Штамм вируса гриппа а/17/ вайоминг/03/8(h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
Изобретение относится к области вирусологии и медицины. Заявлен штамм вируса гриппа А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2). Штамм получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии сыворотки к вирусу А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Полученный штамм является температурочувствительным и холодоадаптированным. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Изобретение может быть использовано в медицине для производства гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 1 ил., 3 табл.
Реферат
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2).
Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (H3N2) - прототип [Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Науменко З.С., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ №2159812 от 27.11.2000. Опубл. БИ 2000. - №33] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2).
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2).
Вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.].
Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 40°С составляет 8,5 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 25°С равна 3,5 lg ЭИД50/0,2 мл).
Один из двух поверхностных белков вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.
Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов установлено, что вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) унаследовал все шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS) от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки - нейраминидазу (NA) - он унаследовал от эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2). Рестрикционный метод [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J.Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49] основан на амплификации участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), но не для современных эпидемических вирусов гриппа. Обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофорезом обработанных рестриктазами фрагментов ДНК в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида, позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
На чертеже в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РА эндонуклеазой Asn I. 1-я дорожка - ДНК маркер молекулярного веса IX; 2-я, 5-я и 8-я дорожки - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); 3-я и 7-я дорожки - эпидемический вирус А/Вайоминг/3/03 (H3N2); 4-я и 6-я дорожки - кандидат в вакцинные штаммы А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2). В РА гене донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в позиции нуклеотида 1045 имеется замена G→T по сравнению с современными эпидемическими штаммами, приведшая к аминокислотной замене валина эпидемических вирусов на лейцин у донора аттенуации. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Vsp I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Таким образом, обработка всех исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию участка гена РА на два более мелких фрагмента, если он происходит от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В случае РА гена от эпидемического вируса расщепления не происходит.
Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) представлены в табл.1.
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 8,5 lg ЭИД50/0,2 мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:1024.
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Пример получения вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) представлен в прилагаемом паспорте.
Таблица 1Перечень праймеров и рестриктаз, использованных для изучения состава генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2), полученного на основе эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) | |||||||
Ген | Нуклеотид | Условное название и нуклеотидная Последовательность праймеров (F - прямой праймер; R - обратный праймер) | Рестриктаза | Рестрикция | |||
ЭВ | ДА | ВШ | |||||
РВ2 | 1459 | PB2F-1374 | 5' GGGAATTGAACATATCGA | Mse I | - | + | + |
PB2R-1614 | 5' TATTGTCAGTTTCTCTGT | ||||||
РВ1 | 819 | PB1F-740 | 5' GAGCAATTGCAACACCCG | Hind III | + | - | - |
PB1R-1044 | 5' TGCGATGCTCAGGACGTT | ||||||
PA | 1045 | PAF-900 | 5' TGAGGACCCAAGTCACGA | Vsp I | - | + | + |
PAR-1077a | 5'CTCATTCTCAATGTCCTGCAGTTCTGCCATTA | ||||||
NP | 1066 | NPF-886 | 5' TATGGACCTGCCGTAGCC | Eco R I | - | + | + |
NPR-1200 | 5' GTACCTGCTTCTCAGTTC | ||||||
NA | 77 | NAF-14 | 5' AAG ATG AAT CCA AAT CAA | Mse I | - | + | + |
NAR-775 | 5' AGT АТС GGC TCT TCC TGA TGC | ||||||
M | 969 | MF-785 | 5' CCCTCTTGTTGTTGCCGC | Fok I | + | - | - |
MR-1001 | 5' CAGCTCTATGCTGACAAA | ||||||
NS | 798 | NSF-673 | 5' CAAAACAGAAACGGAAAA | Cac 8 I | + | - | - |
NSR-890 | 5' AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTAA | ||||||
ОБОЗНАЧЕНИЯ: ЭВ - эпидемический вирус А/Вайоминг/3/03 (H3N2), ДА - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), ВШ - вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2); «+» - амплифицированная копия фрагмента РНК эпидемического вируса или донора аттенуации рестрицируется соответствующим ферментом; «-» - амплифицированная копия фрагмента РНК эпидемического вируса или донора аттенуации не рестрицируется соответствующим ферментом |
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма-А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2)
2. Серия - серия 2
3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:
а). эпидемический вирус - А/Вайоминг/3/03 (H3N2)
б). донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
4. Количество пассажей - 6 в процессе реассортации
5. Характеристика штамма:
а). оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов;
б). гемагглютинирующая активность - 1:1024;
в). инфекционная активность - 8.5 lg ЭИД50/0,2 мл;
г). чувствительность к ингибиторам - ингибиторорезистентный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;
д). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С - 8.5 lg ЭИД50/0,2 мл;
е). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С - 3.5 lg ЭИД50/0,2 мл.
ж). структура генома реассортанта:
- гены от эпидемического вируса - НА, NA
- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS
6. Характеристика штамма после лиофилизации:
а). дата лиофилизации - 26 февраля 2004 года;
б). объем материала в ампуле - 1.0 мл;
в). количество доз в серии - 4;
г). инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД50/0.2 мл;
д). гемагглютинирующая активность - 1:256.
7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.
8. Антигенная специфичность
а). гемагглютинина - идентичен вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2) по данным РТГА с иммунной крысиной антисывороткой;
б). нейраминидазы - идентична вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.
9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении
- безвреден.
10. Бактериологический контроль:
дата проведения - 27 февраля 2004 года
результат - стерилен.
11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.
Таблица 2Реактогенность вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) для взрослых людей | ||||||
Препарат | Число обследуемых | Показатель | Температурные реакции(в °С) | Показатель реактогенности, % | ||
Слабые (37,1-37,5°С) | Средние (37,6-38,4°С) | Сильные (≥38,5°С) | ||||
абс.ч. | 3 | 0 | 0 | |||
Вакцина | 49 | % | 6,1 | 0 | 0 | 0 |
абс.ч. | 1 | 1 | 1 | |||
Плацебо | 42 | % | 2,4 | 2,4 | 2,4 | |
Таблица 3Реактогенность вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8(Н3М2) для детей 3-14 лет | ||||||
Препарат | Число обследуемых | Показатель | Температурные реакции(в °С) | Показатель реактогенности, % | ||
Слабые (37,1-37,5°С) | Средние (37,6-38,4°С) | Сильные (≥38,5°С) | ||||
Вакцина | 76 | абс.ч.% | 33,9 | 11,3 | 00 | 0 |
Плацебо | 58 | абс.ч.% | 35,2 | 35,2 | 11,7 |
ШТАММ А/17/ВАЙОМИНГ/03/8 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ
Пример 1. При вакцинации 49 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 6,1% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 2.
В получившей плацебо группе из 42 лиц слабые реакции наблюдались у 2,4% лиц, средние температурные реакции - у 2,4% и сильные температурные реакции - у 2,4%.
Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.
Таким образом, вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.
ШТАММ А/17/ВАЙОМИНГ/03/8 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ
До 2004 года реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых готовили на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей - на более аттенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.]. В 2003 году Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004].
В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) на детях.
Пример 2. Группу из 76 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназално в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД50/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 58 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3.
В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С наблюдались в 1,3% случаев. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены в 3,9% случаев.
В группе детей, получивших плацебо, наблюдались сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С в 1,7% и 5,2% случаев соответственно. Слабые температурные реакции отмечены в 5,2% случаев.
Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.
Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.
На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.
Штамм вируса гриппа, депонированный в Государственном институте стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича под №144, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.