Способ для лечения неврологических и нейропсихологических нарушений

Способ для лечения неврологических и нейропсихологических нарушений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Область изобретения

Данное изобретение относится к поддержанию или потенциированию эндогенных неврологических и нейропсихологических эффектов систем нейропептида Y головного мозга (NPY) введением ингибиторов дипептидилпептидазы IV (DP IV) и DP IV-подобных ферментов. Далее данное изобретение относится к лечению гипертензии, лихорадочного состояния, расстройства сна, анорексии, связанных с тревожностью нарушений, в том числе депрессии, припадков, в том числе эпилепсии, синдрома отмены лекарственного средства и алкоголизма, нейродегенеративных нарушений, в том числе нарушения когнитивной функции и деменции, и психоневрологических нарушений, в том числе шизофрении, через потенциирование опосредованных рецептором Y1 NPY эффектов в центральной нервной системе (ЦНС).

Предшествующий уровень

DP IV и NPY

DP IV (CD26; EC 3.4.14.5) является экзопептидазой с тройной функциональной ролью. DP IV участвует в высвобождении дипептидов Хаа-Pro из N-конца полипептидов, циркулирующих в кровотоке гормонов и хемокинов (Mentlein et al., 1999; Pauly et al., 1999), в Т-клеточнозависимых иммунных реакциях (Kahne et al., 1999; Korom et al., 1997) и в метастазировании (Chang et al., 1998; 2000). DP IV селективно расщепляет пептиды после предпоследних N-концевых остатков пролина и аланина. Эндогенные субстраты для этого фермента включают инкретины, такие как глюкозазависимые инсулинотропные полипептиды, такие как GIP и GLP-1. В присутствии DP IV эти гормоны ферментативно расщепляются в неактивные формы.

Обнаружение NPY

Нейропептид Y (NPY), пептид из 36 аминокислот, принадлежащий к семейству панкреатических полипептидов, был впервые выделен из головного мозга свиньи в 1982 году (Tatemoto and Mutt, 1982). NPY присутствует во всех симпатических нервах, иннервирующих сердечно-сосудистую систему, и является наиболее изобилующим пептидом в головном мозгу и сердце. Кроме того, в крысах, но не в человеке, NPY был также найден вненейронно в тромбоцитах и эндотелии (Zukovska-Grojec et al., 1993). Первоначально NPY был известен как сильнодействующий вазоконстриктор и нейромодулятор. Предполагалось, что высвобождаемый стрессом, физической нагрузкой и ишемией миокарда NPY участвует в коронарной болезни сердца, застойной сердечной недостаточности и гипертензии (Zukovska-Grojec et al., 1998). Более недавно, вследствие сильной способности NPY стимулировать потребление пищи, было предположено, что он играет роль в ожирении и диабете (Kalra et al., 1999). Более поздние открытия показывают, что NPY является также митогеном для клеток гладких мышц сосудов, в частности аорты крыс (Zukovska-Grojec et al., 1999).

Исследование, связанное с NPY, сосредоточилось по меньшей мере на трех основных направлениях: (1) котрансмиссии и симпатической вазоконстрикции, вследствие его коэкспрессии с норадреналином; (2) нейротрансмиссии и функционировании в ЦНС, вследствие сильных окончательных эффектов; и (3) эволюции NPY, так как NPY является одним из наиболее высококонсервативных известных биоактивных пептидов (Colmers and Wahlestedt, 1993; Lundberg, 1996; Wahlestedt and Reis, 1993; Wettstein et al., 1996). NPY действует по меньшей мере на шести рецепторах (Y1-Y6) с варьирующейся фармакологией пептида и отличающимся распределением в ЦНС (Gehlert, 1998) (таблица 1).

Распределение NPY, подтипов рецепторов NPY и мРНК

Распределение самого NPY, рецепторного белка NPY и их мРНК в ЦНС головного мозга человека и крысы рассматривалось недавно в обзоре (Dumont Y, Jacues D, St-Pierre, J.-A. Tong, Y., Parker, R., Herzog H and Quirion, R., 2000; in Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol.16: Peptide Receptors, Part I; Quirion, R., Bjorklund, A. and Hokfeld, T., editors). Краткий обзор дается в таблице 1.

NPY-содержащие нейроны обнаруживаются в назальной слизистой оболочке различных видов, в том числе человека, часто ассоциированные с железистыми ацинусами и кровеносными сосудами (Baraniuk et al., 1990; Grunditz et al., 1994). Стимуляция парасиматической иннервации назальной слизистой оболочки (видиева нерва) у собак увеличивает кровоток в этом районе и вызывает главным образом устойчивость к атропину. Внутривенное введение NPY уменьшает вазодилатацию, обусловленную стимуляцией парасимпатического нерва, эффект, который не имитируется YI-селективным агонистом NPY [Leu31, Pro34]NPY, но заметно имитируется при введении агониста Y2-рецептора NPY N-ацетил[Leu28,Leu31JNPY(24-36) (Lacroix et al., 1994). Это согласуется с предсинаптическим опосредованным Y2-подобным рецептором NPY ингибированием высвобождения трансмиттера из терминалей парасимпатических нервов.

Функция рецептора NPY

NPY является, бесспорно, наиболее распространенным нейропептидом, обнаруженным до настоящего времени, с широким распределением в ЦНС и периферической нервной системе (PNS). NPY образует семейство пептидов вместе с пептидом YY (PYY) (приблизительно 70% гомология) и панкреатическим полипептидом (РР) (приблизительно 50% гомология); как NPY, так и PYY являются чрезвычайно биоактивными, тогда как РР обычно является гораздо менее активным (Gehlert, 1998; Wahlestedt and Reis, 1993) (таблица 2).

Два подтипа рецепторов NPY были названы Y1-рецептор нейропептида Y (постсинаптический) и Y2-рецептор нейропептида Y (пресинаптический) на основании различных реакций на укороченный аналог родственного пептида YY-(13-36) в сравнении с нейропептидом Y в системах анализа in vitro (Wahlestedt et al., 1986). Активация нейронных пресинаптических рецепторов NPY обычно ингибирует нервную активность, уменьшая высвобождение нейротрансмиттеров в ответ на нервные импульсы и в ответ на локальные факторы, влияющие на высвобождение нейротрансмиттеров (Wahlrstedt et al., 1986). Классификация пресинаптических рецепторов или рецепторов Y2 нейропептида Y основана на действиях пептида YY (13-36), но во многих системах эта молекула, а также нейропептид Y-(13-36), не проявляет прессорной (повышающей кровяное давление) активности (Rioux et al., 1986; Lundberg et al., 1988; Potter et al., 1989). Некоторыми это интерпретировалось как указание на то, что в некоторых сосудистых ложах имеются два типа рецепторов нейропептида Y (как Yj-рецептор нейропептида Y, так и Y2-рецептор нейропептида Y) на постсинаптических мембранах (Schwartz et al., 1989). Однако отсутствие селективности этих молекул может быть обусловлено сохранением частичной агонистической активности на рецепторах Yj, которая позволяет им индуцировать уменьшенную функциональную реакцию. Ранее был описан 13-36-аналог нейропептида Y (Leu 17, Glu", Ala 21, Ala 22, Glu 23, LeU28, LeU31)-нейропептид Y-(13-36) (ANA нейропептид Y-(13-36)), который проявляет пресинаптическую активность, эквивалентную полноразмерной молекуле нейропептида Y, в исследованиях in vivo (Potter et al., 1989).

Кроме этих исторически хорошо определенных рецепторов нейропептида Y, предполагалось существование ряда других подтипов (Y3, Y4, Y5 и Y6) на фармакологической основе (Michel et al., 1998), и детали клонирования рецепторов, соответствующих Y1, Y2, Y4 и Y5, были опубликованы (Herzog et al., 1992; Gerald et al., 1995; Bard et al., 1995; Gerald et al., 1996) (таблица 1). Распределение и физиологическое значение этих различных подтипов рецепторов еще должны выясняться. Хотя существует некоторое противоречие в отношении селективности укороченных форм нейропептида Y для одного или другого подтипа рецепторов (Potter et al., 1989), возникающая картина подтверждает первоначальную классификацию на подтипы пре- и постсинаптических рецепторов. Были установлены клеточные линии, которые экспрессируют специфически один подтип рецептора нейропептида Y, и развитие рецептор-селективных аналогов нейропептида Y сосредоточилось в основном на характеристиках связывания в этих клеточных линиях (Sheikh et al., 1989; Aakerlund et al., 1990; Fuhlendorff et al., 1990). Более недавно, была клонирована кДНК, кодирующая рецептор Y1 нейропептида Y, и клеточные линии, экспрессирующие этот клонированный рецептор, анализировали как на специфическое связывание аналогов нейропептида Y (Herzog et al., 1992), так и на функциональные реакции, индуцируемые конкретными аналогами. Из таких исследований связывания, объединенных с последующими исследованиями in vivo, два аналога были классифицированы как действующие специфически на постсинаптическом рецепторе Y1 нейропептида Y. Эти селективные в отношении рецептора Y нейропептида Y аналоги, (Pro 34)-нейропептид Y и (Leu", Pro 34)-нейропептид Y, имитируют действие нейропептида Y в повышении кровяного давления, а также имеют такое же связывание с клеточными линиями, экспрессирующими только рецепторы Y нейропептида Y, например, клеточной линией SK-N-MC нейробластомы человека и линиями фибробластов, экспрессирующими клонированный Y-рецептор нейропептида Y (Herzog et al., 1992). Ни один из них не проявляет действие Y2-рецептора нейропептида Y, ингибирование сердечного вагусного действия in vitro, манифестацию ингибирования высвобождения ацетилхолина (Potter et al., 1991; Potter and McCloskey, 1992).

Таблица 1Распределение и функция подтипов рецепторов NPY в ЦНС
Подтип рецептора	Экспрессия в ЦНС	Функция	Селективный агонист	Селективный антагонист или селективность
Y1	Кора головного мозга и т.д.	Анксиолизис, высвобождение LHRH	Интактный N-конец: [Leu31,Pro34] NPY	BIBP3226; BIBO 3304
Y2	Гиппокамп, Гипоталамус	Антиамнетическая	С-концевая сторона: PYY3-36; PYY13-36	T4[NPY(33-36)]4; BIIE0246
Y3	Ncl. Tractus Solitarius (NTS)	Брадикардия, Гипотензия	NPY≫PYY, [Leu31, Pro34]NPY	PYY - нечувствительность
Y4	Дорсальный вагусный комплекс (DVC)	Вызывающая рвоту	PP≫NPY, PYY	PP - предпочтительный
Y5(а)	Гипоталамус	Питание	NPY, PYY, [Leu31, Pro34]NPY	[Leu31,Pro34]NPY-чувствительный, BIBP3226-необратимый
Y5(b) или Y6	Гипоталамус	?; видоспецифическая	?	?
Таблица 1: Подтипы рецептора NPY в ЦНС: ?=не известны или не исследованы

Развитие высокоаффинных, непептидных антагонистов NPY, BIBP3226 и BIBO3304 облегчило функциональную характеристику рецепторов NPY, так как это соединение проявляет селективность в отношении Y1R, будучи лишенным активности по меньшей мере на рецепторах Y2R, Y3R и Y4R (Doods et al., 1996). Недавно были описаны два антагониста рецептора Y2. Один является TASP-молекулой (Grouzmann et al., 1997), другой - непептидным антагонистом (Wieland et al., 1999), и становятся известными другие непептидные соединения, специфические в отношении рецептора (Daniels et al., 1995). Таким образом, блокада специфического рецептора в головном мозгу позволила бы функционально охарактеризовать поведенческие и физиологические эффекты, опосредуемые рецепторами NPY в центральной нервной системе. Кроме того, были получены мыши, лишенные Y1R, и они являются доступными (Pedrazzini et al., 1998). Нейроны, проявляющие NPY-подобную иммунореактивность и экспрессию рецептора NPY, являются обильными в ЦНС (таблица 1) и, возможно, в наибольшем количестве обнаруживаемыми в гипоталамусе и так называемых лимбических структурах, но они локализованы также совместно с моноаминергическими нейронами ствола мозга и GABA-ергическими нейронами коры головного мозга (Chronwall, 1985; Dumont et al., 1996).

Таблица 2Подтипы рецепторов и пептидная селективность
Подтип рецептора	Эффективность пептида
Y1-подобные
Y1	NPY=PYY=Pro34-NPY>PP>NPY13-36
Y4	PP≫NPY=PYY=LP-NPY>NPY13-36
Y6	NPY=PYY=Pro34-NPY>NPY13-36>PP
Y2-подобные
Y2	NPY=PYY=NPY13-36>Pro34-NPY>PP
Y5-подобные
Y5	NPY=PYY=Pro34-NPY>NPY13-36>PP
Неклонированные
Рецептор РР	PP≫PYY=NPY
Y3	NPY=Pro34-NPY=NPY13-36≫PYY
Предпочтительные PYY	PYY>NPY≫NPY13-36≫Pro34-NPY
Таблица 2: Подтипы рецепторов и пептидная селективность согласно Gehlert, 1998.

NPY, тревожность и депрессия

Анксиолитикподобные эффекты NPY были продемонстрированы с использованием теста приподнятого крестообразного лабиринта (Montgomery), теста наказуемого питья (Vogel) и теста наказуемой реакции (Geller-Seifter), причем сила и эффективность совпадали с силой и эффективностью бензодиазепинов (Griebel, 1999; Heilig et al., 1989; Wettstein et al., 1995). NPY действует подобно анксиолитику на реакцию на новые условия (Heilig and Murison, 1987; von Horsten et al., 1998b) и производит анксиолитикподобные эффекты в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом и в других связанных с тревожностью тестах (Wahlestedt and Reis, 1993; Wahlestedt et al., 1993). Интересно, что обработанные антисмысловым рецептором Y1 крысы обнаружили заметное связанное с тревожностью поведение без изменений опорно-двигательной активности и потребления корма (Wahlestedt et al., 1993). Кроме того, в штамме крыс - Flinder генетической модели депрессии - экспрессия мРНК рецептора Y1 уменьшалась в различных кортикальных районах и зубчатой извилине гиппокампа, тогда как экспрессия мРНК рецептора Y2 не отличалась от контролей (Caberlotto et al., 1998). Эктомия обонятельной луковицы в крысе была разработана в качестве модели депрессии (Leonard and Tuite, 1981). В этой модели большинство изменений являются сходными с изменениями, обнаруживаемыми в депрессивных пациентах (Song et al., 1996). 7-дневное i.c.v. введение NPY в крыс с эктомией обонятельной луковицы ослабляло поведенческие нарушения и недостаточность нейротрансмиттера в этой модели (Song et al., 1996). Рецепторы NPY Y1, Y2 и, возможно, Y5, по-видимому, участвуют в регуляции уровней тревожности в грызунах, причем Y1-опосредованные эффекты являются наилучшим образом охарактеризованными (Heilig et al., 1993; Kask et al., 1998b). Таким образом, можно сделать вывод, что эндогенный NPY противодействует стрессу и тревожности (Heilig et al., 1994). Кроме того, эти данные предполагают, что подтип рецепторов Y1 может участвовать в связанном с тревожностью и депрессией поведением. Кроме того, Kask et al. (1996) сообщали, что i.c.v. инъекция антагониста Y1, BIBP3226, давала эффекты, подобные эффектам анксиогеннных агентов, в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом, без какого-либо опорно-двигательного нарушения. Этот эффект может быть воспроизведен введением BIBP3226 в серое вещество около дорсального водопровода мозга (Сильвиева водопровода), но не в locus coeruleus (голубое место) или паравентрикулярное ядро гипоталамуса (Kask et al., 1998c). Кроме того, BIBP3226 и GR231118, введенные в серое вещество около дорсального водопровода мозга (Сильвиева водопровода), уменьшали время, проводимое для активного "социального взаимодействия" у крыс (Kask et al., 1998d). Участки головного мозга, которые являются важными для антистрессорного действия NPY, включают в себя, но не ограничиваются ими, миндалевидное тело (Sajdyk et al., 1999, Thorsell et al., 1999), голубое место (Kask et al., 1998c) и дорсальное серое вещество около водопровода головного мозга (Kask et al., 1998a,b). NPY миндалевидного тела не высвобождается в условиях низкого стресса, так как блокада Y1R NPY посредством BIBP3226 или BIBO3304 не увеличивала тревожность, как измерено в тесте приподнятого крестообразного лабиринта и "социального взаимодействия" (Kask et al., 1998b; Sajdyk, 1999). Однако, по-видимому, существует постоянный NPY-эргический тонус в дорсальном сером веществе около водопровода головного мозга, где антагонист Y1R NPY имел подобные анксиогенным эффекты в обеих экспериментальных моделях тревожности (Kask et al., a, b). Таким образом, в некоторых участках головного мозга может существовать регуляция тревожности посредством тонуса через системы NPY.

Неврологические и психофизиологические эффекты систем NPY ЦНС: плейотропия

Таким образом, многочисленные исследования были направлены на исследование физиологических функций NPY и его аналогов в ЦНС (в отношении обзоров см.: Kalra and Crowley, 1992; Dumont et al., 1992; Stanley, 1993; Wahlestedt and Reis, 1993; Grundemar et al., 1993; Gehlert, 1994, 1998; Colmers and Bleakman, 1994; Wettstein et al., 1995; Heilig and Widerlow, 1995; Munglani et al., 1996; Inui, 1999; Bischoff and Michel, 1999; Vezzani et al., 1999) и продемонстрировали широкий диапазон эффектов. В настоящее время не существуют фармакологические подходы к извлечению пользы из этих различных физиологических функций.

Существующие в настоящее время проблемы в лечении связанных с тревожностью нарушений с использованием бензодиазепинов или NPY

Существующие способы для лечения тревожности сопровождаются несколькими проблемами:

Бензодиазепины, которые обычно используют в качестве анксиолитических агентов, являются неприродными соединениями с низкой селективностью или без селективности. Наряду с их анксиолитической активностью, бензодиазепины проявляют седативные и антиэпилептические эффекты и, как предполагается, влияют на мышечную релаксацию. К сожалению, они связаны с рядом нежелательных побочных эффектов, а именно усталостью, сонливостью, отсутствием концентрации, снижением внимания и реактивности. Долгосрочное применение бензодиазепинов вызывает неврологические нарушения, такие как атаксия, головокружение, потерю рефлекса, мышечные нарушения и нарушения речи. Считается, что долгосрочное лечение бензодиазепинами влечет за собой зависимость и привыкание.

Прямое i.c.v. введение нейропептида Y в течение продолжительного лечения тревожности в пациентах является невозможным.

Присутствие DP IV-активности и DP IV-подобной активности в головном мозгу млекопитающих

Hartel-Schenk et al., 1990, исследовали появление DP IV во время развития в органах крыс Wistar в дни 10, 16 и 21 беременности и в дни 1, 4, 8, 13, 21 и 60 после родов, сравнивая иммуногистохимию и гистохимию активности. Во всех исследованных тканях иммунореактивность с поликлональным антителом появлялась раньше, чем активность DP IV, и присутствовала уже в день 10 беременности в плазматических мембранах эмбриональных и экстраэмбриональных (децидуальных) клетках. В этих и других участках, например, эндотелии капилляров мозга и эпителии трахеи или бронхов, иммунореактивность с поликлональным антителом уменьшалась или исчезала после родов, и активность фермента никогда не развивалась. Иммунореактивность с моноклональными антителами появлялась позднее, чем иммунореактивность с поликлональным антителом, и большей частью в структурах, где была впоследствии обнаружена активность DP IV. Моноклональное антитело против эпитопа D обнаружило высокую реактивность в эпидидимальном протоке, почечных собирающих каналах и во всех доменах плазматической мембраны гепатоцитов, где не наблюдали ни активности, ни иммунореактивности DP IV с другими антителами. Их результаты предполагают также, что DP IV может присутствовать в виде молекулы до того, как он становится каталитически активным, и что иммунореактивность появляется в большем числе сайтов, чем активность DP IV. С использованием иммуногистохимических способов Bernstein et al., 1987, исследовали присутствие иммунореактивности дипептидиламинопептидазы IV в материале головного мозга, полученном из плодов человека, новорожденных и пожилых лиц. Было обнаружено, что белок фермента в изобилии присутствует в незрелой ЦНС человека. В противоположность этому, головной мозг взрослого человека содержит гораздо меньшую иммунореактивность дипептидиламинопептидазы IV. Обсуждается, что этот фермент может играть важную роль в пролиферации и/или дифференцировке нейронов, в частности, в отношении его возможного действия на определенные нейротрофические пептиды (IGF II, гормон роста). Аминопептидаза М (АРМ), аминопептидаза А (АРА), дипептидилпептидаза IV (DP IV) и гамма-глутамилтрансфераза (GGT) были продемонстрированы гистохимически в криостатных срезах головного мозга крысы, чтобы показать распределение реакции в эпендиме, хороидальном сплетении и мягкой и паутинной оболочке мозга (лептоменинксе). GGT обнаруживался только в клеточных мембранах эпендимных клеток и в мягкой и паутинной оболочке мозга; однако, АРА, АРМ и DP IV обнаружили различную степень активности в эндотелии капилляров хороидального сплетения, а также в мягкой и паутинной оболочке головного мозга (Mitro & Lojda, 1988). Kato et al., 1979, обнаружили Х-пролилдипептидиламинопептидазную активность в головном мозгу крыс и исследовали изменения, связанные с развитием в различном возрасте. Общая активность фермента в расчете на мозг увеличивалась до 4-недельного возраста и затем уменьшалась во время созревания. Удельная активность в мозгу молодых крыс была более высокой, чем удельная активность в мозгу взрослых крыс. Свойства этого фермента головного мозга отличались от свойств этого фермента из гипофиза и других тканей. Nassel et al., 2000, исследовали появление пролинспецифической DP IV-активности в тканях тараканов. Частично очищенную DP IV-активность характеризовали из головного мозга и средней кишки L.maderae с использованием Gly-Pro-4-нитроанилида в качестве субстрата. Наивысшую активность получали из фракции мембран кишечника; приблизительно в 10 раз меньшую активность (на миллиграмм белка) получали из мембран головного мозга. Сообщалось, что, хотя 55% общей активности постпролиндипептидиламинопептидазы в мозгу морской свинки были связаны с растворимой фракцией этих клеток, остальная активность широко распределена по фракциям частиц. Однако значительная доля этой относящейся к частицам активности связана с фракцией синаптосомальных мембран (O'Connor & O'Cuinn, 1986). Гистохимическое исследование с использованием световой и электронной микроскопии выявило присутствие активности дипептидилпептидазы IV в тельцах Майсснера кожи безволосового макака. Активность этого фермента была обнаружена в фибробластподобных клетках, образующих неполную капсулу вокруг телец Майсснера. Отличающийся электроноплотный продукт реакции, обусловленный активностью дипептидилпептидазы IV, постоянно локализовался в плазматической мембране специализированных клетках Шванна (леммоцитах), окутывающих немиелинизированную часть сенсорных аксонов. Их аксолемма была лишена продукта реакции дипептидилпептидазы IV. (Dubovy, 1988).

De Bault & Mitro, 1994, исследовали локализацию мембранных протеаз глутамиламинопептидазы (ЕАР), микросомной аланиламинопептидазы (mAAP), дипептидилпептидазы IV (DP IV) и гамма-глутамилтранспептидазы (гамма-GTP) в сосудах субфорникального органа (SFO), эпендимы, которая покрывает поверхность SFO, и смежных структур головного мозга. Результаты гистохимических реакций фермента показали сильную активность ЕАР, mAAP и гамма-GTP, но, в противоположность вышеупомянутым открытиям, отсутствие DP IV в микрососудах SFO. Эпендима, которая покрывает SFO, была положительной в отношении гамма-GTP, но отрицательной в отношении других исследованных протеаз. Результаты авторов данного изобретения показали, что спектр ферментов в большинстве сосудов SFO является сходным со спектром микрососудов смежной ткани мозга, которые были положительными в отношении ЕАР, mAAP и гамма-GTP, но отрицательными в отношении DP IV. С использованием антител против кДНК для DP IV Hong et al., 1989, оценили тканевое распределение DP IV с применением молекулярных подходов в крысе. Иммуноблот-анализ показал, что DP IV присутствует в почке, легком и тонкой кишке на высоких уровнях, в печени и селезенке на умеренных уровнях и в сердце на низких уровнях. Самые высокие уровни мРНК для DP IV были обнаружены в почке и тонкой кишке в сравнении с умеренными уровнями, обнаруженными в легком, печени и селезенке. Самые низкие уровни мРНК DP IV были найдены в желудке, яичке, сердце, мышце и головном мозгу.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является обеспечение лекарственного средства, полезного для неврологических и психофизиологических эффектов. В частности, целью данного изобретения является обеспечение лекарственного средства, полезного для поведенческой и/или неврологической адаптивной реактивности на стресс, в том числе тревожности.

Кроме того, целью данного изобретения является преодоление или уменьшение вышеупомянутых проблем предшествующего уровня техники обеспечением фармакологического подхода, который приводит к постоянной или пролонгированной активности и/или эффекта NPY в головном мозгу млекопитающих.

Эти цели достигнуты посредством применения ингибитора дипептидилпептидазы IV (DP IV или CD26) или DP IV-подобного фермента для получения лекарственного средства для модуляции поведенческой и/или неврологической реактивности на стресс, в том числе тревожности.

Это приводит к усилению эндогенных неврологических или нейропсихологических эффектов, опосредуемых рецепторами Y1 NPY, в том числе, но не только, уменьшению тревожности, лечению гипертензии, лихорадочного состояния, расстройства сна, анорексии, связанных с тревожностью нарушений, в том числе депрессии, припадков, в том числе эпилепсии, синдрома отмены лекарственного средства и алкоголизма, нейродегенеративных нарушений, в том числе шизофрении, диагностируемых у субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает ферментативную активность DP IV в сыворотке субштаммов крыс Fischer 344 (F344) от животноводов из Ганновера (HAN), Соединенных Штатов (США), Германии (GER) и Японии (JAP). Результаты являются средними значениями (±SEM) (± стандартная ошибка среднего) 4-5 животных, сходных по возрасту, на генотип. Дисперсионный анализ выявил значимое действие "субштамма" с F(3, 15): 50,4, р<0,0001. Звездочки указывают значимые post hoc эффекты PLSD против субштаммов "дикого типа" F344USA и F344HAN ("***"=p<0,0001).

Фиг.2 показывает время, расходуемое во время активного "социального взаимодействия" (SI) в субштаммах крыс Fischer 344 (F344) от животноводов из Японии (JAP), Соединенных Штатов (USA) и Германии (GER). Увеличение времени SI в тесте "социального взаимодействия" крыс для определения тревожности интерпретируется как анксиолитикподобная реакция. Результаты являются средними значениями (±SEM) (± стандартная ошибка среднего) 12 животных, сходных по возрасту, на генотип. Дисперсионный анализ выявил значимое действие "субштамма" с F(2, 32): 8,8, р<0,0009. Звездочки указывают значимые post hoc эффекты PLSD против субштаммов крыс "дикого типа" F344USA ("**"=p<0,01; "***"=p<0,001).

Фиг.3 показывает изменение веса тела после стресса в течение трех последующих дней. В течение трех последующих дней животных одного возраста от животноводов из Японии (JAP), Соединенных Штатов (USA) и Германии (GER) по отдельности транспортировали в новую камеру и оставляли в ней на 1 час. В первый день использовали новую клетку, содержащую опилки, и животных помещали в стандартный стеллаж для животных. На второй день процедура была такой же, за исключением того, что клетка была без опилок. Процедура стресса на третий день была той же самой, что и на второй день, за исключением того, что клетку помещали на нижнюю часть новой камеры. Дисперсионный анализ для повторяемых измерений выявил значимое действие "субштамма" с F(2, 30): 13,5, р<0,0004. Звездочки указывают значимые post hoc эффекты PLSD однофакторных ANOVA, разделенных на дни, против субштаммов крыс "дикого типа" F344USA ("*"=p<0,05; "**"=p<0,01).

Фиг.4 показывает действие i.c.v. обработки изолейцилтиазолидином на расстояние, проходимое за четыре последующие минуты тестирования в "открытом поле". Дисперсионный анализ для повторяемых измерений не выявил значимого действия обработки на этот параметр активности F(3, 78): 0,7 (р<0,5, нет значимого различия).

Фиг.5 показывает действие i.c.v. обработки изолейцилтиазолидином на время, проведенное около стенки, в виде суммы четырех последующих минут тестирования в "открытом поле". Дисперсионный анализ выявил значимое действие "обработки" c F(3, 26): 4,1, р=0,015. Звездочки показывают значимые post hoc эффекты PLSD против "aCFS"-контролей ("*"=p<0,05).

Фиг.6 показывает действие i.c.v. обработки изолейцилтиазолидином на процент времени, проведенного на открытых ответвлениях приподнятого крестообразного лабиринта (ЕРМ). Дисперсионный анализ выявил значимое действие "обработки" c F(3, 26): 3,0, р=0,048. Звездочки показывают значимые post hoc эффекты PLSD против "aCFS"-контролей ("*"=p<0,05).

Фиг.7 показывает объединенную i.c.v. обработку aCSF, изолейцилтиазодином и NPY в комбинациях при различных дозах (изолейцилтиазолидин: 5 пмоль - 500 нмоль; NPY: 50 пмоль - 1,6 нмоль). Измеряли время, проведенное в активном "социальном взаимодействии" (SI-время) в анксиолитическом тесте "социального взаимодействия". Увеличение SI-времени является показателем анксиолитикподобного эффекта. После приучения к процедуре испытания животных несколько раз тестировали со случайным образом выбранной обработкой и всегда новыми партнерами взаимодействия. Тесты отделяли по меньшей мере 4 днями один от другого. Для каждого теста, охватывающего четыре группы из 5-6 животных на каждое условие, дисперсионный анализ выявил следующие значимые эффекты "обработки" (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; изолейцилтиазолидин+aCSF; изолейцилтиазолидин+NPY) слева направо: изолейцилтиазолидин 5 пмоль+NPY 50 пмоль: F(3, 18): 0,25, p=0,8, н.з.; изолейцилтиазолидин 50 пмоль+NPY 100 пмоль: F(3, 18): 22,4, p<0,0001; изолейцилтиазолидин 500 пмоль+NPY 200 пмоль F(3, 20): 8,6, p<0,007; изолейцилтиазолидин 50 нмоль+NPY 0,8 нмоль: F(3, 20): 23,3, p<0,0001; и изолейцилтиазолидин 500 нмоль+NPY 1,6 нмоль: F(3, 20): 11,2, p<0,0008. Звездочки показывают значимые post hoc эффекты PLSD против "aCFS+aCSF"-контролей и, как показано столбиками, между aCSF+NPY против изолейцилтиазолидин+NPY ("*"=p<0,05).

Фиг.8 показывает объединенную i.c.v. обработку aCSF, изолейцилтиазодином и NPY в комбинациях при различных дозах (изолейцилтиазолидин: 5 пмоль - 500 нмоль; NPY: 50 пмоль - 1,6 нмоль). Измеряли количество корма, съеденного в пределах 1 часа. Животных несколько раз тестировали со случайным образом выбранной обработкой. Тесты отделяли по меньшей мере 4 днями один от другого. Для каждого теста, охватывающего четыре группы из 5-6 животных на каждое условие, дисперсионный анализ выявил следующие значимые эффекты "обработки" (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; изолейцилтиазолидин+aCSF; изолейцилтиазолидин+NPY) слева направо: изолейцилтиазолидин 5 пмоль+NPY 50 пмоль: F(3, 18): 7,0, p=0,0025; изолейцилтиазолидин 50 пмоль+NPY 100 пмоль: F(3, 20): 4,5, p<0,016; изолейцилтиазолидин 500 пмоль+NPY 200 пмоль F(3, 20): 4,4, p<0,015; изолейцилтиазолидин 50 нмоль+NPY 0,8 нмоль: F(3, 20): 6,6, p<0,0027; и изолейцилтиазолидин 500 нмоль+NPY 1,6 нмоль: F(3, 20): 13,7, p<0,0001. Звездочки показывают значимые post hoc эффекты PLSD против "aCFS+aCSF"-контролей и, как показано столбиками, между aCSF+NPY против изолейцилтиазолидин+NPY ("*"=p<0,05).

Фиг.9 показывает объединенную i.c.v. обработку aCSF, изолейцилтиазодином и NPY в комбинациях при различных дозах (изолейцилтиазолидин: 5 пмоль - 500 нмоль; NPY: 50 пмоль - 1,6 нмоль). Измеряли количество корма, съеденного в пределах 12 часов. Для каждого теста, охватывающего четыре группы из 5-6 животных на каждое условие, дисперсионный анализ выявил следующие значимые эффекты "обработки" (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; изолейцилтиазолидин+aCSF; изолейцилтиазолидин+NPY) слева направо: изолейцилтиазолидин 5 пмоль+NPY 50 пмоль: F(3, 18): 0,5, p=0,7, н.з.; изолейцилтиазолидин 50 пмоль+NPY 100 пмоль: F(3, 20): 0,17, p<0,9, н.з.; изолейцилтиазолидин 500 пмоль+NPY 200 пмоль F(3, 20): 1,1, p<0,34, н.з.; изолейцилтиазолидин 50 нмоль+NPY 0,8 нмоль: F(3, 20): 1,2, p<0,3; и изолейцилтиазолидин 500 нмоль+NPY 1,6 нмоль: F(3, 20): 3,4, p<0,039. Звездочки показывают значимые post hoc эффекты PLSD против "aCFS+aCSF"-контролей и, как показано столбиками, между aCSF+NPY против изолейцилтиазолидин+NPY ("*"=p<0,05).

Фиг.10 показывает объединенную i.c.v. обработку с использованием антагониста Y1R BIBP3226, изолейцилтиазодина и NPY в комбинациях (BIBP3226: 100 нмоль; изолейцилтиазолидин: 50 нмоль; NPY: 0,8 нмоль). Измеряли время, проведенное в активном "социальном взаимодействии" (SI-время) в анксиолитическом тесте "социального взаимодействия". Увеличение SI-времени является показателем анксиолитикподобного эффекта. После приучения к процедуре испытания животных случайным образом относили к протоколам i.c.v. обработки и к партнерам взаимодействия, получавшим ту же самую обработку. Тесты охватывали две последовательные повторности с 6-8 животными в целом на каждое условие обработки. Дисперсионный анализ выявил значимое действие "обработки" с F(7, 44): 33,6, p<0,0001 для следующих групп: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP+aCSF+aCSF; (3) aCSF+изолейцилтиазолидин+aCSF; (4) BIBP+изолейцилтиазолидин+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP+aCSF+NPY; (7) aCSF+Р32/89+NPY; (8) BIBP+изолейцилтиазолидин+NPY. Уровень значимости в post hoc сравнениях против контролей (aCSF+aCSF+aCSF) показан звездочками ("*"=p<0,05; "**"=p<0,01; "***"=p<0,001) и против соответствующей обработки антагонистом (BIBP+n.n.) символами "#" ("#"=p<0,05; "##"=p<0,01; "###"=p<0,001). Все данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего (±SEM).

Фиг.11 показывает действие комбинированной i.c.v. обработки на 1-часовое потребление корма с использованием антагониста Y1R BIBP3226, изолейцилтиазодина и NPY в комбинациях (BIBP3226: 100 нмоль; изолейцилтиазолидин: 50 нмоль; NPY: 0,8 нмоль). После приучения к процедуре испытания животных случайным образом относили к протоколам i.c.v. обработки и к партнерам взаимодействия, получавшим ту же самую обработку. Тесты охватывали две последовательные повторности с 6-8 животными в целом на каждое условие обработки. Дисперсионный анализ выявил значимое действие "обработки" с F(7, 44): 5,4, p<0,0002 для следующих групп: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP+aCSF+aCSF; (3) aCSF+изолейцилтиазолидин+aCSF; (4) BIBP+изолейцилтиазолидин+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP+aCSF+NPY; (7) aCSF+Р32/89+NPY; (8) BIBP+изолейцилтиазолидин+NPY. Уровень значимости в post hoc сравнениях против контролей (aCSF+aCSF+aCSF) показан звездочками ("*"=p<0,05; "**"=p<0,01; "***"=p<0,001) и против соответствующей обработки антагонистом (BIBP+n.n.) символами "#" ("#"=p<0,05; "##"=p<0,01; "###"=p<0,001). Все данные представлены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего (±SEM).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В противоположность другим предлагаемым способам в данной области, данное изобретение обеспечивает приемлемую для перорального введения терапию с низкомолекулярными ингибиторами дипептидилпептидазы IV или DP IV-подобными ферментами. Данное изобретение представляет новый подход для лечения тревожности и других неврологических или психологических нарушений у млекопитающих. Этот подход является благоприятным для пользователя, коммерчески применимым и пригодным для применения в терапевтической программе лечения, в частности, касающейся заболевания человека.

Примерами приемлемых для перорального введения низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как N-(N'-замещенный глицил)-2-цианопирролидины, L-треоизолейцилтиазолидин, L-аллоизолейцилтиазолидин, L-треоизолейцилпирролидин, L-аллоизолейцилтиазолидин и L-аллоизолейцилпирролидин. Они описаны в US 6001155, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 С2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501 и WO 99/46272, описания которых включены здесь в качестве ссылки в их полном виде. Задачей этих агентов является ингибирование DP IV и посредством этого снижение уровней глюкозы в крови для эффективного лечения гипергликемии и сопутствующего заболевания, связанного с повышенными уровнями глюкозы в крови.

DP IV является ферментом, который представляет собой экзопептидазу, которая селективно расщепляет пептиды после предпоследних N-концевых остатков пролина и аланина. Эндогенные субстраты для этого фермента включают в себя инкретины, такие как глюкозазависимые инсулинотропные полипептиды, подобные GIP и GLP-1. В присутствии DP IV эти гормоны ферментативно восстанавливаются в неактивные формы. Неактивная форма GIP и GLP-1 не могут индуцировать секрецию инсулина, таким образом, уровни глюкозы крови повышаются, особенно в гипергликемическом состоянии. Повышенные уровни глюкозы крови были ассоциированы со многими различными патологиями, в том числе сахарным диабетом (Типа 1 и 2) и осложениями, сопровождающими сахарный диабет. DP IV-подобные ферменты могут быть, например, отобраны подверганием пептидаз тесту на селективность расщепления пептидов после предпоследних N-концевых остатков пролина и аланина, с отбором пептидазы, которая выполняет такое расщепление, и выделением этой пептидазы.

Было также обнаружено, что DP IV играет роль в опосредованных Т-клетками иммунных реакциях, например, при трансплантации органов. Было показано, что ингибирование DP IV пролонгирует сердечные аллотрансплантаты. Кроме того, ингибирование DP IV способствует супрессии ревматоидного артрита. DP IV приписывали также роль в проникновении ВИЧ в Т-клетки (Т-клетки-хелперы).

Эти различные эффекты ингибиторов дипептидилпептидазы IV подразумевают их воздействие на нормальные здоровые ткани и органы при их применении для лечения патологически измененной ткани. Задачей данного изобретения является развитие нацеленных на головной мозг агентов, которые поддерживают, увеличивают или пролонгируют эффект или активность NPY и которые проявляют высокую биодоступность и точно предсказуемое время активности в ткани-мишени.

Примерами мишеньспецифических, пригодных для перорального введения низкомолекулярных агентов являются пролекарства стабильных и нестабильных ингибиторов дипептидилпептидазы IV, которые имеют общую формулу А-В-С, где А представляет аминокислоту, В представляет химическую связь между А и С или аминокислоту, и С представляет нестабильный или стабильный ингибитор дипептидилпептидазы IV, соответственно. Они описаны в WO 99/67278, WO 99/67279, описания которых включены здесь в качестве ссылки в их полном виде.

Данное изобретение относится к новому способу, в котором введение ингибитор