гистидинового оп