Днк-вакцина (варианты) и иммуногенная композиция против чумки собак

Днк-вакцина (варианты) и иммуногенная композиция против чумки собак

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии, в частности к улучшенным ДНК-вакцинам для домашних животных, в особенности собак, кошек и лошадей.

Уровень техники

Использование молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для вакцинации известно с начала 90-х годов (Wolf и др., Science, 247, 1465-1468 (1990)). Этот метод вакцинации индуцирует клеточный и гуморальный иммунитет после трансфекции in vivo клеток вакцинируемого животного молекулами ДНК или РНК, кодирующими и экспрессирующими иммунологически активные белки.

ДНК-вакцина состоит из по меньшей мере одной плазмиды, которая может быть экспрессирована в клетках вакцинируемого животного, и фармацевтически приемлемого наполнителя или эксципиента. Плазмида содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует и экспрессирует один или несколько иммуногенов, таких, как белки или гликопротеины, способные индуцировать у вакцинируемого животного клеточный (мобилизация Т-лимфоцитов) и гуморальный (стимуляция продуцирования антител, специфически направленных против иммуногена) иммунный ответ (Davis H.L., Current Opinion Biotech., 8, 635-640 (1997)).

Поскольку иммуногены, полученные на основе патогена, не всегда могут индуцировать достаточно эффективный защитный иммунный ответ у вакцинируемого животного, в раде случаев бывает необходимо улучшить иммунный ответ.

Каждый путь введения имеет присущие ему ограничения и трудности; так, ДНК-вакцина, эффективная при введении одним путем, может оказаться неэффективной при введении другим путем.

При выборе пути введения нужно учитывать потребности практикующих врачей и животноводов, трудности, связанные с содержанием животных или с природой продукта.

Хотя может быть использован внутримышечный путь введения, подкожный путь введения представляет большой интерес для вакцинации домашних животных, предпочтительно для мелких животных, с которыми трудно обращаться.

ДНК-вакцины, следовательно, должны быть улучшены, чтобы было возможно их эффективное введение различными путями.

ДНК-вакцины уже были использованы экспериментально. В качестве примера можно привести ДНК-вакцину, кодирующую гемагглютинин (НА) вируса кори (Ethart и др., J. Gen. Virol., 78, 1577-1580 (1997)), внутриносовое введение которой в случае мыши оказалось более эффективным, чем пероральное введение. Другим примером является ДНК-вакцина, кодирующая белок оболочки (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), подкожное введение которой оказалось неэффективным по сравнению с внутимышечным введением (Ishii и др., AIDS Res. Hum. Retro, 13, 1421-1428 (1997)).

ДНК-вакцины также были использованы экспериментально против вирусов животных, в частности против вируса чумки собак (CDV). Некоторые иммуногены CDV известны, в частности, нуклеокапсидный белок (N), матриксный белок (М), слитый белок (F) и гемагглютинин (НА) (WO-A-9741236). Однако подкожное введение ДНК-вакцины, кодирующей гемагглютинин и слитый белок CDV, не позволило обнаружить продуцирование антител у мыши, а слабое продуцирование антител удалось детектировать только после внутримышечного введения этой вакцины (Sixt и др., J. Virol., 72, 8472-8476 (1998)).

Инуцирование иммунного ответа и соотношения между различными элементами иммунной системы, принимающими участие в формировании этого ответа, могут слегка различаться у различных видов животных. Многочисленные данные, полученные в результате экспериментов на модели мыши, позволили лучше понять функционирование иммунной системы у мыши, однако эти данные нельзя прямо переносить на другие виды, особенно вследствие того, что индуцировать иммунный ответ у мыши оказалось легче, чем у других видов (van Drunen Little-van den Hurk и др., J. Gen. Virol., 79, 831-839 (1998); Böhm и др., Vaccine, 16, 949-954 (1998)).

Были предложены различные пути введения ДНК-вакцины (интраперитонеальный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, через слизистую оболочку и т.д.). Также были предложены различные средства введения, в частности частицы золота, покрытые ДНК и вносимые через кожу вакцинируемого животного (Tang и др., Nature, 356, 152-154 (1992)), и струйные жидкостные инъекторы, позволяющие осуществлять одновременно трансфекцию клеток кожи и клеток нижележащих тканей (Furth и др., Analytical Bioch., 205, 365-368 (1992)).

Для повышения эффективности трансфекции in vitro ДНК были использованы химические соединения:

А/ - катионные липиды

Катионные липиды разделяют на четыре подгруппы:

1) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, как, например, DOTMA (диолеоилоксипропилтриметиламмоний, выпускаемый фирмой Gibco под названием Lipofectine), DOTAP (триметил-2,3-(октадец-9-еноилокси)-1-пропанаммоний; Gregoriadis и др., FEBS Letters, 402, 107-110 (1997)), DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаммоний; WO-A-9634109), DLRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаммоний; Felgner и др., Ann. N.Y. Acad. Sci., 772, 126-139 (1995)).

Катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, необязательно могут быть получены в виде комплекса с дополнительным нейтральным липидом, таким, как DOPC (диолеоилфосфатидилхолин) или DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин) (J.P.Behr, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389 (1994));

2) липоамины, как, например, DOGS (диоктадециламидоглицилспермин; продукт, выпускаемый фирмой Promega под названием Transfectam; Abdallah и др., Biol. Cell., 85, 1-7 (1995)), DC-Chol (диметиламиноэтанкарбамоилхолестерин; Gao и Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179, 280-285 (1991)), BGSC (бисгуанидинспермидинхолестерин), BGTC (бисгуанидинтренхолестерин) (Vigneron и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9682-9686 (1996));

3) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония и липоамины, как, например, DOSPA (N,N-диметил-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-2,3-бис(диолеоилокси)-1-пропанимидийпентагидрохлорид, выпускаемый фирмой Gibco под названием LipofectAmine^®; Hawley-Nelson и др., Focus, 15, 73-79 (1993)), GAP-DLRIE (N-(3-аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаминий; Wheeler и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11454-11459 (1996)); Norman и др., Vacine, 15, 801-803 (1997));

4) липиды, содержащие соли амидина, как, например, ADPDE, ADODE (Ruysschaert и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203, 1622-1628 (1994));В/ - полимеры,

как, например, SuperFect^™ (активированные дендримерные молекулы; продукты, выпускаемые фирмой Qiagen; Xu и др., Mol. Genet. Metab., 64, 193-197 (1998)); и

С/ - биохимические агенты,

как, например, токсины, в частности желчные токсины.

Некоторые из этих соединений также были использованы для приготовления ДНК-вакцин с более чем умеренными результатами. Однако результаты, полученные in vitro, нельзя автоматически переносить на вакцинацию ДНК, при которой конечной целью является обеспечение защитной иммунной реакции. Негативное влияние на индуцирование эффективной иммунной защиты также было установлено при использовании соединений, известных для повышения эффективности трансфекции in vitro. Некоторые химические соединения лекарственной формы также являются токсичными в высоких дозах для трансфецируемых клеток.

Согласно уже цитированным работам Etchart (Etchart и др., J. Gen. Virol., 78, 1577-1580 (1997)), использование DOTAP не оказывало адъювантного действия при введении ДНК-вакцины через нос, тогда как оно имело место при введении пероральным путем. DOTAP также был использован в ДНК-вакцинах, кодирующей гемагглютинин (НА) вируса гриппа, на модели мыши при внутриносовом введении (Ban и др., Vaccine, 15, 811-813 (1997)), однако введение DOTAP ингибировало иммунный ответ. Использование DC-Chol или DOTAP/DOPE в ДНК-вакцинах, кодирующей HBs антиген вируса гепатита В, на модели мыши при введении внутримышечным путем позволило усилить ответ в виде антител, тогда как использование липофектина (или DOTMA) не усилило этот ответ (Gregoriadis и др., FEBS Letters, 402, 107-110 (1997)). DC-Chol/DOPE также был использован в ДНК-вакцинах против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, белок Env) на модели мыши, введение которого внутримышечным путем индуцировало более эффективный иммунный ответ, тогда как введение подкожным или внутрикожным путем не усиливало его (Ishii и др., AIDS Res. Hum. Retro, 13, 1421-1428 (1997)).

Также согласно WO-A-98/40499 предлагается реализовать комплексы нуклеиновая кислота + катионные липиды для трансфекции эпителия слизистой оболочки млекопитающих, для генной терапии или экспрессии антигена, предназначенного для индуцирован иммунного ответа. В этом документе предусматривается путь введения через слизистую оболочку за счет ингаляции, например, в случае легочного эпителия. Установлено, что указанные в этом документе результаты отличаются от предшествующих работ. В этой же работе было показано, что для внутримышечного (парентерального) введения ″голая″ ДНК является более эффективной, чем смесь ДНК + липид.

Добавление некоторых цитокинов, в частности интерлейкинов или интерферонов, может усилить иммунный ответ, индуцируемый в особенности ДНК-вакцинами. Каждый цитокин вызывает реакцию, которая свойственна ему, и более или менее ориентирует иммунный ответ в направлении клеточного ответа или в направлении гуморального ответа (Pasquini и др., Immunol. Cell. Biol., 75, 397-401 (1997)); Kim и др., J. Interferon Cytokine Res., 19, 77-84 (1999)). Адъювантные действия цитокина, происходящего от данного вида, не являются обязательно одними и теми же, если изменяется иммунный контекст, особенно если этот цитокин введен другому виду, следовательно, в гетерологичную иммунную систему. Добавление цитокина может также не оказывать никакого адъювантного действия, даже приводить к инверсии искомого эффекта, то есть к уменьшению или ингибированию иммунного ответа. Так, ДНК-вакцина, кодирующая цепь иммуноглобулина, слитого с GM-CSF, не усиливает иммунный ответ, тогда как прямое введение мыши этого слитого белка является эффективным, совершенно также, как введение слитого белка, состоящего из Fv и цитокина IL-1β, или введение ДНК-вакцины, кодирующей вышеуказанный последний слитый белок (Hakim и др., J. Immunol., 157, 5503-5511 (1996)). Использование плазмид, коэкспрессирующих цитокин IL-2 и белок оболочки вируса гепатита В в слитой или неслитой форме, приводит к усилению гуморального и клеточного иммунного ответа (Chow и др., J. Virol., 71, 169-178 (1997)). Однако использование бицистронной плазмиды, кодирующей гликопротеин gp 120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и цитокин IL-2, индуцирует более слабый специфический анти- gp 120 иммунный ответ, чем ответ, получаемый за счет использования моноцистронной плазмиды, кодирующей только gp 120 (Barouch и др., J. Immunol., 161, 1875-1882 (1998)). Коинъекция мыши двух экспрессирующих векторов, одного, кодирующего гликопротеин G вируса бешенства, другого, кодирующего GM-CSF мыши, стимулирует активность В- и Т-лимфоцитов, тогда как коинъекция плазмиды, кодирующей гамма-интерферон (вместо GM-CSF мыши), приводит к ослаблению иммунного ответа (Xiang и др., Immunity, 2, 129-135 (1995)).

Некоторые модификации на уровне антигенов, такие, как делеции части нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген, инсерции фрагмента ДНК в нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, или в нетранскрибируемые области перед и после последовательности, кодирующей антиген, могут также повышать эффективность ДНК-вакцин, особенно повышая уровень экспрессии антигена или содержащей его части.

На практике, однако, манипуляции на уровне нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген, могут вызывать уменьшение или потерю первоначальной иммунологической активности. Так, делеция трансмембранного домена в случае гена, кодирующего антиген G вируса бешенства, снижает уровень защиты, индуцированной в случае модели мыши после введения внутримышечно ДНК-вакцины, кодирующей такой модифицированный антиген (Xiang и др., Virol., 209, 569 (1995)). Делеция трансмембранного домена в случае гена, кодирующего гликопротеин gD бычьего герпесвируса (BHV), не позволяет усилить ответ в виде антител и индуцирует только частичную защиту у быков, вакцинированных внутримышечным путем (van Drunen Little-van den Hurk и др., J. Gen. Virol., 79, 831-839 (1998)). Гуморальный и клеточный иммунный ответ и придаваемая защита идентичны у подопытных морских свинок после иммунизации ДНК-вакциной, кодирующей гликопротеин GP вируса Эбола, либо ДНК-вакциной, кодирующей гликопротеин GP в секретированной форме (Xu и др., Nature Medicine, 4, 37-42 (1998)).

Инсерция сигнальной последовательности тканевого плазминогенного активатора человека (human tissue Plasminogen Activator, или человеческий tPA) в ген, кодирующий антиген Pf332 малярии, не позволяет усиливать иммунный ответ в виде антител у мыши, вакцинированной внутримышечно (Haddad и др., FEMS, 18, 193-202 (1997)). Встраивание сигнальной последовательности tPA в ген, кодирующий антиген VP7 ротавируса мыши, также не позволяет усиливать иммунный ответ в виде антител у мыши, вакцинированной внутрикожно, тогда как слитый белок, состоящий из антигена VP4 и сигнальной последовательности tPA, позволяет усилить иммунный ответ, но без индуцирования эффективной защиты (Choi и др., Virology, 250, 230-240 (1998)).

Модификации, осуществленные в случае нуклеотидной последовательности одного антигена, обычно не могут быть прямо перенесены на другой антиген, так как антигены не всегда имеют одну и ту же структурную организацию.

Сущность изобретения

Целью заявителя является повышение эффективности ДНК-вакцин и особенно индуцирование лучшего иммунного ответа и обеспечение эффективной защиты домашних животных, и в частности собак, кошек и лошадей, путем ДНК-вакцинации при различных путях введения и, в частности, при подкожном введении.

Целью заявителя является получение улучшенных ДНК-вакцин, индуцирующих эффективный защитный и иммунный ответ против вируса чумки собак (CDV), вируса респираторного комплекса или лающего кашля (вирус парагриппа-2 или CPI-2), собачьего герпесвируса (CHV-1) у собаки.

Целью изобретателя является получение улучшенных ДНК-вакцин, индуцирующих эффективный защитный и иммунный ответ против кошачьего герпесвируса (FHV-1) у кошки.

Целью изобретателя является получение улучшенных ДНК-вакцин, индуцирующих эффективный защитный и иммунный ответ против лошадей герпесвируса типа 1 (EHV-1), лошадей герпесвируса типа 4 (EHV-4) у лошади.

Целью заявителя также является получение улучшенных ДНК-вакцин, обеспечивающих эффективную защиту собак, включающих по меньшей мере одну валентность, выбираемую из группы, состоящей из вируса CDV, вируса CPI-2, вируса CHV-1, вируса бешенства (рабдовирус), собачьего парвовируса (CPV), собачьего коронавируса (CCV) и Borrelia burgdorferi.

Целью заявителя также является получение улучшенных ДНК-вакцин, обеспечивающих эффективную защиту кошек, включающих по меньшей мере одну валентность, выбираемую из группы, состоящей из кошачьего герпесвируса (FHV-1), кошачьего калицивируса (FCV), вируса бешенства (рабдовирус), кошачьего парвовируса (FPV), кошачьего вируса инфекционного перитонита (FIPV), кошачьего вируса лейкоза (FeLV) и кошачьего вируса синдрома приобретенного иммунодефицита (FTV).

Целью заявителя также является получение улучшенных ДНК-вакцин, обеспечивающих эффективную защиту лошадей, включающих по меньшей мере одну валентность, выбираемую из группы, состоящей из лошадиного герпесвируса типа 1 (EHV-1), лошадиного герпесвируса типа 4 (EHV-4), лошадиного вируса гриппа, лошадиного вируса энцефалита Est, лошадиного вируса энцефалита Quest, лошадиного вируса энцефалита Venezuela, вируса бешенства, Clostridium tetani и Borrelia burgdorferi.

Объектом изобретения являются улучшенные ДНК-вакцины, обеспечивающие эффективную защиту против по меньшей мере одного патогена, инфицирующего домашних животных, в особенности собак, кошек и лошадей. Эффективность ДНК-вакцин улучшают либо оптимизацией способа получения приготовления, либо добавлением GM-CSF, либо оптимизацией антигена или антигенов, либо комбинацией этих подходов.

Предпочтительно ДНК-вакцины улучшают оптимизацией способа получения и необязательно добавлением GM-CSF, либо оптимизацией антигена или антигенов, либо, наконец, одновременным добавлением GM-CSF и оптимизацией антигена или антигенов.

По определению, ДНК-вакцина включает в качестве действующего начала плазмиду, кодирующую и экспрессирующую ген или фрагмент гена. Термин ″плазмида″ означает транскрипционную единицу, включающую полинуклеотидную последовательность, содержащую последовательность экспрессируемого гена и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo. Форма плазмиды предпочтительно кольцевая, ″суперскрученная″ или нет. В рамки настоящего изобретения также входит линейная форма.

Каждая плазмида включает промотор, обеспечивающий экспрессию встроенного гена в клетке. Обычно речь идет о сильном эукариотном промоторе и, в особенности, о раннем промоторе цитомегаловируса CMV-IE человека или мыши или другого вида, например, крысы или морской свинки. Как правило, используют промотор либо вирусного происхождения, либо клеточного происхождения. В качестве вирусного промотора, другого, чем CMV-IE, можно назвать ранний или поздний промотор вируса SV40 или промотор области LTR вируса саркомы Рауса. Также можно использовать собственный промотор экспрессируемого гена. В качестве клеточного промотора можно назвать промотор гена питоскелета, такой, как, например, десминовый промотор, или актиновый промотор. Когда в одной и той же плазмиде присутствуют несколько генов, они могут находиться в одной транскрипционной единице или в двух разных транскрипционных единицах.

Согласно первому варианту, в качестве адъюванта для ДНК-вакцин согласно изобретению используют катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, предпочтительно DMRIE, и более предпочтительно в комплексе с нейтральным липидом, предпочтительно DOPE, для образования DMRIE-DOPE комплекса.

Следовательно, объектом настоящего изобретения является ДНК-вакцина против по меньшей мере одного патогена, поражающего домашних животных, в особенности собак, кошек или лошадей, включающая по меньшей мере одну плазмиду, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген патогена рассматриваемого вида животных, под контролем регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию этой последовательности in vivo, и катионный липид, содержащий соль четвертичного аммония формулы:

в которой

R₁ означает линейный, насыщенный или ненасыщенный алифатический радикал с 12-18 атомами углерода;

R₂ означает другой алифатический радикал с 2 или 3 атомами углерода; и Х означает гидроксил или аминогруппу.

Предпочтительно речь идет о DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаммоний; WO-A-9634109), более предпочтительно в комплексе с нейтральным липидом, предпочтительно с DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин), с образованием DMRIE-DOPE комплекса.

Смесь рекомбинантного вектора с таким адъювантом предпочтительно готовят перед самым употреблением, предпочтительно перед ее введением животному, инкубируют в течение времени, необходимого для образования комплекса, например, в течение времени от 10 до 60 минут, предпочтительно порядка 30 минут.

При использовании DOPE молярное соотношение DMRIE : DOPE составляет от 95:5 до 5:95, предпочтительно 1:1.

Массовое соотношение плазмида : DMRIE (или DMRIE-DOPE) составляет от 50:1 до 1:10, предпочтительно от 10:1 до 1:5, более предпочтительно от 1:1 до 1:2.

Согласно второму варианту к ДНК-вакцинам согласно изобретению добавляют GM-CSF (Granulocyte macrophage - colony stimulating factor (гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор); Clark S.C. и др., Scienct, 230, 1229 (1987); Grant S.M. и др., Drngs, 53, 516 (1992)), что можно осуществлять или путем добавления белка GM-CSF непосредственно в вакцинную композицию или предпочтительно путем встраивания последовательности, кодирующей GM-CSF, в экспрессирующий вектор, обеспечивающий его экспрессию in vivo. В качестве экспрессирующего вектора предпочтительно используют плазмиду, например плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес антиген или представляющие интерес антигены или другую плазмиду. Видовую принадлежность GM-CSP выбирают в зависимости от вида вакцинируемого животного; так, для собак используют GM-CSF собаки, для кошек используют GM-CSF кошки и для лошадей используют GM-CSF лошадей.

Согласно третьему варианту нуклеотидная последовательность (или нуклеотидные последовательности), кодирующая иммуноген, находится в оптимизированной форме. Под оптимизацией понимают любую модификацию нуклеотидной последовательности, усиливающую экспрессию этой нуклеотидной последовательности путем повышения стабильности мРНК, кодирующей этот антиген, или путем обеспечения секреции этого антигена во внеклеточную среду, приводящую к усилению индуцированного иммунного ответа.

Согласно настоящему изобретению оптимизация представляющего интерес антигена предпочтительно состоит в делеции фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующего трансмембранный домен представляющего интерес антигена (под делецией понимают полную делецию или частичную делецию, достаточную для того, чтобы трансмембранный домен не был более функциональным), и/или встраивание нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид tPA (tissue plasminogen activator (тканевый плазминогенный активатор); Montgomery и др., Cell. Mol. Biol., 43, 285-292 (1997); Harris и др., Mol. Biol. Med., 3, 279-292 (1986)), и/или встраивание интрона-стабилизатора перед экспрессируемым геном. Делеция фрагмента, кодирующего трансмембранный домен представляющего интерес антигена, благоприятствует секреции во внеклеточную среду укороченных антигенов и, таким образом, повышает их способность контактировать с клетками иммунной системы. Встраивание нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид tPA, облегчает транслируемость содержащей эту последовательность РНК и, таким образом, увеличивает уровень экспрессии этой мРНК и, следовательно, продуцирование антигенов. Сигнальный пептид tPA также играет роль в секреции синтезированного антигена. Инсерция интрона-стабилизатора в ген, кодирующий представляющий интерес антиген, позволяет избегать аберрантных связывании его информационной РНК и сохраняет физическую целостность последней.

Предпочтительно используют сигнальный пептид tPA человека. Нуклеотидная последовательность сигнального пептида tPA человека доступна из базы данных банка генов под номером NM_000930. Интрон предпочтительно представляет собой интрон II гена бета-глобина кролика (van Ooyen и др., Science, 206, 337-344 (1979)), нуклеотидная последовательность которого доступна из базы данных банка генов под номером V00882 и находится под названием интрон №2.

Объектом настоящего изобретения является улучшенная ДНК-вакцина, способная индуцировать эффективный иммунный и защитный ответ у собаки против чумки собак (по-английски Canine Distemper Virus (вирус собачьей чумы), или CDV).

Болезни Карре вызывает Morbillivirus, относящийся к Paramyxoviridae. Этот вирус вызывает инфекцию не только у собак, но также у диких кошек (Harder и др., J. Gen. Virol., 77, 397-405 (1996)).

Согласно настоящему изобретению можно получать эффективную защищающую собак против болезни Карре ДНК-вакцину, предпочтительно при введении подкожно (Sixt и др., J. Virol., 72, 8472-8476 (1998)).

Согласно изобретению, ДНК-вакцина против CDV получают в виде комплекса с адъювантом согласно изобретению, предпочтительно DMRIE, более предпочтительно DMRIE-DOPE. ДНК-вакцину в комплексе с адъювантом необязательно можно вводить либо в комбинации с GM-CSF собаки (Nash и др., Blood, 78, 50-56 (1991)), либо оптимизировать по меньшей мере один антиген CDV, наконец, либо с добавлять GM-CSF собаки и оптимизировать по меньшей мере один антиген CDV.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая GM-CSF собаки, доступна из базы данных банка генов под номером S49738.

GM-CSF собаки можно добавлять либо непосредственно в вакцинную композицию или более предпочтительно путем встраивания нуклеотидной последовательности, кодирующей GM-CSF собаки, в экспрессирующий in vivo вектор, предпочтительно в плазмиду. Нуклеотидную последовательность, кодирующую GM-CSF собаки, предпочтительно встраивают во вторую плазмиду экспрессии, отличную от той (тех), в которую (в которые) встроен ген или гены, кодирующие антиген или антигены CDV.

Оптимизацию происходящих от CDV антигенов осуществляют путем замены сигнальной последовательности антигена (гемагглютинин (НА) и/или слитый белок (F)), предпочтительно сигнальной последовательности tPA человека (банк генов, номер NM 000930), и/или путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен НА и/или F, и/или путем инсерции интрона, предпочтительно интрона II гена бета-глобина кролика (нуклеотидная последовательность которого, обозначаемая как интрон № 2, доступна из базы данных банка генов под номером V00882) перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей НА и/или F. ДНК-вакцина против CDV согласно изобретению, следовательно, может кодировать и экспрессировать либо один оптимизированный антиген CDV (НА или F) или оба антигена, то есть оптимизированный НА и оптимизированный F.

Необязательно последовательность, кодирующая природный матриксный белок (М) CDV (без модификации), и/или нуклеотидная последовательность, кодирующая природный нуклеопротеин (N) CDV (без модификации), могут быть также встроены в экспрессирующие плазмиды, причем последние могут быть использованы вместе с плазмидами, содержащими оптимизированный НА и/или оптимизированный F.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигены CDV, используемые согласно настоящему изобретению, и различные конструкции экспрессирующих векторов проиллюстрированы в прилагаемых примерах и в Международной заявке WO-A-98031199, в особенности в приведенных в ней примерах 8 и 9 и на представленных в ней фигурах 2 и 3.

Согласно изобретению ДНК-вакцину против CDV при введении внутримышечно предпочтительно получают в виде комплекса с DMRIE-DOPE, и вакцина включает две экспрессирующие плазмиды, одна из которых (например, pNS024, фигура 4) содержит антиген НА CDV, оптимизированный путем замены сигнальной последовательности НА сигнальной последовательностью tPA человека, делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен НА, и инсерции интрона II гена бета-глобина кролика перед геном НА, а другая плазмида (например, pNS021, фигура 3), содержит антиген F CDV, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен, и инсерции интрона II гена бета-глобина кролика перед геном F.

Согласно изобретению ДНК-вакцину на основе против CDV для введения подкожным путем предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE, и вакцина включает плазмиду, экспрессирующую GM-CSF собаки, и две вышеуказанные плазмиды (например, pNS024 и pNS021).

Объектом настоящего изобретения также является улучшенная ДНК-вакцина, способная индуцировать эффективный защитный и иммунный ответ у собаки против респираторного комплекса или лающего кашля (вирус собачьего парагриппа-2 или CPI-2).

Вирус CPI-2 представляет собой Paramyxovirus и относится к Paramyxoviridae (Bittle и др., J. Am. Vet. Med. Assoc., 156, 1771-1773 (1970); Moloney и др., Aust. Vet. J., 62, 285-286 (1985)).

ДНК-вакцину против CPI-2 предпочтительно готовят в виде комплекса с адъювантом согласно изобретению, предпочтительно DMRIE, более предпочтительно в виде комплекса с DMRIE-DOPE. ДНК-вакцину необязательно можно вводить в комбинации с GM-CSF собаки или использовать хотя бы один оптимизированный антиген CPI-2, или вакцина может содержать по меньшей мере один оптимизированный антиген CPI-2 вместе с GM-CSF собаки.

GM-CSF собаки добавляют также как и при вакцинации против CDV.

Оптимизацию антигенов CPI-2 (гемагглютининнейраминидаза (HN) CPI-2 и/или слитый белок (F) CPI-2) осуществляют путем замены сигнальной последовательности, антигена, предпочтительно сигнальной последовательностью tPA человека и/или путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен HN и/или F, и/или путем инсерции интрона, предпочтительно интрона II гена бета-глобина кролика, перед геном, кодирующим HN и/или F. ДНК-вакцина против CPI-2 согласно изобретению, следовательно, может кодировать и экспрессировать или один (HN или F) или оба (HN и F) оптимизированных антигенов CPI-2.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигены CPI-2, используемые согласно настоящему изобретению, и различные конструкции экспрессирующих векторов подробно рассмотрены в прилагаемых примерах.

ДНК-вакцину против CPI-2 для введения внутримышечно предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE, и такая вакцина включает две экспрессирующих плазмиды, одна из которых (например, pSB034, фигура 6), содержит антиген HN CPI-2, оптимизированный путем замены сигнальной последовательности HN сигнальной последовательностью tPA человека, делеции фрагмента HN, кодирующего трансмембранный домен, и инсерции интрона II гена бета-глобина кролика перед геном HN, а вторая плазмида (например, pSB032, фигура 5) содержит антиген F CPI-2, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен F и инсерции интрона II гена бета-глобина кролика перед геном F.

ДНК-вакцину против CPI-2 согласно изобретению, для введения подкожно предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE, и эта вакцина включает плазмиду, экспрессирующую GM-CSF собаки, и две вышеуказанные плазмиды (например, pSB034 и pSB032).

Объектом настоящего изобретения является также улучшенная ДНК-вакцина, способная индуцировать эффективный защитный и иммунный ответ у собаки против собачьего герпесвируса типа 1 (CHV-1).

Вирус CHV-1 относится к Alphaherpesvirinae. Этот вирус вызывает у собак вирусный ринотрахеит. Нуклеотидные последовательности, кодирующие гликопротеины gB, gC и gD, известны (Limbach и др., J. Gen. Virol., 75, 2029-2039 (1994)).

ДНК-вакцину против CHV-1 предпочтительно готовят в виде комплекса с адъювантом согласно изобретению, предпочтительно DMRIE, более предпочтительно DMRIE-DOPE. Вакцину можно необязательно вводить в комбинации с GM-CSF собаки, или использовать по меньшей мере один антиген CHV-1, или можно использовать по меньшей мере один оптимизированный антиген CHV-1 в комбинации с GM-CSF собаки.

GM-CSF собаки добавляют так же, как и при вакцинации против CDV.

Оптимизацию антигенов CHV-1 осуществляют путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен гликопротеина gB, и/или гликопротеина gC, и/или гликопротеина gD CHV-1. Улучшенная ДНК-вакцина против CHV-1 согласно изобретению, следовательно, может кодировать и экспрессировать либо один оптимизированный антиген CHV-1 (gB, gC или gD), либо любые два из них или все три.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигены CHV-1, используемые согласно настоящему изобретению, и различные конструкции экспрессирующих векторов подробно рассмотрены в прилагаемых далее примерах, а также в Международной заявке WO-A-98/03199 и, в частности, в приведенных в ней примерах 7 и 8 и на представленных в ней фигурах 13 и 14.

ДНК вакцину против CHV-1 для введения внутримышечно предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE. Такая вакцина включает первую экспрессирующую плазмиду (например, pSB016, фигура 7), кодирующую антиген gB CHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен, и вторую экспрессирующую плазмиду (например, pSB019, фигура 8), кодирующую антиген gC CHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента кодирующего трансмембранный домен F, и третью экспрессирующую плазмиду (например, pSB017, фигура 9), кодирующую антиген gD CHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен.

ДНК-вакцину против CHV-1 для введения подкожно предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE. Такая вакцина включает экспрессирующую плазмиду, кодирующую GM-CSF собаки, и три вышеуказанные плазмиды (например, pSB016, pSB019 и pSB017).

Объектом настоящего изобретения является улучшенная ДНК-вакцина, способная индуцировать эффективный защитный и иммунный ответ у кошки против герпесвируса типа 1 (FHV-1) кошки.

Вирус FHV-1 относится к Alphaherpesvirinae и вызывает вирусный ринотрахеит у кошек (Fargeaud и др., Arch. Virol., 80, 69-82 (1984)).

ДНК-вакцину против FHV-1 предпочтительно готовят в виде комплекса с адъювантом согласно изобретению, предпочтительно с DMRIE, более предпочтительно с DMRIE-DOPE. Вакцину необязательно можно добавлять в комбинации с GM-CSF кошки, либо оптимизировать по меньшей мере один антиген FHV-1, либо, наконец, комбинировать добавление GM-CSF кошки и оптимизацию по меньшей мере одного антигена FHV-1.

GM-CSF кошки вводят либо путем добавления белка GM-CSF непосредственно в вакцинную композицию или путем встраивания нуклеотидной последовательности, кодирующей GM-CSF кошки (например, доступной из базы данных банка генов под номером AF053007), в экспрессирующий in vivo вектор, предпочтительно в плазмиду. Нуклеотидную последовательность, кодирующую GM-CSF кошки, предпочтительно встраивают во вторую экспрессирующую плазмиду, отличную от той (тех), в которую (в которые) встроен ген или гены, кодирующие антиген или антигены FHV-1.

Оптимизацию FHV-1 антигенов осуществляют путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранные домены гликопротеина gB и/или, гликопротеина gC, и/или гликопротеина gD FHV-1. Улучшенная ДНК-вакцина против FHV-1 согласно изобретению, следовательно, может кодировать и экспрессировать один оптимизированный антиген FHV-1 (gB, gC или gD), любые два из них или все три.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигены FHV-1, используемые согласно настоящему изобретению, и различные конструкции экспрессирующих векторов представлены в прилагаемых примерах и в Международной заявке WO-A-98/03660 и, в частности, в приведенных в ней примерах 14 и 15 и на представленных в ней фигурах 11 и 12.

Согласно изобретению ДНК-вакцину против FHV-1 для введения внутримышечно предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE. Такая вакцина включает первую плазмиду (например, pSB021, фигура 10), экспрессирующую антиген gB FHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен, вторую плазмиду (например, pSB023, фигура 11), экспрессирующую антиген gC FHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен F, и третью плазмиду (например, pSB024, фигура 12), экспрессирующую антиген gD FHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен.

Согласно изобретению ДНК-вакцину против FHV-1 для введения подкожно предпочтительно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE. Такая вакцина включает плазмиду, экспрессирующую GM-CSF кошки, и три вышеуказанные плазмиды (например, pSB021, pSB023 и pSB024).

Объектом настоящего изобретения является улучшенная ДНК-вакцина, способная индуцировать эффективный защитный и иммунный ответ у лошади против герпесвируса типа 1 (EHV-1) лошадей.

Вирус EHV-1 относится к Alphaherpesvirinae. Вирус EHV-1 вызывает аборт у лошадей (Crabb и др., Adv. Virus Res., 45, 153-190 (1995)). Полный геном этого вируса определен (Telford и др., Virilogy, 189, 304-316 (1992)).

ДНК-вакцину против EHV-1 предпочтительно готовят в виде комплекса с адъвантом согласно изобретению, предпочтительно с DMRIE, более предпочтительно с DMRIE-DOPE. Вакцину необязательно добавляют комбинации с GM-CSF лошади, либо оптимизируют по меньшей мере один антиген EHV-1, либо, наконец, комбинируют добавление GM-CSF лошади и оптимизацию по меньшей мере одного антигена EHV-1.

GM-CSF лошади добавляют либо непосредственно в вакцинную композицию, либо встраивают нуклеотидную последовательность (например, последовательности № 69, фигура 26), кодирующей GM-CSF лошади, в экспрессирующий in vivo вектор, предпочтительно в плазмиду. Нуклеотидную последовательность, кодирующую GM-CSF лошади, предпочтительно встраивают во вторую экспрессирующую плазмиду, отличную от той (или тех), в которую (в которые) встроен ген или гены, кодирующие антиген или антигены EHV-1.

Оптимизацию антигенов EHV-1 осуществляют путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранные домены гликопротеина gB, и/или гликопротеина gC, и/или гликопротеина gD EHV-1. Улучшенная ДНК-вакцина против EHV-1 согласно изобретению, следовательно, может кодировать и экспрессироватъ один оптимизированный антиген EHV-1 (gB, gC или gD) или два из них или все три.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигены EHV-1, используемые согласно настоящему изобретению, и различные конструкции экспрессирующих векторов представлены в прилагаемых примерах и в Международной заявке WO-A-98/03198, особенно в приведенных в ней примерах 8 и 10 и на представленных в ней фигурах 2 и 4.

Для лошади предпочтительным является внутримышечное введение. Предпочтительно согласно изобретению ДНК-вакцину против EHV-1 для введения внутримышечно готовят в виде комплекса с DMRIE-DOPE. Такая вакцина включает первую плазмиду (например, pSB028, фигура 13), экспрессирующую антиген gB EHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен, вторую плазмиду (например, pSB029, фигура 14), экспрессирующую антиген gC EHV-1, оптимизированный путем делеции фрагмента, кодирующего трансмембранный домен, и третью плазмиду (например, pSB030, фигура 15), экспрессирующую антиген gD EHV-1, оптими