Рекомбинантная молекула днк, кодирующая модифицированный свиной фактор viii (pol 1212), экспрессирующие векторы, модифицированный свиной фактор viii, терапевтическая композиция, способы получения белка модифицированного свиного фактора viii (варианты) и линии клеток (варианты)

Рекомбинантная молекула днк, кодирующая модифицированный свиной фактор viii (pol 1212), экспрессирующие векторы, модифицированный свиной фактор viii, терапевтическая композиция, способы получения белка модифицированного свиного фактора viii (варианты) и линии клеток (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет из патентной заявки Соединенных Штатов Америки №09/037601, поданной 10 марта 1998 года, которая является частичным продолжением патентной заявки Соединенных Штатов Америки №08/670707, поданной 26 июня 1996 года, по которой выдан патент США №5859204, и Международной патентной заявки PCT/US 97/11155, поданной 26 июня 1997 года.

УВЕДОМЛЕНИЕ О ФЕДЕРАЛЬНОЙ ПОДДЕРЖКЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Правительство имеет права в данном изобретении в результате использования гранта №HL46215 Национального Института здравоохранения, который частично финансировал исследование, приведшее к данному изобретению.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Свертывание крови начинается, когда тромбоциты прикрепляются к разрезанной стенке поврежденного кровеносного сосуда в участке повреждения. Затем, в каскаде ферментативно регулируемых реакций молекулы растворимого фибриногена превращаются ферментом тромбином в нерастворимые тяжи фибрина, которые удерживают тромбоциты вместе в тромбе. На каждой стадии в этом каскаде белок-предшественник превращается в протеазу, которая расщепляет следующий белок-предшественник последовательно. В большинстве этих стадий требуются кофакторы.

Фактор VIII циркулирует в крови в виде неактивного предшественника, связанного прочно и нековалентно с фактором фон Виллебранда. Фактор VIII протеолитически активируется тромбином или фактором Ха, который диссоциирует его от фактора фон Виллебранда и активирует его прокоагулянтную функцию в этом каскаде. В его активной форме белковый фактор VIIIa является кофактором, который увеличивает каталитическую эффективность фактора IXa в отношении активации фактора Х на несколько порядков величин.

Люди с недостаточностью фактора VIII или антителами против фактора VIII, которые не получают лечения с использованием фактора VIII, страдают от неостанавливаемого внутреннего кровотечения, которое может вызывать ряд серьезных симптомов, от воспалительных реакций в суставах до ранней смерти. Тяжелые гемофилические пациенты, число которых в Соединенных Штатах достигает приблизительно 10000, могут лечиться инфузией фактора VIII человека, который будет восстанавливать нормальную способность свертывания крови при введении с достаточными частотой и концентрацией. Классическое определение фактора VIII фактически является таким: это вещество, присутствующее в нормальной плазме крови, которое корректирует дефект свертывания в плазме, полученной из индивидуумов с гемофилией А.

Развитие антител («ингибиторов» или «ингибиторных антител»), которые ингибируют активность фактора VIII, является серьезным осложнением в лечении пациентов с гемофилией. Аутоантитела развиваются приблизительно в 20% пациентов с гемофилией А в ответ на терапевтические инфузии фактора VIII. В ранее не подвергавшихся лечению пациентах с гемофилией А, которые развивают ингибиторы, этот ингибитор обычно развивается в пределах одного года лечения. Кроме того, аутоантитела, которые инактивируют фактор VIII, иногда развиваются в индивидуумах с ранее нормальными уровнями фактора VIII. Если титр ингибитора является достаточно низким, пациенты могут лечиться увеличением дозы фактора VIII. Однако часто титр ингибитора является таким высоким, что невозможно преодолеть его фактором VIII. Альтернативной стратегией является обход необходимости в отношении фактора VIII во время нормального гемостаза при помощи комплексных препаратов фактора IX (например, KONYNE*, Proplex®) или рекомбинантного фактора VIIa человека. Кроме того, поскольку свиной фактор VIII обычно имеет существенно более низкую реактивность с ингибиторами, чем фактор VIII человека, использовали частично очищенный фактор VIII свиньи (HYATE:C®). Многие пациенты, которые развили ингибиторные антитела к фактору VIII человека, успешно лечились свиным фактором VIII и выносили такое лечение в течение продолжительных периодов времени. Однако введение свиного фактора VIII не является полным решением, так как в некоторых пациентах ингибиторы могут развиваться к свиному фактору VIII после одной или нескольких инфузий.

Некоторые препараты полученного из плазмы человека фактора VIII варьирующейся степени чистоты являются коммерчески доступными для лечения гемофилии А. Они включают в себя частично очищенный фактор VIII, полученный из объединенной крови многих доноров, который обработан нагреванием и детергентами против вирусов, но содержит существенный уровень антигенных белков; очищенный моноклональными антителами фактор VIII, который имеет более низкие уровни антигенных примесей и вирусного загрязнения; и рекомбинантный фактор VIII человека, клинические испытания для которого проводятся в настоящее время. К сожалению, человеческий фактор VIII является нестабильным при физиологических концентрациях и рН, присутствует в крови в крайне низкой концентрации (0,2 мкг/мл плазмы) и имеет низкую удельную активность свертывания. Обеспокоенность общественного здравоохранения в отношении риска вирусов или других несомых кровью примесей ограничивала применимость свиного фактора VIII, очищенного из крови свиней.

Больные гемофилией требуют ежедневного пополнения фактора VIII для предупреждения кровотечения и возникающей деформирующей гемофильной артропатии. Однако подачи были недостаточными и возникают проблемы в терапевтическом применении вследствие трудности выделения и очистки, иммуногенности и необходимости устранения риска инфективности СПИДа и гепатита. Применение рекомбинантного человеческого фактора VIII или частично очищенного свиного фактора VIII не решит всех проблем.

Проблемы, связанные с обычно используемым коммерчески доступным полученным из плазмы фактором VIII, стимулировали значительный интерес в развитии лучшего продукта фактора VIII. Существует потребность в более сильнодействующей молекуле фактора VIII, так чтобы большее число единиц свертывающей активности могло доставляться на молекулу; в молекуле фактора VIII, которая является стабильной при выбранных рН и физиологической концентрации; в молекуле фактора VIII, которая менее склонна вызывать продуцирование ингибиторных антител; и молекуле фактора VIII, которая избегает иммунного детектирования в пациентах, которые уже приобрели антитела к человеческому фактору VIII.

Таким образом, задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, который корректирует гемофилию в пациенте, недостаточном по фактору VIII или имеющем ингибиторы в отношении фактора VIII человека.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение способов лечения больных гемофилией.

Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, который является стабильным при выбранных рН и физиологической концентрации.

Другой задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, который имеет более высокую коагулирующую (коагулянтную) активность, чем фактор VIII человека.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, против которого образуется меньшее количество антител.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение способа получения рекомбинантного свиного фактора VIII и, в частности, модифицированного свиного фактора VIII.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определение всей последовательности ДНК, кодирующей свиной фактор VIII, представленной здесь, впервые сделало возможным синтез свиного фактора VIII экспрессией ДНК, кодирующей свиной фактор VIII, в подходящей клетке-хозяине. Таким образом, очищенный свиной фактор VIII является аспектом данного изобретения. ДНК, кодирующая каждый домен свиного фактора VIII, а также любой ее описанный фрагмент, также могут быть экспрессированы. Кроме того, свиной фактор VIII с делетированным полным В-доменом или делетированной частью В-домена (не содержащий В-домена свиной фактор VIII (fVIII)) сделан доступным как часть данного изобретения посредством экспрессии ДНК, кодирующей свиной fVIII, имеющей делецию одного или нескольких кодонов В-домена.

Обеспечены также фармацевтические композиции и способы лечения пациентов, имеющих недостаточность фактора VIII, предусматривающие введение рекомбинантного свиного фактора VIII или модифицированного свиного фактора VIII, в частности, не содержащего В-домена свиного фактора VIII.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1А-1Н, взятые вместе, представляют сравнение сопоставленных последовательностей аминокислот человеческого, свиного и мышиного фактора VIII.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если нет иного описания или указания, в применении здесь, "фактор VIII" обозначает любую функциональную молекулу белка фактора VIII из любого млекопитающего.

В применении здесь, "фактор VIII млекопитающих" включает в себя фактор VIII с аминокислотной последовательностью, полученной из любого млекопитающего, не являющегося человеком, если нет иных указаний. "Животное", в применении здесь, обозначает свинью и других млекопитающих, не являющихся человеком.

"Слитый белок" или "слитый фактор VIII или его фрагмент", в применении здесь, обозначает продукт гибридного гена, в котором кодирующая последовательность для одного белка изменена, например, присоединением ее к кодирующей последовательности для второго белка из отличающегося гена в правильной последовательности в рамке считывания, так что может происходить непрерывная транскрипция и трансляция соединенных сегментов, с образованием гибридного гена, который кодирует этот слитый белок.

"Соответствующая" последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, в применении здесь, является последовательностью, присутствующей в молекуле фактора VIII или ее фрагменте, которые имеют одну и ту же структуру и/или функцию, что и сайт в молекуле фактора VIII другого вида, хотя число нуклеотидов или аминокислот может быть неидентичным. ДНК-последовательность, "соответствующая" последовательности другого фактора VIII, по существу соответствует такой последовательности и гибридизуется с последовательностью обозначенного номера SEQ ID NO: при строгих условиях. ДНК-последовательность, "соответствующая" последовательности другого фактора VIII, включает в себя также последовательность, которая приводит к экспрессии фактора VIII или его фрагмента и могла бы гибридизоваться с обозначенной последовательностью SEQ ID NO:, если бы не избыточность генетического кода.

"Уникальный" аминокислотный остаток или "уникальная" последовательность, в применении здесь, обозначает аминокислотную последовательность или аминокислотый остаток в молекуле фактора VIII одного вида, которые отличаются от гомологичного остатка или гомологичной последовательности в молекуле фактора VIII другого вида.

"Удельная активность", в применении здесь, обозначает активность, которая будет корректировать дефект свертывания недостаточной в отношении фактора VIII плазмы человека. Удельную активность измеряют в единицах активности свертывания на миллиграмм общего белка фактора VIII в стандартном тесте, в котором время свертывания недостаточной в отношении фактора VIII плазмы человека сравнивают с временем свертывания нормальной плазмы человека. Одна единица активности фактора VIII равна активности, присутствующей в одном миллилитре нормальной плазмы человека. В этом тесте, чем короче время образования сгустков, тем выше активность анализируемого фактора VIII. Свиной фактор VIII является активным в тесте фактора VIII человека.

"Экспрессия" обозначает ряд процессов, которые имеют место, когда генетическая информация используется для получения продукта. ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность свиного фактора VIII, может "экспрессироваться" в клетке-хозяине млекопитающего с образованием белка свиного фактора VIII. Материалы, генетические структуры, клетки-хозяева и условия, которые позволяют происходить экспрессии конкретной последовательности ДНК, хорошо известны в данной области и могут манипулироваться для воздействия на время и количество экспрессии, а также на внутри- или внеклеточную локализацию экспрессируемого белка. Например, в результате включения ДНК, кодирующей сигнальный пептид на 5'-конце ДНК, кодирующей свиной фактор VIII (этот 5'-конец является, как это принято, концом, кодирующим NH₂-конец данного белка), зкспрессируемый белок становится экспортируемым из внутреннего пространства клетки-хозяина в культуральную среду. Обеспечение кодирующей сигнальный пептид ДНК в комбинации с ДНК, кодирующей свиной фактор VIII, является выгодным, так как экспрессируемый фактор VIII экспортируется в культуральную среду, что упрощает процесс очистки. Предпочтительным сигнальным пептидом является сигнальный пептид фактора VIII млекопитающего.

Нуклеотидная последовательность кДНК и предсказанная аминокислотная последовательность фактора VIII человека показаны в SEQ ID NO:1 и 2 соответственно. Фактор VIII синтезируется в виде одноцепочечного белка приблизительно 300 кДа с гомологией внутренней последовательности, которая определяет последовательность «домена» NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. В молекуле фактора VIII «домен», в применении здесь является непрерывной последовательностью аминокислот, которая определяется идентичностью внутренних аминокислот и сайтами протеолитического расщепления тромбином. Если нет иных указаний, домены фактора VIII включают в себя следующие аминокислотные остатки при выстраивании этих последовательностей с аминокислотной последовательностью человека (SEQ ID NO:2): A1, остатки Аlа1-Arg372; А2, остатки Sеr373-Arg740; В, остатки Sеr741-Arg1648; A3, остатки Ser1690-Ile2032; C1, остатки Arg2033-Asn2172; C2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 включает в себя остатки Ser1690-Tyr2332. Оставшийся сегмент, остатки Glu1649-Arg1689, обычно называют пептидом активации легкой цепи фактора VIII. Фактор VIII протеолитически активируется тромбином или фактором Ха, который диссоциирует его от фактора фон Виллебранда с образованием фактора VIIIa, который обладает прокоагулянтной функцией. Биологическая функция фактора VIIIa заключается в увеличении каталитической эффективности фактора IXa в отношении активации фактора Х на несколько порядков величин. Активированный тромбином фактор VIIIa является гетеротримером А1/А2/А3-С1-С2 160 кДа, который образует комплекс с фактором IXa и фактором Х на поверхности тромбоцитов или моноцитов. «Частичный домен» в применении здесь является непрерывной последовательностью аминокислот, образующей часть домена.

«Субъединицы» фактора VIII человека или животного, в применении здесь, являются тяжелой и легкой цепями этого белка. Тяжелая цепь фактора VIII содержит три домена, A1, А2 и В. Легкая цепь фактора VIII также содержит три домена, A3, C1 и C2.

Термины "эпитоп", "антигенный сайт" и "антигенная детерминанта", в применении здесь, используются как синонимы и определяются как часть фактора VIII человека или животного или его фрагмент, которые специфически узнаются антителом. Они могут состоять из любого числа аминокислотных остатков и могут зависеть от первичной, вторичной или третичной структуры белка.

Термин "иммунодоминантный сайт", в применении здесь, определяется как район фактора VIII человека или животного или его фрагмент, который специфически индуцирует продуцирование антитела к фактору VIII или его фрагменту, в человеке или животном, измеряемое рутинными протоколами, такими как иммуноанализ, например анализ ELISA или Bethesda, описанные здесь. Он может состоять из любого числа аминокислотных остатков и может зависеть от первичной, вторичной или третичной структуры белка. В некоторых вариантах гибридный или эквивалентный гибридному фактор VIII или его фрагмент является неиммунодоминантным или менее иммунодоминантным в животном или человеке, чем фактор VIII человека или свиньи.

«Недостаточность фактора VIII», в применении здесь, включает в себя недостаточность активности свертывания, вызываемая продуцированном дефектного фактора VIII, недостаточным продуцированном или отсутствием продуцирования фактора VIII или частичным или полным ингибированием фактора VIII ингибиторами. Гемофилия А является типом недостаточности фактора VIII, происходящим из дефекта в Х-сцепленном гене и отсутствия или недостаточности белка фактора VIII, который он кодирует.

В применении здесь, «диагностические анализы» включают в себя анализы, которые некоторым образом используют взаимодействие антиген-антитело для детектирования и/или определения количества конкретного антитела, которое присутствует в тест-пробе, для облегчения выбора лекарственных терапий. Существуют много подобных анализов, известных специалистам с квалификацией в данной области. В применении здесь, ДНК фактора VIII человека, свиньи или модифицированного фактора VIII или ее фрагмент и белок, экспрессируемый из них, полностью или частично, могут заменять соответствующие реагенты в известных в других отношениях анализах, в результате чего эти модифицированные анализы могут использоваться для детектирования и/или количественного определения антител к фактору VIII. Именно применение этих реагентов, ДНК фактора VIII или ее фрагмента или белка, экспрессируемого ими, позволяет модифицировать известные анализы для обнаружения антител к фактору VIII человека или животного. Такие анализы включают в себя, но не ограничиваются ими, ELISA, иммунодиффузионный анализ и иммуноблоттинг. Подходящие способы для применения на практике этих анализов известны лицам с квалификацией в данной области. В применении здесь, фактор VIII или его фрагмент, который включает в себя по меньшей мере один эпитоп этого белка, может быть использован в качестве диагностического реагента. Примеры других анализов, в которых могут быть использованы фактор VIII человека, свиньи или модифицированный свиной фактор VIII или его фрагмент, включают в себя анализ Bethesda и антикоагуляционные анализы.

Термин кДНК, кодирующая белок, такой как свиной фактор VIII» означает полидезоксинуклеиновую кислоту, нуклеотидная последовательность которой заключает в себе кодирующую информацию для клетки-хозяина для аминокислотной последовательности белка, например, свиного фактора VIII, в соответствии с известными зависимостями генетического кода.

«Продукт экспрессии» ДНК, кодирующей фактор VIII человека или животного или модифицированный фактор VIII, представляет собой продукт, полученный из экспрессии ссылочной ДНК в подходящей клетке-хозяине, включающий в себя такие признаки пре- или посттрансляционной модификации белка, кодируемого ссылочной ДНК, как, в том числе, но не только, гликозилирование, протеолитическое расщепление и т.п. В данной области известно, что такие модификации могут встречаться и могут несколько отличаться в зависимости от типа клетки-хозяина и других факторов и могут приводить к молекулярным изоформам продукта с сохранением прокоагулянтной активности. См., например, Lind, P. et al., Eur. J. Biochem. 232:1927 (1995), включенный здесь в качестве ссылки.

«Экспрессирующий вектор» является ДНК-элементом, часто кольцевой структуры, имеющим способность автономной репликации в желаемой клетке-хозяине или способность интеграции в геном клетки-хозяина, а также обладающим определенными хорошо известными признаками, которые делают возможной экспрессию кодирующей ДНК, встроенной в этот вектор, в правильном сайте и в правильной ориентации. Такие признаки могут включать в себя, но не ограничиваются ими, одну или несколько промоторных последовательностей для запуска инициации транскрипции кодирующей ДНК и другие ДНК-элементы, такие как энхансеры, сайты полиаденилирования и т.п., все из них хорошо известны в данной области. Термин "экспрессирующий вектор" используют для обозначения как вектора, имеющего кодирующую последовательность ДНК, которая должна быть экспрессирована, встроенную в его последовательность, так и вектора, имеющего необходимые для экспрессии регуляторные элементы, расположенные таким образом относительно сайта инсерции, что он может служить для экспрессии любой кодирующей ДНК, встроенной в этот сайт, все эти регуляторные элементы хорошо известны в данной области. Так, например, вектор, не имеющий промотора, может стать экспрессирующим вектором в результате инсерции промотора вместе с кодирующей ДНК.

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ СПОСОБОВ

В патенте США 5364771 описано открытие гибридных молекул фактора VIII человека/свиньи, имеющих коагулянтную активность, в которых элементы молекулы фактора VIII человека или свиньи заменяют соответствующие элементы молекулы фактора VIII других видов. В патенте США 5663060 описаны прокоагулянтные гибридные молекулы фактора VIII человека/животного и эквивалентные гибридным молекулы фактора VIII, в которых элементы молекулы фактора VIII одного вида заменяют соответствующие элементы молекулы фактора VIII другого вида.

Поскольку существующая информация показывает, что В-домен не имеет ингибиторного эпитопа и не оказывает известного действия на функцию фактора VIII, в некоторых вариантах В-домен полностью или частично делетирован в активных гибридных или эквивалентных гибридным молекулах фактора VIII или его фрагментах ("В(-)-фактор VIII"), полученных любым из описанных здесь способов.

Ген фактора VIII человека был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих, как сообщалось Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood, W.I. et. al. (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; US Patent No. 4757006, и аминокислотная последовательность была расшифрована из кДНК. В патенте США с номером 4965199, выданном Capon et al., описан способ рекомбинантных ДНК для получения фактора VIII в клетках-хозяевах млекопитающих и очистки фактора VIII человека. Сообщалась экспрессия фактора VIII человека на клетках СНО (клетках яичника Китайского хомячка) и ВНКС (клетках почки детеныша хомячка). Фактор VIII человека был модифицирован для делеции части В-домена или всего В-домена (патент США №4868112) и была сделана попытка замены В-домена фактора VIII человека В-доменом фактора V человека (патент США №5004803). Последовательность кДНК, кодирующая фактор VIII человека, и предсказанная аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID NO:1 и 2 соответственно. В SEQ ID NO:1 кодирующий район начинается в положении нуклеотида 208, причем триплет GCC является кодоном для аминокислоты номер 1 (Ala) зрелого белка, показанного в SEQ ID NO:2.

Свиной фактор VIII был выделен из плазмы [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594]. Частичная аминокислотная последовательность свиного фактора VIII, соответствующая частям N-концевой последовательности легкой цепи, имеющим гомологию относительно церулоплазмина и фактора коагуляции V, описана Church et al. (1984) Ргос, Natl. Acad. Sci. USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 описали частичное секвенирование N-концевой стороны четырех аминокислотных фрагментов свиного фактора VIII, но не охарактеризовали эти фрагменты в отношении их положений в молекуле фактора VIII. Аминокислотная последовательность В-домена и части А2-домена свиного фактора VIII были сообщены Toole, J.J. et al. (1986) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. кДНК-последовательность, кодирующая полный А2-домен свиного фактора VIII, и предсказанная аминокислотная последовательность и гибридный фактор VIII человека/свиньи, имеющий замены всех доменов, все субъединицы и специфические аминокислотные последовательности описаны в патенте США 5364771, озаглавленном "Hybrid Human/Porcine factor VIII", выданном 15 ноября 1994 года и в WO 93/20093, опубликованном 14 октября 1993 года. кДНК-последовательность, кодирующая А2-домен свиного фактора VIII, соответствующий остаткам 373-740 в зрелом факторе VIII человека, показанном в SEQ ID NO:1, и предсказанная аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID NO:3 и 4 соответственно. Более недавно сообщались нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности части А1-домена, не имеющего первых 198 аминокислот, и А2-домена свиного фактора VIII в WO 94/11503, опубликованном 26 мая 1994 года. Наконец, полная нуклеотидная последовательность, кодирующая свиной фактор VIII, включающий в себя полный А1-домен, пептид активации, A3-, С1- и С2-домены, а также кодируемая аминокислотная последовательность были получены Lollar, как описано в патенте США 5859204, выданном 12 января 1999 года, и в WO 97/49725, опубликованном 31 декабря 1997 года, оба включены здесь в качестве ссылки.

Как свиной, так и человеческий фактор VIII выделяют из плазмы в виде белка из двух субъединиц. Эти субъединицы, известные как тяжелая и легкая цепи, удерживаются вместе нековалентной связью, которая требует ионов кальция или другого двухвалентного металла. Тяжелая цепь фактора VIII содержит три домена, А1, А2 и В, которые связаны ковалентно. Легкая цепь фактора VIII также содержит три домена, названных A3, С1 и С2. В-домен не имеет известной биологической функции и может быть удален или частично удален из этой молекулы протеолитически или способами технологии рекомбинантных ДНК без значимого изменения какого-либо измеримого параметра фактора VIII. Рекомбинантный фактор VIII человека имеет структуру и функцию, сходную с полученным из плазмы фактором VIII, хотя он не является гликозилированным, если он не экспрессируется в клетках млекопитающих.

Активированный фактор VIII как человека, так и свиньи ("фактор VIIIa") имеет три субъединицы вследствие расщепления тяжелой цепи между доменами А1 и А2. Эта структура названа А1/А2/А3-С1-С2. Фактор VIIIa человека не является стабильным в условиях, которые стабилизируют свиной фактор VIIIa, предположительно вследствие слабой связи А2-субъединицы фактора VIIIa человека. Диссоциация А2-субъединицы фактора VIIIa человека и свиньи ассоциирована с потерей активности в молекуле фактора VIIIa. Yakhyaev, A. et al. (1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstract #126 сообщали связывание А2-домена белком, родственным рецептору липопротеина низкой плотности, что позволяет предположить, что клеточное поглощение А2, опосредованное таким связыванием, действует, отрицательно регулируя активность фактора VIII.

Экспрессия «не содержащего В-домена фактора VIII» усиливается включением частей В-домена. Сообщалось, что включение этих частей В-домена, названных "SQ" [Lind, P. et al. (1995), supra], приводит к благоприятной экспрессии. Конструкции "SQ" не содержат всего В-домена человека за исключением 5 аминокислот N-конца В-домена и 9 аминокислот С-конца В-домена.

Очищенный гибридный фактор VIII или его фрагмент может быть тестирован на иммунореактивность и коагулирующую активность стандартными анализами, в том числе, например, анализом на свободный от плазмы фактор VIII, одностадийным анализом свертывания и твердофазным иммуноферментным анализом с использованием очищенного рекомбинантного фактора VIII человека в качестве стандарта.

Другие векторы, в том числе как плазмидные, так и эукариотические вирусные векторы, могут быть использованы для экспрессии рекомбинантной генной конструкции в эукариотических клетках в зависимости от предпочтения и оценки квалифицированного практика (см., например, Sambrook et al. Chapter 16). Могут быть использованы другие векторы и зкспрессионные системы, в том числе бактериальные, дрожжевые системы и системы клеток насекомых, но они не являются предпочтительными вследствие различий в гликозилировании или отсутствия гликозилирования.

Рекомбинантный белок фактора VIII может экспрессироваться в различных клетках, обычно используемых для культивирования и экспрессии рекомбинантных белков млекопитающих. В частности, было обнаружено, что ряд клеточных линий грызунов являются особенно применимыми хозяевами для экспрессии больших белков. Предпочтительные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур, Rockville, MD, включают в себя клетки почек детенышей хомячка и клетки яичников Китайского хомячка, которые культивируют с использованием рутинных процедур и обычных сред.

Основой для большей коагулянтной активности свиного фактора VIII является, по-видимому, более быстрая спонтанная диссоциация субъединицы А2 человека от фактора VIIIa человека, чем субъединицы А2 свиньи от свиного фактора VIIIa. Диссоциация субъединицы А2 приводит к потере активности, [Lollar, Р. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13246-13250].

Молекулы фактора VIII с уменьшенной иммунореактивностью:

Эпитопы, которые являются иммунореактивными с антителами, ингибирующими коагулянтную активность фактора VIII («ингибиторами» или «ингибиторными антителами»), были охарактеризованы на основе известных взаимосвязей структуры и функции в факторе VIII. Предположительно, ингибиторы могли бы действовать разрушением любых макромолекулярных взаимодействий, связанных с доменной структурой фактора VIII, или его связей с фактором фон Виллебранда, тромбином, фактором Ха, фактором IXa или фактором X. Однако большинство ингибиторных антител к фактору VIII действуют посредством связывания с эпитопами, локализованными в А2-домене 40 кДа или С2-домене 20 кДа фактора VIII, разрушая специфические функции, связанные с этими доменами, как описано Fulcher et al. (2985) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; и Scandella et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85:6152-6156. Кроме эпитопов А2 и С2 может существовать третий эпитоп в домене A3 или домене С1 легкой цепи фактора VIII, согласно Scandella et al. (1993) Blood 82:1767-1775. Значение этого предположительного третьего эпитопа является неизвестным, но, по-видимому, он является ответственным за минорную часть реактивности эпитопа в факторе VIII.

Анти-А2-антитела блокируют активацию фактора X, как показано Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Прежние исследования по картированию с использованием делеционного мутагенеза, описанные Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, локализовали А2-эпитоп в районе 20 кДа NH₂-концевой стороны А2-домена 40 кДа. Конкурентный иммунорадиометрический анализ показал, что ингибиторы А2 узнают либо общий эпитоп, либо тесно собранные эпитопы, как описано Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671 и как показано в патенте США 5859204.

Молекулы фактора VIII животных или модифицированного фактора VIII животных могут быть тестированы в людях на их уменьшенную антигенность и/или иммуногенность в клинических испытаниях. В одном типе испытания, предназначенном для определения, является ли фактор VIII иммунореактивным с ингибиторными антителами, фактор VIII вводят предпочтительно внутривенным вливанием приблизительно 25 пациентам, имеющим недостаточность фактора VIII, которые имеют антитела, ингибирующие коагулянтную активность терапевтического фактора VIII человека. Доза фактора VIII животного или модифицированного фактора VIII животного находится в диапазоне между 5 и 50 Единицами/кг веса тела, предпочтительно 10-50 Единицами/кг и наиболее предпочтительно 40 Единицами/кг веса тела. Спустя приблизительно 1 час после каждого введения выход фактора VIII из проб крови измеряют в одностадийном анализе свертывания. Пробы берут опять спустя приблизительно 5 часов после инфузии и измеряют выход. Общий выход и скорость исчезновения фактора VIII из этих проб являются предсказывающими в отношении титра антител и ингибиторной активности. Если титр антител является высоким, выход фактора VIII обычно не может быть измерен. Результаты извлечения сравнивают с результатами извлечения в пациентах, получавших полученный из плазмы фактор VIII человека, рекомбинантный фактор VIII человека, полученный из плазмы свиной фактор VIII и другие обычно применяемые терапевтические формы фактора VIII или заменителей фактора VIII.

После идентификации клинически важных эпитопов могут быть экспрессированы рекомбинантные молекулы фактора VIII, которые имеют меньшую или равную перекрестную реактивность в сравнении с полученным из плазмы свиным фактором VIII при испытании in vitro против широкого спектра ингибиторных плазм. Для снижения перекрестной реактивности может быть проведен дополнительный мутагенез в районах эпитопа. Пониженная перекрестная реактивность, хотя и желательная, не является необходимой для получения продукта, который может иметь преимущества над существующим концентратом полученного из плазмы свиного фактора VIII, который может давать побочные действия вследствие примесных свиных белков или загрязняющих инфекционных агентов, таких как вирусы или прионы. Рекомбинантная молекула свиного или модифицированного свиного фактора VIII не будет содержать чужеродных свиных белков.

Диагностические анализы

кДНК фактора VIII и/или экспрессируемый из нее белок, в целом виде или в виде части, могут быть использованы в анализах в качестве диагностических реагентов для обнаружения ингибиторных антител к фактору VIII человека или животных или к модифицированному фактору VIII животных в субстратах, в том числе, например, пробах сыворотки и жидкостей тела пациентов-людей с недостаточностью фактора VIII. Эти анализы антител включают в себя такие анализы, как ELISA, иммуноблоты, радиоиммуноанализы, иммунодиффузионные анализы и анализ биологической активности фактора VIII (например, анализ свертывания). Способы приготовления этих реагентов и способы их применения хорошо известны специалистам в данной области. Например, иммуноанализ для обнаружения ингибиторных антител в пробе сыворотки пациента может включать в себя реакцию тест пробы с достаточным количеством тестируемого фактора VIII, чтобы испытать, что детектируемый комплекс может быть образован с ингибиторными антителами в пробе или что тестируемый фактор VIII действительно является антигенным.

Могут быть приготовлены зонды нуклеиновых кислот и аминокислот на основе последовательности молекулы кДНК или молекулы белка гибридного фактора VIII или их фрагментов. В некоторых вариантах они могут быть помечены с использованием красителей или ферментных, флуоресцентных, хемилюминесцентных или радиоактивных меток, которые являются коммерчески доступными. Аминокислотные зонды могут использоваться, например, для скрининга сывороток или других физиологических жидкостей (жидкостей тела), где ожидается присутствие ингибиторов фактора VIII человека, животного или гибридного фактора VIII человека/животного. Уровни ингибиторов могут быть определены количественно в пациентах и сравнены со здоровыми контролями и могут быть использованы, например, для определения, может ли недостаточность фактора VIII лечиться фактором VIII животного или модифицированным фактором VIII животного. Зонды кДНК могут быть использованы, например, для исследовательских целей в скрининге библиотек ДНК.

Фармацевтические композиции.

Фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII, один или в комбинации с подходящими фармацевтическими стабилизирующими соединениями, доставляющими носителями и/или переносящими носителями, готовят в соответствии с известными способами, например, описанными в Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin.

В одном предпочтительном варианте предпочтительными носителями или доставляющими носителями для внутривенной инфузии являются солевой раствор или забуференный фосфатом солевой раствор.

В другом предпочтительном варианте подходящие стабилизирующие соединения, доставляющие носители и носители-переносчики, включают в себя, но не ограничиваются ими, другие белки человека или животного, такие как альбумин.

Фосфолипидные носители или липосомные суспензии также являются предпочтительными в качестве фармацевтически приемлемых переносящих или доставляющих носителей. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области, и могут содержать, например, фосфатидилсерин/фосфатидилхолин или другие композиции фосфолипидов или детергентов, которые вместе придают отрицательный заряд поверхности, так как фактор VIII связывается с отрицательно заряженными фосфолипидными мембранами. Липосомы могут быть получены растворением подходящего липида (подходящих липидов) (таких как стеароилфосфатидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, арахадоилфосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают с оставлением тонкой пленки высушенного липида на поверхности контейнера. Затем в этот контейнер вводят водный раствор гибридного фактора VIII. Затем контейнер встряхивают вручную для высвобождения липидного материала от стенок контейнера и диспергирования липидных агрегатов с образованием таким образом суспензии липосом.

Рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII может быть комбинирован с другими подходящими стабилизирующими соединениями, доставляющими носителями