Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний с использованием комбинации элиминирующего в-клетки/иммунорегуляторного антител

Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний с использованием комбинации элиминирующего в-клетки/иммунорегуляторного антител

Реферат

Родственные заявки

Данная заявка относится к и заявляет приоритет предварительной заявки США №60/233607, поданной 18 сентября 2000 г. под названием «Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний, включающая CD40L-антагонист и антитела против В7, СD19, CD20, CD22 или CD23», Nabil Hanna, и предварительной заявки №60/257147, поданной 22 декабря 2000 г. под названием «Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний с использованием комбинации элиминирующего В-клетки/иммунорегуляторного антител», Nabil Hanna.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новой комбинированной терапии для лечения аутоиммунных заболеваний. В частности, изобретение относится к комбинированному применению иммунорегуляторного антитела, предпочтительно антитела, которое модулирует дифференцировку, пролиферацию и/или функцию Т- и/или В-клеток, и/или элиминирующего В-клетки антитела для терапии аутоиммунных заболеваний. Данные антитела можно вводить по отдельности или в комбинации, и в любом порядке.

Предпосылки изобретения

В настоящее время применение антител для лечения заболеваний, включая злокачественные опухоли, особенно не-ходжкинскую лимфому, лейкозы, опосредуемые вирусом заболевания и аутоиммунные заболевания, получило широкое признание. В частности, сообщалось о применении антител против CD20 или против CD22, которые обладают способностью элиминировать клетки, для лечения злокачественных опухолей, например, не-ходжкинской лимфомы и связанных с В-клетками лимфом. Также, среди прочего, имелось сообщение об использовании элиминирующих В-клетки антител, специфичных к CD19 или CD37.

Кроме того, сообщалось о применение различных иммунорегуляторных антител, т.е. антител, которые проявляют терапевтическое действие при модуляции, т.е. усиливая или ингибируя определенный иммунный путь. Например, такие антитела модулируют дифференцировку, пролиферацию, активацию и/или функцию Т- или В-клеток, или других клеток, участвующих в регуляции иммунитета. Такие иммунорегуляторные антитела связываются с лигандом или рецептором на иммунной клетке, обычно антигеном В- или Т-клетки, который принимает участие в регуляции гуморального или клеточного иммунитета. Примерами таких лигандов являются иммунные сигнальные молекулы, такие как В7.1, В7.2, Т-клеточные регуляторные молекулы, такие, как CD40-L, CD40 и CD4. Обсуждение функции некоторых из этих антигенов и применение антител, специфичных к ним, для терапии на предшествующем уровне кратко представлено ниже.

CD40L представляет рецептор, экспрессирующийся на поверхности активации клеток-хелперов, и является противорецептором для CD40, лиганда, экспрессирующегося на поверхности В-лимфоцитов, а также других антигенпрезентирующих клеток. Зависимое от контакта взаимодействие CD40L на активированных Т-клетках с CD40, экспрессированного на В- и других антигенпрезентирующих клетках, называемое «хелперной функцией Т-клеток», приводит к активации и дифференцировке В-лимфоцитов и служит средством регуляции гуморальных иммунных ответов. Данная регуляция включает функции модуляции специфичности, секреции и изотип-зависимых функций молекул антител. Процесс, с помощью которого Т-клетки помогают В-клеткам дифференцироваться, подразделяется на две отдельные стадии: индукционную и эффекторную стадии (Vitetta et al., Adv. Immunol. 45:1 (1989); Noelle et al., Immunol. Today 11:361 (1990)).

Молекулярная основа помощи Т-клеток в гуморальном иммунитете посредством взаимодействия CD40 и его лиганда gp39 (также известен, как CD40L и CD154) в настоящее время хорошо понятна. В основном, известно, что активированные Т-хелперные клетки экспрессируют гены лимфокина и CD40L, мембранный белок, который важен для взаимной активации родственных, антигенпрезентирующих В-клеток. Взаимодействие CD40L с его рецептором CD40 на В-клетках стимулирует поступление В-клеток и индуцирует реактивность В-клеток воздействию лимфокинов к росту и дифференцировки.

Кроме того, известно, что CD40L играет большую, более важную роль в иммунных процессах, связанных с Т-клетками, т.е. помимо его роли в помощи Т-клеткам и регуляции гуморального иммунитета. Данная роль CD40L не совсем понятна. Например, имеется теория о том, что патология опосредованных через Т-клетки аутоиммунных заболеваний, включая, например, рассеянный склероз, диабет типа 1, воспалительное заболевание кишечника, оофорит и тиреоидит, включает наличие определенного лиганда CD40, экспрессирующегося популяцией супрессорных Т-клеток, которые играют роль в патологии заболевания, возможно, за счет подавления роли эффекторных Т-клеток. Кроме того, сообщалось о роли CD40 и CD40L в периферической и центральной крови в толерантности и участии в развитии аутоиммунных заболеваний (Durie et al., Res. Immunol. Vol.145 (3):200-205 (1994)).

Сообщалось о применении антагонистов CD40L для лечения опосредуемых В-клетками и опосредуемых Т-клетками аутоиммунных заболеваний. Например, в Европейском патенте 555880, патенте США 5474771 и WO 93/09212 раскрывается применение антагонистов CD40L для лечения гуморального аутоиммунного заболевания. Применение антагонистов CD40L для лечения опосредуемых Т-клетками аутоиммунных заболеваний раскрывается в патенте США 5833987 и его аналоге - РСТ/US96/09В7.

Как обсуждалось выше, также сообщалось о применении в качестве лекарственных средств молекул, которые специфически связываются с мишеневыми антигенами на В-лимфоцитах и которые элиминируют В-клетки. Возможно, наиболее признанной мишенью В-клеток для терапии является антиген CD20, получивший разрешение FDA на применение ритуксан^®, химерное моноклональное антитело, направленное против антигена CD20 для лечения не-ходжкинской лимфомы.

Антиген CD20 (также называемый антигеном ограниченной дифференцировки человеческих В-лимфоцитов, -р-33) представляет гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой примерно 35 кДа, расположенный на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264 (19):11282-11287 (1989); and Einfeld et al., EMBO et al., EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). Антиген также экспрессируется более чем на 90% в В-клетках не-ходжкинской лимфомы HL, Anderson et al., Blood 63(6):1424-1433 (1984), но он не обнаружен на гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках и клетках других нормальных тканей (Tedder et al., J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD20 регулирует начальные стадии активации для инициации клеточного цикла и дифференцировки (Tedder et al., выше) и, возможно, функционирует в качестве кальциевых ионных каналов (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D:195(1990)).

При экспрессии CD20 в В-клетках лимфомы, данный антиген может служить в качестве кандидата для "целенаправленного" воздействия на такую лимфому. В сущности, подобное целенаправленное воздействие может осуществляться следующим образом: антитела, специфичные к поверхностному антигену CD20 В-клеток, вводят пациенту; данные антитела против CD20 специфично связываются с антигеном CD20 (по видимости) как нормальных, так и злокачественных В-клеток; и антитела, связанные с поверхностным антигеном CD20, приводят к разрушению и элиминации злокачественных В-клеток. Кроме того, химические средства или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, можно конъюгировать с антителами против CD20, таким образом, чтобы препарат специфично «доставлялся» к злокачественным В-клеткам. Независимо от подхода, основной целью является разрушение опухоли; конкретный подход можно определить использованием конкретных антител против CD20 и таким образом, доступные подходы к целенаправленному воздействию на антиген CD20 могут в значительной степени варьировать.

CD19 представляет другой антиген, который экспрессируется на поверхности клеток В-линий дифференцировки. Как и CD20, CD19 обнаружен на клетках во время дифференцировки линий со стадии стволовых клеток до точки, непосредственно предшествующей конечной дифференцировке в плазматические клетки (Nadler L., Lymphocyte Typing II2:3-37 and Appendix, Renling et al., eds. (1986) by Springer Verlag). В отличие от CD20, антитела, связывающиеся с CD19, вызывают интернализацию антигена CD19. Антиген CD19 идентифицируется антителами HD237-CD19 (также называемыми антителами «В4») (Kiesel et al., Leukemia Research II, 12:1119 (1987)), среди прочего. CD19 присутствует у 4,8% мононуклеарных клеток периферической крови и более чем у 90% В-клеток, выделенных из периферической крови, селезенки, лимфатических узлов или миндалин. CD19 не обнаружен в Т-клетках периферической крови, моноцитах или гранулоцитах. Фактически все не-Т-клеточные острые лимфобластные лейкозы (ALL), В-клеточные хронические лимфоцитарные лейкозы (CLL) и В-клеточные лимфомы экспрессируют CD19, обнаруживаемый антителом В4 (Nadler et al., J. Immunol. 131:244 (1983); and Nadler et al. in Progress in Hematology Vol.XII pp.187-206. Brown, E. ed. (1981) by Grune & Stratton, Inc.

CD22 представляет другой антиген, который экспрессируется на поверхности клеток В-линий дифференцировки. Данный антиген также называют «BL-CAM» и «LyB8». Данный антиген является мембранным связанным с иммуноглобулином белком, имеющим молекулярную массу около 140000, который фосфорилирован по тирозину, когда он лигирован с поверхностным Ig (Engel et al., J. R&PMed 181(4):1521-1526 (1995); Campbell and Eur. J. Immunol. 25:1573). Сообщалось, что данный антиген является отрицательным регулятором сигнальной передачи рецепторов В-клеток (Nitschke et al., Curr. Biol. 7:133 (1997) и способствует атизму моноцитов и эритроцитов (Stamenkovich et al. Nature 345:74(1990)). Чистое антитело, специфическое к CD22, называемое лимфоцидом^™, находится в настоящее время на стадии клинических испытаний для лечения медленно текущей не-ходжкинской лимфомы, производства Immunomedics, Inc. Также на стадии клинических испытаний находится меченная иттрием 90 форма данного антитела для лечения медленно текущей и агрессивной не-ходжкинской лимфомы.

CD23 представляет еще один антиген, экспрессирующий на В-клетках, и является рецептором с низкой аффинностью для IgE, также известный, как FcERII. В патентной и непатентной литературе предложено применение антител, которые связываются с CD23 для лечения воспалительных, аутоиммунных и аллергических заболеваний.

В7.1. и В7.2. представляют другие примеры антигенов В-клеток, в отношении которых сообщалось об использовании лигандов, которые специфично связываются и которые действуют в качестве иммунорегуляторов, обладающих лечебной применимостью. В частности, сообщалось, что анти-В7, особенно которые связываются с В7.1 (CD80), В7.2 (CD86) или В7.3 трансмембранными гликопротеинами, экспрессирующимися на поверхности В-клеток, обладают потенциалом применяться в качестве иммуносупрессоров и для лечения различных заболеваний. Например, в патенте США 5869040, опубликованном 9 февраля 1999 г., DeBoer et al. и принадлежащем Chiron Corporation, раскрывается применение антител против В7.1 в комбинации с другим иммуносупрессором для лечения отторжения трансплантата, болезни «трансплантат против хозяина» и ревматоидного артрита. Кроме того, в патенте США 5885579, опубликованном 23 марта 1999 г., Linsley et al., раскрывается лечение иммунных заболеваний, в котором участвуют взаимодействия Т-клеток с В7-положительными клетками введением лиганда, специфического для антигена В7, например, В7.1 (CD80) или В7.2 (CD86).

Кроме того, в патенте США 6113198 Anderson et al., раскрывается применение антител, специфичных для антигена В7.1, которые в противоположность антителам против В7 не ингибируют взаимодействие В7.1/CTLA-4 и пригодны для лечения заболеваний, включая аутоиммунные заболевания. Однако не раскрывается комбинированное применение данных антител с антителом, специфичным к CD40L, как и не сообщается о применении антител в сочетании с антителами, элиминирующими В-клетки.

Антитело ритуксимаб (ритуксан^®), в частности, представляет рекомбинантное химерное мышиное/человеческое моноклональное антитело, направленное против антигена CD20. Ритуксан^® предназначен для лечения пациентов с рецидивной или рефракторной, или фолликулярной, CD20 положительной В-клеточной не-ходжкинской лимфомой (патент США №5736 В7, опубликованный 7 апреля 1998 г., Anderson et al.). При изучении механизма действия в условиях in vitro было показано, что ритуксан^® связывается с человеческим комплементом и лизирует лимфоидные В-клеточные линии посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Кроме того, оно обладает существенной активностью в тестах на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Недавно было показано, что ритуксан^® обладает антипролиферативной активностью в тестах по включению меченного тритием тимидина и непосредственно индуцирует апоптоз; в то время, как другие антитела против CD19 и CD20 нет (Maloney et al. Blood 88(10):637a (1996)). В эксперименте также наблюдали синергизм между ритуксаном^® и химиотерапией, и токсинами. В частности, ритуксан^® сенсибилизировал резистентные к препаратам человеческие В-клеточные лимфомы к цитотоксическому действию доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)). В условиях in vivo ритуксан^® очень эффективно элиминирует В-клетки из периферической крови, лимфоузлов и костного мозга макаков-крабоедов, в основном посредством процессов, опосредуемых комплементом и клетками (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)).

Perrotta и Abuel Blood:92 Abstract # 3360, 40-ая ежегодная встреча ASH (ноябрь 1998 г.), представляют неизвестное ранее сообщение о пятидесятилетней женщине с идиопатической тромбоцитопенической пурпуре (ITP), поддавшейся лечению ритуксаном^®.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к лечению аутоиммунного заболевания, предпочтительно опосредуемого В-клетками аутоиммунного заболевания, с использованием комбинации, по меньшей мере, одного иммунорегуляторного антитела и по меньшей мере одного элиминирующего В-клетки антитела, например, антитела, направленного к CD20, CD19, CD22, CD23 или CD37. Введение данных антител по отдельности или в комбинации проявляет синергитическое действие при использовании для лечения аутоиммунных заболеваний. Это происходит потому, что элиминирующее В-клетки антитело приводит к снижению числа В-клеток и, следовательно, уменьшает количество циркулирующего IgE и других антител, которые принимают участие в патологии аутоиммунитета. Однако элиминирующее В-клетки антитело, например, ритуксан^®, приводит к предпочтительному элиминированию активированных В-клеток. В противоположность иммунорегуляторные антитела, например, антитела против В7 и против CD40L проявляют их иммунорегуляторный эффект, т.е. иммуносупрессию в отношении неактивированных В-клеток, т.е. неактивированных антигенпрезентирующих В-клеток. Следовательно, предполагается, что применение двух функционально различных типов антител будет проявлять синергитическое действие в том плане, что оно будет способствовать удалению как активированных, так и неактивированных В-клеток из кровотока. Тем самым уровень циркулирующих антител будет значительно снижен, поскольку будет в значительной мере уменьшен уровень антителопродуцирующих В-клеток. Это будет приводить к существенному лечебному эффекту особенно при аутоиммунных заболеваниях, при которых В-клетки и, конкретнее, аутоантитела принимают активное участие в патологии заболевания.

Как обсуждается ниже, предпочтительные иммунорегуляторные антитела включают антитела против В7.1 или против В7.2, против CD40, против CD40L и против CD4. Предпочтительные примеры элиминирующих В-клетки антител включают специфичные к CD20, CD19, CD21, CD37 и CD22.

В его самом широком аспекте изобретение обеспечивает комбинированную терапию для лечения аутоиммунного заболевания, например, ревматоидного артрита, SLE, ITP, комбинированным применением i) иммунорегуляторного антитела, предпочтительно которое ингибирует неактивированные В-клетки; и ii) элиминирующего В-клетки антитела, где каждые антитела можно вводить по отдельности или в комбинации и в любом порядке.

В более конкретном аспекте изобретение включает лечение аутоиммунного заболевания комбинированным применением i) антитела против В7.1 или В7.2 и/или против CD40L и ii) элиминирующего В-клетки антитела, выбранного из анти-CD20, анти-CD19, анти-CD22 и анти-CD37.

Дополнительно изобретение относится к предметам производства для лечения аутоиммунных заболеваний, которые включают контейнер и одну или более композиций, содержащихся в них, которые включают эффективное количество иммунорегуляторного антитела, например, антитела против CD40L или против В7.1, или против В7.2 (иммунорегуляторного антитела) и элиминирующего В-клетки антитела или его фрагмента, анти-CD20, анти-CD19, анти-CD22 или анти-CD37 (элиминирующего В-клетки антитела).

Подробное описание предпочтительных воплощений

I. Определения

В данном случае «элиминирующим В-клетки антителом» является антитело или фрагмент, которые связываются с маркером В-клеток, которые при введении приводят к заметной элиминации В-клеток. Предпочтительно данное антитело после введения, обычно в течение примерно нескольких дней или менее, приведет к снижению числа В-клеток примерно на 50% или более. В предпочтительном воплощении элиминирующим В-клетки антителом будет ритуксан^® (химерное антитело против CD20) или таковое, обладающее в основном такой же или выше элиминирующей активностью. Было показано, что данное антитело обеспечивает в основном 90% элиминирование В-клеток в течение 24 ч после назначения в эффективном количестве.

Термин «иммунорегуляторное антитело» относится к антителу, которое оказывает эффект на иммунную систему механизмом, отличным от элиминации активированных В-клеток. Его примеры включают антитела, которые ингибируют Т-клеточный иммунитет, В-клеточный иммунитет, например, индукцией толерантности (анти-CD40L, анти-CD40) или другие иммуносупрессорные антитела (анти-В7.1, анти-В7.2 или анти-CD4). В некоторых случаях иммунорегуляторное антитело иммунных клеток может также обладать способностью усиливать апоптоз.

В данном случае «поверхностный маркер В-клеток» представляет антиген, экспрессирующийся на поверхности В-клеток, на который может быть целенаправленно действовать антагонист, который связывается с ним. Примерные поверхностные маркеры В-клеток включают лейкоцитарные поверхностные маркеры CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79а, CD79b, CD80 (В7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (В7.2). Особый интерес представляет поверхностный маркер В-клеток, предпочтительно экспрессирующийся на В-клетках, по сравнению с другими тканями млекопитающих, не содержащими В-клеток, и который может экспрессироваться как предшественниками В-клеток, так и зрелыми В-клетками. В одном воплощении маркер представляет таковой, как CD20 или CD19, который обнаружен на В-клетках во время дифференцировки линии из стволовой клеточной стадии до точки, предшествующей конечной дифференцировке в плазматические клетки. В данном случае предпочтительными поверхностными маркерами В-клеток являются CD19, CD20, CD23, CD80 и CD86.

Антиген «CD20» представляет негликозилированный фосфобелок с массой 35 кДа, обнаруженный на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 экспрессируется на ранней стадии развития пре-В-клеток и остается до дифференцировки в плазматические клетки. CD20 присутствует как в нормальных В-клетках, так и злокачественных В-клетках. Другие названия CD20 в литературе включают «стабильный антиген В-лимфоцитов» и «Вр35». Антиген CD20 описан Clark et al. PNAS (USA), 82:1766 (1985).

Антиген «CD19» относится к антигену с массой 90 кДа, идентифицированному, например, HD237-CD19- или В4-антителом (Kiesel et al. Leukemia Research II, 12:1119 (1987)). Подобно CD20, CD19 обнаружен на клетках во время дифференцировки линии из стволовой клеточной стадии до точки, предшествующей конечной дифференцировке в плазматические клетки. Связывание антагониста с CD19 может вызвать интернализацию антигена CD19.

Антиген «CD22» относится к антигену, экспрессирующемуся на В-клетках, также известному, как «BL-CAM» и «LybB», который принимает участие в передаче сигнала и адгезии В-клеток (смотри Nitschke et al., Curr. Biol. 7:133 (1997); Stamenkovic et al., Nature 345:74 (1990)). Данный антиген представляет мембранный, связанный с иммуноглобулином антиген, который фосфорилирован по тирозину, когда лигирован с мембранным Ig (Engel et al., J. Etyp. Med. 18(4):1521, 1586 (1995)). Клонирован ген, кодирующий данный антиген, и охарактеризованы его Ig-домены.

Антиген В7 включает антигены В7.1 (CD80), В7.2 (CD86) и В7.3, которые представляют трансмембранные антигены, экспрессирующиеся на В-клетках. В данной области известны антитела, которые специфично связываются с антигенами В7, включая человеческие антигены В7.1 и В7.2. Предпочтительные антитела к В7 включают антитела приматизед^® В7, раскрытые Anderson et al. в патенте США №6113198, принадлежащем IDEC Pharmaceuticals Corporation, а также человеческие и гуманизированные антитела к В7.

CD23 относится к рецептору IgE с низкой аффинностью, экспрессирующемуся В- и другими клетками. В настоящем изобретении CD23 предпочтительно будет человеческим антигеном CD23. В данной области также известны антитела к CD23. Наиболее предпочтительно в настоящем изобретении антитело к CD23 будет человеческим или химерным античеловеческим-CD23-антителом, включающим константные домены IgGI или IgG3, и наиболее предпочтительно элиминирующими антителами против CD23, раскрытыми в патенте США №6011138.

«Аутоиммунное заболевание» представляет доброкачественное заболевание или нарушение, возникающее из и направленное против собственных тканей индивидуума. В данном случае доброкачественные аутоиммунные заболевания особо исключают злокачественные или раковые заболевания или состояния, особенно исключая В-клеточную лимфому, острую лимфобластную лейкемию (ALL), хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL), волосатоклеточный лейкоз и хроническую миелобластную лейкемию. Примеры данных заболеваний или нарушений включают воспалительные реакции, такие как воспалительные заболевания кожи, включая псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системную склеродерму и склероз; реакции, связанные с воспалительным заболеванием кишечника (такие, как болезнь Крона и язвенный колит); синдром нарушения дыхания (включая респираторный дистресс-синдром у взрослых; ARDS); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма, и другие состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток, и хронические воспалительные реакции; атеросклероз; недостаточность адгезии лейкоцитов; ревматоидный артрит; системную красную волчанку (SLE); сахарный диабет (например, сахарный диабет типа I или инсулинзависимый сахарный диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; синдром Шегрена; ювенильный диабет и иммунные реакции, связанные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами, обычно обнаруживаемой при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, грануломатозе и васкулите; пернициозную анемию (болезнь Аддисона); заболевания, включающие лейкоцитарный диапедез; воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС); синдром множественного повреждения органов; гемолитическую анемию (включая криоглобулинемию); тяжелую псевдопаралитическую миастению; заболевания, опосредуемые комплексом антиген-антитело; антигломерулярное мембранное заболевание; антифосфолипидный синдром; аллергический неврит; болезнь Грэйвза; миастенический синдром Лэмберта-Итона; буллезный пемфигоид; пузырчатка; аутоиммунные полиэндокринопатии; болезнь Рейтера; синдром негнущегося человека; болезнь Бехчета; гигантоклеточный артериит; нефрит с иммунным комплексом; IgA-нефропатию; IgM-полиневропатии; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), аутоиммунную тромбоцитопению и оофорит.

«Антагонист» В-клеток представляет молекулу, которая при связывании с поверхностным маркером В-клеток разрушает или элиминирует В-клетки у млекопитающего и/или нарушает одну или более функций В-клеток, например, снижая или предупреждая гуморальный ответ, проявляемый В-клетками. В противоположность элиминирующее В-клетки антитело удаляет В-клетки (т.е. снижает число циркулирующих В-клеток) у млекопитающего, обработанного им. Такую элиминацию можно достичь различными механизмами, такими как антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индукция гибели В-клеток (например, апоптозом). Антагонисты в объеме настоящего изобретения включают антитела, пептиды с синтетической или природной последовательностью и небольшие молекулы-антагонисты, которые связываются с маркером В-клеток, необязательно конъюгированные с или слитые с цитотоксическим агентом.

Антагонист CD40L представляет молекулу, которая специфично связывается с CD40L, и предпочтительно мешает взаимодействию CD40L и CD40. Их примеры включают антитела и фрагменты антител, которые специфично связываются с CD40L, растворимый CD40, растворимые слитые белки CD40 и небольшие молекулы, которые связываются с CD40L. Предпочтительный антагонист по изобретению включает антитело или фрагмент антитела, специфического к CD40.

«Антигензависимая опосредуемая клетками цитотоксичность» или «ADCC» относится к опосредуемой клетками реакции, при которой неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcRs) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Основные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR в гемопоэтических клетках представлена в обобщенном виде в таблице 3 на стр. 464 у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки интересующей молекулы на ADCC-активность можно провести ADCC-тест in vitro, как описано в патентах США №5500362 или 5821337. Подходящие эффекторные клетки для таких тестов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно интересующую молекулу на ADCC-активность можно оценить in vivo, например, на модели на животных, раскрытой Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Человеческие эффекторные клетки» представляют лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры человеческих лейкоцитов, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при том, что предпочтительными являются клетки РВМС и NK. Эффекторные клетки можно выделить из их естественного источника, например, из крови или РВМС, как здесь описано.

Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используются для обозначения рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительный FcR представляет естественную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительным FcR является таковой, который связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы данных рецепторов. FcγRII-рецепторы включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRUB («ингибирующий рецептор»), которые имеют одинаковые аминокислотные последовательности, которые различаются в основном по их цитоплазматическим доменам. Активирующий FcγRIIA-рецептор включает мотив активации на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий FcγRUB-рецептор включает мотив ингибирования на основе тирозина иммунорецептора в его цитоплазматическом домене. (Смотри обзор M.Daeon, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор по FcR имеется у Ravetch and Kiner, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая таковые, которые будут идентифицированы в будущем, объединены здесь термином «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который ответственен за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

«Комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь с активацией комплемента начинается со связывания первого компонента комплементарной системы (Clq) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно провести CDC-тест, например, как описано у Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

«Ингибирующими рост» антагонистами являются таковые, которые предупреждают или подавляют пролиферацию клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается антагонист. Например, антагонист может предупредить или уменьшить пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

Антагонистами, которые «индуцируют апоптоз», являются таковые, которые индуцируют запрограммированную гибель клеток, например, В-клеток, что определяют по связыванию с аннексином V, фрагментации ДНК, сморщиванию клеток, расширению эндоплазматического ретикулюма, фрагментации клеток и/или образованию мембранных пузырьков (называемых апоптозными тельцами).

В данном случае термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

«Фрагменты антитела» включают часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab'-, F(ab')²- и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

«Естественные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами с массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковых тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время, как число дисульфидных связей варьирует среди тяжелых цепей иммуноглобулинов различных изотипов. Также каждая тяжелая и легкая цепь имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует число константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VL) и константный домен на другом ее конце; константный домен легкой цепи расположен по одной линии с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи расположен по одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин «вариабельный» относится к факту, что определенные участки вариабельных доменов в значительной степени различаются по последовательности среди антител, и используются при связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность распределена неравномерно в вариабельных доменах антител. Она концентрируется в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, как в вариабельных доменах легкой цепи, так и тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов естественной тяжелой и легкой цепей включает четыре FR, в основном имеющих 13-складчатую конфигурацию, соединенных с тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющиеся и в некоторых случаях образующие часть В-складчатой структуры. Гипервариабельные участки в каждой цепи поддерживаются вместе в тесной пространственной близости с помощью FR и с гипервариабельными участками другой цепи, участвуя в образовании антигенсвязывающего сайта антител (смотри Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции такие, как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

В результате расщепления антител папаином получается два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим сайтом, и остаточный «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином дает F(ab')²-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих сайта и по-прежнему способен перекрестно связываться с антигеном.

«Fv» представляет минимальный фрагмент антитела, который включает полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Данный участок состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в близкой, нековалентной связи. Он находится в такой конфигурации, что три гипервариабельных участка каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. Совместно шесть гипервариабельных участков придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три гипервариабельных участка, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя, с меньшей аффинностью, чем связывающий сайт целиком.

Fab-фрагмент также включает константный домен легкой цепи и первый константный домен (CHI) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CHI тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данном случае Fab'-SH является обозначением Fab', в котором цистеиновый остаток(и) константных доменов имеет по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. Fab'Z-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пары Fab'-фрагментов, которые имеют между ними шарнирные цистеины. Известны также другие химические связи фрагментов антитела.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) позвоночных можно приписать к одному из двух четко различаемых типов, названных каппа и лямбда, на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела можно причислить к различным классам. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называют соответственно альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Предпочтительно константные домены тяжелой цепи будут включать гамма-1, гамма-2, гамма-3 и гамма-4 константные области. Предпочтительно, чтобы данные константные домены также включали модификации для повышения стабильности антитела такие, как Р- и Е-модификация, раскрытые в патенте США №6011138, включенном здесь полностью путем ссылки. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антитела включают домены VH и VL антитела, где данные домены находятся в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, чтобы полипептид Fv дополнительно включал полипептидный линкер между доменами VH и VL, который способствует scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор по scFv смотри у Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты образуют вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом (VL) легкой цепи в одной полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким для объединения двух доменов в одной цепи, домены принуждают к конъюгации с комплементарными доменами другой цепи и созданию двух антигенсвязывающих сайтов. Более полно диатела описаны, например, в Европейском патенте 404097; WO 93/11161 и у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело», в том смысле, в котором он здесь используется, относится