Система для уничтожения растительных клеток

Система для уничтожения растительных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к системе для уничтожения растительных клеток и прежде всего к трансгенным растениям, которые несут в своем геноме химерный ген, при экспрессии которого образуется цитотоксический протеин.

Одним из известных селекционерам растений путей получения новых сортов является создание гибридов существующих сортов, несущих требуемые признаки. Гибриды, как правило, отличаются от любого из родителей улучшенными различными характеристиками, это явление называют гибридной силой (гетерозис). Такие гибридные скрещивания можно осуществлять с помощью перекрестного опыления вручную, что представляет собой утомительную и требующую много времени процедуру.

В процессе осуществления таких гибридных скрещиваний предупреждение самоопыления имеет решающее значение. Для предупреждения самоопыления материнское растение можно эмаскулировать вручную, например, при получении гибридной кукурузы путем удаления метелки. Однако крупномасштабная эмаскуляция видов с гермафродитными цветками невозможна с экономической точки зрения. Можно также получать материнские линии (с мужской стерильностью) с помощью генетической мужской стерильности, этот хорошо известный у многих растений признак, как правило, является рецессивным и моногенным. Связанная с использованием этого подхода проблема состоит в трудности получения для каждого скрещивания чистых родительских линий с мужской стерильностью. Наиболее широко применяемая для создания гибридов система получения мужской стерильности представляет собой систему цитоплазматической мужской стерильности (cms). В этом случае недоразвитие пыльцы обусловлено цитоплазматическими факторами. У тех культурных растений, у которых в зародышевой плазме выявлена cms, например у кукурузы и подсолнечника, этот признак широко используется для создания гибридов. Известно несколько недостатков указанной системы: цитоплазма с мужской стерильностью может нести другие нежелательные характеристики, например Т-цитоплазму у кукурузы и чувствительность к Helminthosporium maydis; при ее применении необходимо поддерживать линии с изогенной мужской фертильностью; и применение этой системы ограничено видами, у которых доступен цитоплазматический источник стерильности.

Другим преимуществом системы, основанной на использовании мужской стерильности, является то, что с ее помощью можно получать беспыльцевые растения. Это требуется для многих сортов декоративных цветковых растений и также может найти применение для борьбы с нежелательными генетическими признаками путем предупреждения ауткроссинга.

Еще одним ценным признаком основанной на использовании стерильности системы является возможность получать растения с женской стерильностью, у которых при развитии плодов не происходит образования семян. Бессеменные сорта плодов имеют преимущества при обработке, например, томатов и также являются предпочтительными для потребителя, например, дыни. В настоящее время бессеменные сорта известны и существуют соответствующие программы селекции, но создание бессеменных плодов ограничено отсутствием у многих видов растений пригодной зародышевой плазмы.

В тех случаях, когда генетический источник стерильности отсутствует или недоступен по другим причинам, можно применять метод генетической модификации, который обеспечивает стерильность с помощью системы для уничтожения клеток, при этом некроз происходит в специфических клетках репродуктивных тканей.

В WO 89/10396 описана система для уничтожения растительных клеток, при использовании которой в растение интродуцируют химерный ген, содержащий специфичный для пыльника промотор, связанный с протеином или полипептидом РНКазы, при экспрессии которого происходит нарушение клеточного метаболизма. Таким образом, экспрессия химерного гена приводит к некрозу клеток пыльника и, как следствие, к мужской стерильности растений.

Для создания женской стерильности у растений можно использовать аналогичную систему для уничтожения клеток, мишенью которой является семяпочка.

В WO 93/18170 и WO 92/04453 описаны системы для уничтожения растительных клеток, специфические для борьбы с заражением нематодами. Согласно описанным в WO 93/18170 и WO 92/04453 системам в определенные виды растений-хозяев интродуцируют ген, содержащий кодирующую последовательность, причем кодирующая последовательность кодирует продукт, снижающий вредоносное действие нематод. Ген содержит также промоторную область, которая контролирует экспрессию кодирующей последовательности таким образом, что экспрессия происходит при нападении нематод и осуществляется практически специфично в клетках областей, которыми питаются нематоды, или в соседних клетках. Для снижения вредоносного действия нематод продукт либо может оказывать неблагоприятное воздействие на растительные клетки, которые в результате дифференцировки превращаются в клетки областей, которыми питаются нематоды, либо на соседние с ними клетки, либо может оказывать неблагоприятное воздействие непосредственно на нематод.

Имеющие экономическое значение паразитирующие на растениях нематоды включают цистообразующие нематоды, такие как картофельные нематоды (Globodera rostochiensis и G.pallida), соевая нематода (Heterodera glycines), свекловичная нематода (Heterodera schachtii) и зерновая нематода (Heterodera avenae), и галловые нематоды, такие как Meloidogyne spp. Такие паразитирующие на растениях нематоды являются основными патогенами многих культурных растений во всем мире, например овощных, кормовых бобовых культур, томатов, арбузов, винограда, арахиса, табака и хлопчатника.

Наиболее широко распространенные современные средства борьбы с нематодами основаны на применении химических средств защиты растений, агротехнических приемов и устойчивых сортов растений, и их часто используют в интегрированной системе борьбы с паразитирующими на растениях нематодами. Имеется необходимость в совершенствовании системы борьбы с нематодами, поскольку указанные существующие в настоящее время подходы не обеспечивают надежную защиту посевов. Безопасность нематицидов для окружающей среды является проблематичной, и они не всегда обладают достаточно высокой эффективностью. Однако применение системы защиты культурных растений может быть убыточным для фермеров вследствие различных причин. Широкий круг хозяев галловых нематод ограничивает возможность применения экономически значимых культур, которые не являются мишенью для нематод. Эффективные устойчивые сорта часто не являются доступными, а те, которые фермер может применять, иногда при невысокой численности нематод оказываются хуже чувствительных сортов. Кроме того, устойчивость может снижаться при высоких температурах почвы, что характерно для тропической и субтропической зон.

Можно рассматривать и другие пути применения систем для уничтожения растительных клеток. Например, мишенью могут быть определенные части цветка, что обусловливает изменение морфологии цветка. В другом варианте мишенью могут быть боковые корни, шипы или жгучие волоски. Можно достигать отделения (абсцизии) листьев или плодов, когда мишенью является отделительный слой листа или плода. Можно достигать также облегчения сбрасывания семян в случае, когда мишенью является семяножка. При использовании в качестве мишеней других органов, таких как трихомы, которые, как правило, являются железистыми (гландулярными), производство химических субстанций в этих органах можно прекращать или предупреждать. Другим вариантом применения может быть индуцибельное отделение корней, листьев, цветков или плодов в конце вегетационного периода.

В NZ 260511 предложена система для уничтожения растительных клеток, отличающаяся повышенной тканеспецифичностью. Эта система позволяет осуществлять экспрессию цитотоксической молекулы (под контролем первого промотора, где первый промотор обеспечивает экспрессию в специфических клетках-мишенях и в одной или нескольких других областях растения) в сочетании с защитной молекулой (под контролем второго промотора, где второй промотор обеспечивает экспрессию во всех областях, в которых первый промотор проявляет активность, кроме специфических клеток-мишеней). Примерами приемлемых цитотоксической и защитной молекул являются протеазы и ингибиторы протеаз соответственно или нуклеазы и ингибиторы нуклеаз соответственно. В WO 93/10251 описано применение цитотоксической рибонуклеазы барназы в сочетании с защитной молекулой-ингибитором барстаром.

В WO 98/44138 описан метод повышения специфичности экспрессии гена путем направленного переноса специфического сайта экспрессии гена-мишени. Таким образом получают химерный ген, при этом химерный ген содержит промотор, который обеспечивает экспрессию более чем в одной области организма, подлежащего воздействию. Промотор связывают с агентом, оказывающим воздействие на функцию эндогенного гена в растении, который также экспрессируется более чем в одной области растения. Промотор и агент выбирают так, чтобы сайты их экспрессии перекрывались в одной или в нескольких требуемых областях. Наличие этого(их) перекрывающегося(ихся) сайта(ов) обеспечивает повышение специфичности и направленности экспрессии гена.

Инактивирующие рибосому протеины (RIP) представляют собой группу токсичных растительных протеинов, которые каталитически инактивируют рибосомы эукариотических организмов (Stirpe и Barbieri, 1986). RIP функционируют в качестве N-гликозидаз, осуществляя удаление определенного аденина в консервативной петле большой молекулы рРНК и тем самым предупреждает связывание фактора удлинения 2, блокируя в результате синтез клеточного протеина.

Описаны три формы RIP. RIP типа 1, такие как антивирусный протеин фитолакки американской (РАР) и ингибитор трансляции ячменя, каждый из которых имеет одну полипептидную цепь, величина относительной молекулярной массы (M_r) которой составляет примерно 30000. Все RIP типа 2, такие как рицин, абрин и модекцин, имеют по две полипептидные цепи. Один обладающий RIP-активностью полипептид (А-цепь) связывают с помощью дисульфидного мостика со связывающим галактозу лектином (Б-цепь; Stirpe и др., 1978). Величина М_r каждого RIP типа 2 составляет примерно 60000. RIP типа 3, такие как RIP кукурузы, имеют одну полипептидную цепь, которая затем подвергается протеолитическому расщеплению с высвобождением двух активных пептидных доменов.

Фитолакка американская (Phytolacca americana) продуцирует три различных антивирусных протеина, а именно PAP', PAPII и PAP-S, которые характерны для весенних листьев, летних листьев и семян соответственно. Установлено сходство аминокислотных последовательностей этих протеинов. В контексте настоящего описания "РАР" относится ко всем трем этим антивирусным протеинам. РАР' или PAPII находятся в матриксе клеточной оболочки мезофильных клеток листа и их можно выделять с помощью водной экстракции мацерированной листовой ткани (Ready и др., 1986). Было установлено, что при их экзогенном нанесении на поверхность листьев растений можно осуществлять защиту нескольких различных растений-хозяев от заражения широким спектром вирусов (Chen и др., 1991; Lodge и др., 1993).

В патенте US 6015940 описано создание клона кДНК РАР', полученного из весенних листьев фитолакки американской, и его применение под контролем конститутивного промотора (либо промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, либо промотора 35S вируса мозаики норичника шишковатого) для получения трансгенных растений табака и картофеля, устойчивых к вирусам полиомы PVX и PVY. В качестве негативной характеристики устойчивого фенотипа следует отметить, что у растений, уровни экспрессии РАР' которых превышали 10 нг/мг протеина, обнаружена крапчатость листьев и задержка роста. Растения, накапливающие более высокие уровни РАР', были стерильными.

Трансгенные растения, содержащие характерные для летних листьев формы РАР, т.е. PAP-II, описаны в WO 99/60843. Большое количество полноразмерных и укороченных генных последовательностей PAP-II подвергали скринингу для выявления таких вариантов протеинов PAP-II, которые сохраняли антивирусную активность, но не обладали фитотоксичностью. Трансгенные растения обладали как антивирусной, так и фунгицидной активностью.

Ген РАР сначала экспрессируется в листьях in vivo с получением неактивного протеина Pro-РАР. Известно, что после трансляции происходит направленный перенос молекулы протеина Pro-РАР' в клеточную оболочку. На определенной стадии этого процесса N- и С-концевые удлиняющие сегменты молекулы Pro-РАР' отщепляются с образованием активированной молекулы РАР' (зрелый РАР'). Для PAP-S (который экспрессируется в семенах) известна клеточная локализация. Однако N-концевая процессированная область PAP-S, вероятно, имеет свойства, аналогичные свойствам сигнальных последовательностей, обеспечивающих направленный перенос.

Строение зрелого протеина PAP-S, т.е. протеина, у которого удалены N- и С-концевые удлиняющие сегменты, можно охарактеризовать наличием двух отдельных доменов, соответствующих RIP типа 3 или двум полипептидам RIP типа 2, т.е. домена связывания рибосомы и каталитического домена. Указанные в настоящем описании молекулы представляют собой рекомбинантные молекулы PAP-S, содержащие либо последовательность PAP-S α, либо последовательность PAP-S β. Исходя из структурных особенностей, можно предположить, что PAP-S α содержит области распознающего РНК мотива и домена связывания рибосомы, а PAP-S β содержит сайт имеющего решающее значение для катализа остатка. При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что экспрессия только либо протеина PAP-S α, либо протеина PAP-S β приводит к значительному ингибированию активности рибосом.

Настоящее изобретение относится к способу индукции некротического действия в специфических клетках растения, согласно которому растение трансформируют химерным геном, где кодирующая последовательность гена кодирует зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент, этот ген содержит промотор, который проявляет активность в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате чего зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент экспрессируются в специфических клетках растения.

Настоящее изобретение относится также к растению, трансформированному химерным геном, причем кодирующая последовательность гена кодирует зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент, этот ген содержит промотор, который проявляет активность в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате этот зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент экспрессируются в специфических клетках растения.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантной растительной клетке, трансформированной химерным геном, где кодирующая последовательность гена кодирует зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент, этот ген содержит промотор, который проявляет активность в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате этот зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент экспрессируются в специфических клетках растения.

Кроме того, настоящее изобретение к выделенной молекуле ДНК, содержащей химерный ген, где кодирующая последовательность гена кодирует зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент, этот ген содержит промотор, который проявляет активность в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате этот зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент экспрессируются в специфических клетках растения.

Настоящее изобретение относится также к биологически функциональному экспрессионному вектору, содержащему химерный ген, причем кодирующая последовательность гена кодирует зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент, этот ген содержит промотор, который проявляет активность в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате этот зрелый антивирусный протеин фитолакки американской или его фрагмент экспрессируются в специфических клетках растения.

В контексте настоящего описания понятие "фрагмент" обозначает фрагмент гена, кодирующего антивирусный протеин фитолакки американской, причем этот фрагмент обладает активностью в отношении ингибирования синтеза протеинов.

Химерный ген предпочтительно кодирует зрелый протеин PAP-S, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 3, а аминокислотная последовательность представлена в SEQ. ID. No. 4, или PAP-S α, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 5, а аминокислотная последовательность представлена в SEQ. ID. No. 6, или PAP-S β, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 7, а аминокислотная последовательность представлена в SEQ. ID. No. 8, или зрелый протеин РАР' или его вариант, описанный в патенте США 6015940 (т.е. нуклеотиды 290-1076 SEQ. ID. No. 30 и 31), или зрелый протеин PAPII, описанный в международной заявке на патент WO 99/60843 (т.е. нуклеотиды 75-903 SEQ. ID. No. 32).

В зависимости от требуемой гомологии нуклеотидных последовательностей можно применять различные условия строгости гибридизации для скрининга аналогичных последовательностей. В качестве примера (но не ограничиваясь ими) для процесса гибридизации используют следующие строгие условия: гибридизация со связанной с фильтром ДНК в 0,5М NaHPO₄, 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТК при 65°С и отмывка в 0,1×SSC/0,1% ДСН при 68°С (Ausubel F.M. и др., (ред.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, том I, изд-во Green Publishing Associates, Inc. и John Wiley и Sons, Inc., New York, c.2.10.3). Другие строгие условия, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Можно применять процессы гибридизации в следующих условиях умеренной строгости: гибридизация со связанной с фильтром ДНК в 0,5М NaHPO₄, 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТК при 65°С и отмывка в 0,2×SSC/0,l% ДСН при 42°С (Ausubel и др., 1989, выше). Другие условия умеренной строгости, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Для процессов гибридизации можно применять другие растворы, такие как стандартный раствор хлорида и цитрата натрия (SSC) или хлорида натрия и фосфата ЭДТК (SSPE).

Приемлемые гомологичные последовательности представляют собой последовательности, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно на 80% и еще более предпочтительно на 90 или 95% гомологичны каждой из приведенных в настоящем описании последовательностей, причем такие гомологичные последовательности сохраняют требуемую ферментативную активность.

Приемлемые последовательности могут также представлять их варианты. Согласно настоящему изобретению вариант может представлять собой любую замену, вариацию, модификацию, замещение или делецию или добавление одной или нескольких нуклеотидов/аминокислот, позволяющую получать последовательность, которая экспрессирует или проявляет требуемую ферментативную активность. Согласно изобретению можно также использовать производное или мутацию. Производное имеет определенные модификации, как правило химические, по сравнению со встречающимся в естественных условиях полипептидом, экспрессируемым нуклеиновой кислотой.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции некротического действия в специфических клетках растения, где растение трансформируют двумя химерными генами, причем кодирующая последовательность одного из указанных генов кодирует инактивированный антивирусный протеин фитолакки американской, а кодирующая последовательность другого из указанных генов кодирует вторую молекулу, которая представляет собой активатор инактивированного антивирусного протеина фитолакки американской, каждый из двух генов содержит промотор, причем эти промоторы действуют совместно в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате этот инактивированный антивирусный протеин фитолакки американской активируется в специфических клетках растения.

Настоящее изобретение относится также к растению, трансформированному двумя химерными генами, причем кодирующая последовательность одного из указанных генов кодирует инактивированный антивирусный протеин фитолакки американской, а кодирующая последовательность другого из указанных генов кодирует вторую молекулу, которая представляет собой активатор инактивированного антивирусного протеина фитолакки американской, каждый из двух генов содержит промотор, причем эти промоторы действуют совместно в ответ на специфическое раздражающее воздействие на это растение, в результате этот инактивированный антивирусный протеин фитолакки американской активируется в специфических клетках растения.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантной растительной клетке, выделенной молекуле ДНК двух химерных генов и к биологически функциональному экспрессионному вектору, содержащему два химерных гена, где каждый химерный ген подпадает под второй объект настоящего изобретения.

В контексте настоящего описания понятие "инактивированный антивирусный протеин фитолакки американской" обозначает зрелый антивирусный протеин фитолакки американской, такой, например, как PAP-S, функционально связанный с гетерологичной или гомологичной N-или С-концевой блокирующей последовательностью.

Химерный ген предпочтительно кодирует зрелый протеин PAP-S, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 3, а аминокислотная последовательность представлена в SEQ. ID. No. 4, или PAP-S α, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 5, а аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 6, или PAP-S β, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 7, а аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ. ID. No. 8, или зрелый PAP' или его вариант, описанный в патенте США 6015940 (т.е. нуклеотиды 290-1076 SEQ. ID. No. 30 и 31), или зрелый PAPII, описанный в международной заявке, опубликованной под No. WO 99/60843 (т.е. нуклеотиды 75-903 SEQ. ID. No. 32), каждый связанный с гетерологичной или гомологичной N- или С-концевой блокирующей последовательностью, как описано выше для получения инактивированного антивирусного протеина фитолакки американской.

Концевая блокирующая последовательность предпочтительно представляет собой последовательность, которая может оказывать дополнительное некротическое действие на клетку или патоген.

Предпочтительно концевая блокирующая последовательность представляет собой последовательность оризацистатина (Δ86 последовательность цистатина), представленную в настоящем описании как SEQ. ID. No. 17. Последовательность Δ86 цистатина блокирует действие встречающихся в естественных условиях протеаз, предотвращая тем самым встречающуюся в естественных условиях экспрессию кодирующей последовательности РАР. Цистатины представляют собой небольшие (˜100 аминокислот) ингибиторы протеинов цистеиновых протеаз, которые обнаружены во многих видах растений [Ryan, 1990; Richardson, 1991], и большого количества генов (>60), последовательность которых установлена. Фитоцистатины представляют собой класс, отличный от цистатинов типа I и II [Kondo и др., 1991]. Оризацистатин I (ОС-I) семян риса [Abe и др., 1987] представляет собой эффективный ингибитор, однако существенно менее эффективный, чем цистатины животных, такие как цистатин из белка куриных яиц (CEWC). Описаны рекомбинантные варианты ОС-1, полученные с помощью конструирования протеинов (Uwrin и др., 1995), и делеционный мутант Δ-Asp86 (ОС-1Δ86), обладающий более высокой ингибирующей активностью.

В другом варианте концевая блокирующая последовательность представляет собой только молекулу, инактивирующую молекулу зрелого РАР. Предпочтительно блокирующая концы последовательность представляет собой встречающуюся в естественных условиях концевую последовательность Pro-РАР, полученную из любой молекулы Pro-РАР.

Блокирующая последовательность может быть локализована на N-конце или на С-конце зрелой последовательности РАР.

Предпочтительно блокирующая последовательность представляет собой С-концевую блокирующую последовательность.

Для обеспечения реактивации блокированной последовательности зрелого РАР в инактивированном антивирусном протеине фитолакки американской также должен присутствовать специфический сайт расщепления, локализованный между последовательностью зрелого антивирусного протеина фитолакки американской и блокирующей последовательностью. Сайт расщепления предпочтительно локализован между зрелым антивирусным протеином фитолакки американской и блокирующей последовательностью.

Предпочтительно специфический сайт расщепления представляет собой сайт расщепления, специфический для протеазы NIa вируса табачной гравировки (TEV) (Carrington и Dougherty, 1998), представленный в настоящем описании как SEQ. ID. NO. 28 и SEQ. ID. No. 29. Распознаваемый указанной протеиназой сайт представляет собой гептапептид Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Gly или гептапептид Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Ser, причем расщепление происходит между остатками Gin и Gly (или Ser).

Кодирующая последовательность второй молекулы предпочтительно представляет собой протеазу, которая обладает способностью расщеплять специфический сайт расщепления. Когда специфический сайт расщепления представляет собой сайт расщепления протеазой (PCS) TEV, то протеаза может представлять собой NIa-протеазу TEV. Специалисты в данной области могут использовать другие специфические сайты расщепления протеазами. Например, сайтспецифическую протеазу энтерокиназу можно применять для расщепления соответствующего сайта расщепления, связанного со зрелым антивирусным протеином фитолакки американской.

Согласно одному из объектов изобретения указанное раздражающее воздействие на растение может быть вызвано нападением патогена. В другом варианте раздражающим воздействием может быть химическая индукция или индукция в результате естественного развития растения.

Как должно быть очевидно специалистам в данной области, первый и второй объекты изобретения могут найти широкое применение для всех представителей растительного царства с целью защиты их, например, от грибов, нематод, бактерий и вирусов, а также для других целей.

Следует понимать, что в контексте настоящего описания понятие "некротическое действие" подразумевает значительное нарушение метаболизма, чтобы при применении изобретения достигать требуемого воздействия, например обеспечивать защиту от болезней.

Предпочтительно согласно второму объекту настоящего изобретения промоторы (двухкомпонентная система) имеют перекрывающуюся (иеся) зону(ы) экспрессии. Характеристики перекрывающейся экспрессии двух промоторов и их соответствующие реакции на указанные воздействия являются такими, что они оказывают воздействие на направление экспрессии инактивированного антивирусного протеина фитолакки американской и его молекулы-активатора, приводящие к тому, что летальное или вредное воздействие затрагивает специфические клетки и только их.

В другом варианте промоторы могут иметь одни и те же сайты экспрессии или экспрессируемые протеины могут иным образом накапливаться в области-мишени.

Третьим объектом настоящего изобретения является способ индукции некротического действия в специфических клетках растения, согласно которому растение трансформируют химерным геном, при этом кодирующая последовательность гена кодирует предшественник молекулы РАР или ее С-концевого делеционного варианта, причем ген содержит промотор, который проявляет действие в ответ на специфическое раздражающее воздействие на растение, в результате экспрессируемый кодирующей последовательностью протеин экспрессируется в специфических клетках растения, причем указанный промотор следует выбирать таким образом, чтобы обеспечивать одно из следующих воздействий: снижение вредоносного действия нематод, стерильность, изменения в морфологии цветка, отделение (листьев или плодов), сбрасывание семян или развитие трихом.

Настоящее изобретение относится также к растению, трансформированному согласно методу, который является третьим объектом изобретения. Настоящее изобретение относится также к рекомбинантной растительной клетке, выделенной ДНК химерного гена и биологически функциональному экспрессионному вектору, где они все содержит химерный ген, описанный в третьем объекте изобретения.

Согласно третьему объекту изобретения кодирующая последовательность предпочтительно кодирует одну из следующих последовательностей: нуклеотидную последовательность Pro-PAP-S, представленную в SEQ. ID. No. 1, и аминокислотную последовательность, представленную в SEQ. ID. No. 2, или PAP' или его варианта, описанного в патенте США 6015940, который имеет последовательность, представленную в SEQ. ID. No. 30 и 31, или PAPII, последовательность которого описана в международной заявке на патент, опубликованной под No. WO 99/60843 и представленной в настоящем описании как SEQ. ID. No.32.

Выбор приемлемых промоторов должен зависеть от выбора специфических клеток. Если целью является защита от нападения нематод, то специфические клетки могут представлять собой клетки областей, которыми питаются нематоды. В этом случае согласно второму объекту изобретения приемлемые промоторы могут представлять собой промотор KNT1, действующий совместно с промотором TobRB7. Согласно первому и третьему объектам изобретения эти промоторы можно применять по отдельности. Метод выделения промотора KNT1 описан в новозеландском патенте 260511, а также дополнительно описан ниже, а метод выделения промотора TobRB7 описан в международной заявке на патент WO 94/17194. Объект изобретения указанной заявки, касающийся выделения промотора, включен в настоящее описание в качестве ссылки. Приемлемыми промоторами являются также промоторы Lemmi, выделение которых описано в международной заявке на патент, опубликованной под No. WO 92/21757.

Согласно второму объекту, например, кодирующая последовательность антивирусного протеина фитолакки американской может находиться под контролем промотора TobRB7, в то время как кодирующая последовательность молекулы-активатора под контролем промотора KNT1. Промотор KNT1 обеспечивает экспрессию в клетках областей, которыми питаются нематоды, кончиках корней и в меньшей степени в других видах меристемы, в то время как промотор TobRB7 обеспечивает экспрессию в корнях и гигантских клетках (Conkling и др., 1990). В указанных исследованиях продемонстрировано, что промотор TobRB7 может осуществлять экспрессию в массе корня, но не в кончиках корня. Таким образом, зоной перекрывающейся экспрессии промоторов KNT1 и TobRB7 являются гигантские растительные клетки (клетки областей, которыми питаются нематоды).

В другом варианте, когда необходимо обеспечивать мужскую стерильность, специфичные клетки могут представлять собой клетки пыльника растений. Примеры приемлемых промоторов описаны у Twell и др. (1991) и Mariani и др. (1990).

Согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения область-мишень может представлять собой область, которой питаются нематоды. В случае, когда область-мишень представляет собой область, которой питаются нематоды, в качестве промотора выбирают промотор, который индуцируется в области, которой питаются нематоды, и/или в соседней области. Индукция такого промотора предпочтительно происходит при поражении растения нематодами. Примером приемлемого промотора является промотор KNT1. Другие приемлемые промоторы включают промотор TobRB7 и промоторы Lemmi.

Область, которой питаются нематоды, может включать, например, растительные клетки, находящиеся в локальной области поражения, которые впоследствии подвергаются редифференцировке, образуя синцитий (в случае цистообразующих нематод), или гигантские клетки и/или сопутствующие гипертрофические клетки (в случае галловых нематод), и/или одну или несколько клеток синцития, гигантских клеток и сопутствующих гипертрофических клеток.

При использовании в качестве мишени области, которой питаются нематоды, можно получать устойчивые к нематодам растения. Понятие "устойчивое к нематодам растение" относится к растению, которое при заражении паразитирующими на растении нематодами обладает способностью предупреждать, замедлять или иным образом оказывать отрицательное воздействие на рост и развитие нематод, поражающих растение, предупреждая тем самым достижения численности паразитирующих на растениях нематод экономически значимого уровня в период вегетации культуры. При этом подразумевается, что нематоды могут, например, погибать или жизненный цикл нематод может замедляться, что приводит к удлинению времени, необходимого для достижения половой зрелости и откладки яиц, или женские особи нематод могут иметь уменьшенный размер и вследствие этого пониженную способность к откладке яиц, которое происходит только после достижения женскими особями нематод минимального критического размера.

Настоящее изобретение применимо к следующим видам нематод (но не ограничиваясь ими): Globodera spp., Heterodera spp. и Meloidogyne spp.

Согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения способ может быть направлен не на достижение устойчивости к нематодам, а на получение мужской стерильности у растений. Например, областью-мишенью может быть один или несколько из таких органов растения, как пыльца, пыльник или тапетум. Если областью-мишенью является, например, тапетум, то выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в тапетуме и/или в соседних с тапетумом областях. Примером приемлемого для тапетума промотора является промотор ТА29 табака, описанный у Mariani и др. (1990). Специфичные для пыльника промоторы описаны у Twell и др. (1991).

Согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения способ применяют для достижения женской стерильности растений. Например, область-мишень может представлять собой семяпочку растения. Это предусматривает, что выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в семяпочке и/или соседней области. Примером приемлемого промотора является промотор AGL15, описанный у Perry и др. (1996).

Согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения оказывают воздействие на морфологическое строение цветка. Например, областью-мишенью являются определенные части цветка, при этом целью является, чтобы эти определенные части цветка не развивались и морфологическое строение цветка изменялось. В этом случае выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в чашелистике, плодолистике, лепестке и/или тычинке, или в соседних областях. Примерами приемлемых промоторов являются промоторы генов, обусловливающих бесполость (agamous), отсутствие лепестков (apetala3), шарообразность (globosa), пестичность (pistillata) и другие различные дефициты (Sieburth и Meyerowitz, 1997; Samach и др., 1997 и приведенных в этих публикациях ссылках).

Согласно пятому варианту осуществления настоящего изобретения способ по изобретению применяют для того, чтобы способствовать или усиливать абсцизию листьев и/или плодов у растений. Например, область-мишень может представлять собой отделительный слой листа и/или плода. Выбранный в этом случае промотор представляет собой промотор, который индуцируется в отделительном слое и/или в соседней области.

Согласно шестому варианту осуществления настоящего изобретения мишенью являются трихомы, при этом трихомы, как правило, являются гландулярными. Выбранный промотор представляет собой промотор, который индуцируется в трихомах и/или соседних областях. Вызывая некроз трихомов растения, можно прекращать или предупреждать производство трихомом химических субстанций.

Согласно седьмому варианту осуществления настоящего изобретения мишенью являются боковые корни, шипы или жгучие волоски.

Согласно восьмому варианту осуществления настоящего изобретения способ предназначен для борьбы с вирусной инфекцией. При вирусных инфекциях в значительной степени пораженных вирусом клетках специфично или практически специфично индуцируются многочисленные гены. Выбранный промотор представляет собой промотор, ко