Ингибитор интерлейкина-1, способ его получения, молекула днк, кодирующая ингибитор интерлейкина-1 и его предшественник

Ингибитор интерлейкина-1, способ его получения, молекула днк, кодирующая ингибитор интерлейкина-1 и его предшественник

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка является выделенной из заявки №4894343/13, поданной 26 ноября 1990 г., с приоритетом от 27 мая 1988 г.

А. ИЛ-1

Интерлейкины-1 представляют собой класс белков, продуцируемых множеством типов клеток, включая моноциты и некоторые макрофаги. Данный класс включает, по меньшей мере, два белка с молекулярной массой 17-18 килодальтон, известных как интерлейкин-1 альфа и интерлейкин-1 бета. Эти белки оказывают важные физиологические воздействия на целый ряд различных целевых клеток, вовлеченных в воспалительные и иммунные реакции. Белки представляют собой ко-митагены (с фитогемаглутинином) для Т-лимфоцитов, побуждая фибробласты и хондроциты секретировать латентную коллагеназу и повышая поверхностные адгезионные силы эндотелиальных клеток для нейтрофилов. Кроме того, они воздействуют на гипоталамус как пирогены, они стимулируют катаболизм мышечного белка, и они заставляют гепатоциты синтезировать класс белков, известных как "острофазовые реагирующие вещества". Таким образом, интерлейкины-1 (ИЛ-1), очевидно, представляют собой важную часть реакции организма на заражение и повреждение.

В. Патологические Роли ИЛ-1

Тем не менее, несмотря на обычно благоприятные воздействия ИЛ-1, возникают случаи, когда их эффекты становятся отрицательными. Например, ИЛ-1 может повышать уровень содержания коллагенов в подагрическом суставе и вовлечен в качестве медиатора острой и хронической стадий иммунопатологии в ревматоидный артрит. ИЛ-1 может быть ответственным за изменение функции эндотелиальных клеток, направляя хемотаксис и миграцию лейкоцитов и лимфоцитов в синовиальную ткань, индуцируя капиллярную пролиферацию и стимулируя аккумуляцию макрофагов в синовиальную выстилку в течение острой фазы данного заболевания. В фазе разрыва тканей ИЛ-1 вовлечен в качестве медиатора при индуцировании тканевого разрыва, стимулируя высвобождение ферментов из фибробластов и хондроцитов.

Кроме того, избыточное производство ИЛ-1 продемонстрировано в коже пациентов с псориазом, и высокие уровни ИЛ-1 можно найти в синовиальной жидкости пациентов с псориатическим артритом. ИЛ-1, высвобождаемый клетками в воспалительной синовиальной оболочке при псориатическом артрите, может обусловливать разрыв тканей, стимулируя высвобождение ферментов из других клеток. Суставная патология синдрома Рейтера аналогична наблюдаемой при псориатичеоком артрите и ревматоидном артрите. Кроме того, ИЛ-1 можно обнаружить в синовиальной жидкости пациентов, страдающих остеоартритом. Высвобождение ИЛ-1 хондроцитами вовлечено в разрыв суставного хряща при данном заболевании.

ИЛ-1 также может повышать тяжесть аутоиммунных заболеваний. Например, пониженное производство ИЛ-1 описано из периферических кровяных клеток у пациентов, страдающих общей красной волчанкой. Кроме того, некоторые изменения в функции В-лимфоцитов могут быть связаны с нарушениями в производстве ИЛ-1 или пригодности ИЛ-1.

Избыточное производство ИЛ-1 продемонстрировано в периферических моноцитах пациентов, страдающих склеродермией, и ИЛ-1 вовлечен в качестве потенциального агента фиброза посредством стимуляции производства коллагенов фибробластами. Механизм повреждения тканей при дерматомикозе может также включать клеточно-опосредованный иммунитет, и поэтому ИЛ-1 может быть вовлечен в качестве медиатора в данный патофизиологический процесс.

Острая и хроническая коллагеновая легочная болезнь отличается избыточным производством коллагена легочными фибробластами, которые могут стимулироваться ИЛ-1. Недавние исследования на животной модели относительно легочной гипертензии показывают, что ИЛ-1 может быть ответственным за индукцию изменения эндотелиальных клеток, которые приводят к сужению легочных артерий. Именно такое сужение приводит к легочной гипертензии и дальнейшему вторичному нарушению. Таким образом, ингибиторы ИЛ-1 могли бы стать пригодными средствами при лечении этих легочных заболеваний.

Последние исследования показывают, что ИЛ-1 способен непосредственно повреждать бета-клетки в островках Лангерганса, которые отвечают за производство инсулина. Разрушение клеток при помощи ИЛ-1 в настоящее время рассматривается как первичное событие в острой фазе юношеского сахарного диабета.

Инфильтрация моноцитов и макрофагов в почках господствует во многих формах острого и хронического гломерулонефрита. Высвобождение ИЛ-1 этими клетками может привести к локальной аккумуляции других воспалительных клеток, приводя в конце концов к воспалительному разрушению и фиброзной раекции в почках.

Показано, что кристаллы, обнаруженные в тканях или жидкостях при подагре или псевдопадагре, могут непосредственно симулировать макрофаги к высвобождению ИЛ-1. Таким образом, ИЛ-1 может быть важным медиатором в воспалительном цикле при таких заболеваниях.

ИЛ-1 способен индуцировать потерю кальция из костей и может быть ответственным за остеопороз, который наблюдается при воспалительных заболеваниях суставов.

Кератиноциты от пациентов, страдающих псориазом, высвобождают большие количества ИЛ-1. Этот медиатор может отвечать за вторичную пролиферацию клеток, которая происходит в коже пациентов, страдающих данным заболеванием.

ИЛ-1 является одним из важных эндогенных пирогенов и может отвечать за индуцирование заметной степени лихорадочного состояния, наблюдаемого при некоторых инфекционных заболеваниях, таких как острые лихорадочные заболевания, вызванные бактериями или вирусами.

Саркоидоз характеризуется гранулематозными повреждениями во многих органах тела. Показано, что ИЛ-1 способен индуцировать образование гранулем in vitro и может быть вовлечен в данный процесс у пациентов, страдающих саркоидозом.

Избыточное производство ИЛ-1 продемонстрировано в периферических моноцитах от болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Локальное высвобождение ИЛ-1 в кишечнике может стать важным медиатором в стимуляции воспалительного цикла при таких заболеваниях.

Некоторые лимфомы отличаются лихорадочным состоянием, остеопорозом и даже вторичным артритом. Избыточное производство ИЛ-1 продемонстрировано некоторыми клетками лимфомы in vitro и может отвечать за некоторые клинические проявления этих злокачественностей. Кроме того, ИЛ-1, продуцируемый некоторыми злокачественными лимфоцитами, может отвечать за определенные нарушения, такие как лихорадочное состояние, острофазовая реакция и общее истощение, которые наблюдаются при лейкемии.

Высвобождение ИЛ-1 астроцитами в мозге, как предполагают, отвечает за индуцирование фиброза, который может произойти в результате повреждения мозга от окклюзии сосудов.

С. Использование Ингибитора ИЛ-1

При таких и других обстоятельствах, когда ИЛ-1 имеет отрицательное воздействие, существует необходимость клинического использования ингибитора воздействия ИЛ-1. Поскольку ИЛ-1 представляет собой комитоген для Т-лимфоцитов, он имеет решающее значение для развития аутоиммунной и других иммунных заболеваний. Поэтому при системном введении ингибиторы ИЛ-1 могут стать полезными иммуно-супрессивными средствами. При локальном введении такие ингибиторы ИЛ-1 могут служить в деле предотвращения разрыва ткани в воспалительном суставе и других участках воспаления. На самом деле, для предотвращения деструкции тканей некоторые ингибиторы ИЛ-1 могли бы стать даже более эффективными, чем при введении в сочетании с ингибиторами коллагеназы.

Терапевтическое воздействие против влияния ИЛ-1 может стать возможным на уровне синтеза, секреции или связывания клеток-мишеней с белком. ИЛ-1 синтезируют моноцит/макрофагами и другими клетками в ответ на липополисахариды, фрагменты комплемента и вирусы. Любая молекула, которая блокирует связывание этих индуцирующих агентов с клетками продуцента или которая препятствует их влиянию на физиологию этих клеток, могла бы служить в качестве регулятора действия ИЛ-1. ИЛ-1 не секретируется традиционной системой секреции поскольку выделены мРНК, кодирующие по меньшей мере два предшественника белков С молекулярной массой 50 кД, но не содержащие гидрофобную сигнальную последовательность. Высвобождение активного белка из неактивного предшественника, по-видимому, требует осуществления протеолиза данного предшественника. Ингибитор высвобождения одного ИЛ-1 или нескольких ИЛ-1 из их предшественников теоритически мог бы регулировать действие ИЛ-1. По-видимому, ИЛ-1 воздействует на клетки-мишени посредством классического рецептор-опосредованного пути, хотя данный рецептор еще не выделен. Поэтому, вполне вероятно, что молекула, препятствующая связыванию ИЛ-1 с его рецепторами или регулирующая эти рецепторы, также может регулировать действие ИЛ-1. Кроме того, хотя все еще на вполне понятны внутриклеточные процессы после рецепторного связывания ИЛ-1, возможно, что существуют агенты, которые могут препятствовать клеточным реакциям на другие рецептор-опосредованные события, а посему могут блокировать действие ИЛ-1. По причинам, указанным выше, изыскиваются белки и малые молекулы, способные ингибировать ИЛ-1 одним или более из числа вышеприведенных способов. Заявитель неожиданно обнаружил, что существуют по меньшей мере два белка ингибиторов ИЛ-1 со свойствами ингибрования ИЛ-1. Эти молекулы получены в очищенной форме, которая позволяет специалисту в данной области знания определить их аминокислотную последовательность. Более того, охарактеризовано получение клеток, которые продуцируют эти белки, а также мРНК, которая приводит к их синтезу. Наконец, выявлены антисыворотки, которые облегчают задачу скрининга библиотек экспрессии кДНК для генов, кодирующих эти ингибиторы. Эти реагенты вместе позволяют кодировать кДНК, кодирующие ингибиторы ИЛ-1. В свою очередь, эти гены создают возможность крупномасштабного производства ингибиторов ИЛ-1, пригодных для использования в технологии приготовления лекарственных средств, полезных при лечении патофизиологических состояний, опосредованных ИЛ-1.

Настоящее изобретение относится к ингибиторам ИЛ-1 ("ИЛ-1и"), более конкретно, к ингибитору ИЛ-1, имеющему моноцитное происхождение. Кроме того, настоящее изобретение относится к биологически активным аналогам этих ингибиторов.

Целью настоящего изобретения является получение очищенных форм ингибиторов ИЛ-1, которые являются активными против ИЛ-1 альфа или ИЛ-1 бета или их комбинации. Другой целью настоящего изобретения является получение этих ингибиторов в очищенных формах с тем, чтобы способствовать определению их аминокислотной последовательности. Дополнительной целью настоящего изобретения является получение аминокислотных последовательностей определенных ингибиторов ИЛ-1. Кроме того, идентификация биологически активных аналогов таких ингибиторов ИЛ-1 с усовершенствованными или эквивалентными свойствами также является одной из целей настоящего изобретения.

Кроме того, цель настоящего изобретения состоит в получении системы рекомбинантных ДНК для производства ингибиторов ИЛ-1 в соответствии с предлагаемым изобретением. Другая цель настоящего изобретения заключается в создании очищенных форм ингибиторов ИЛ-1 которые были бы ценными фармацевтическими препаратами, проявляющими активность против ИЛ-1.

Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения будут представлены частично в описании, а частично будут понятны из данного описания или из практики изобретения. Цели и преимущества могут быть реализованы и получены при помощи средств и методов, указанных в прилагаемой формуле изобретения.

Для достижения целей в соответствии с настоящим изобретением раскрыты ингибиторы ИЛ-1, которые проявляют ингибирующую активность в отношении ИЛ-1. Предпочтительные ингибиторы выделены в очищенной форме из моноцит-кондиционированной среды с моноцитами, выращенными на чашках, покрытых иммуноглобулином Г (ИгГ).

Предпочтительными ингибиторами в соответствии с настоящим изобретением являются ингибиторы 1, 2 и 3. Ингибиторы 1 и 2 представляют собой белки, которыми манипулируют в положениях, характерных для белков с молекулярной массой 22-23 кД, при полиакриламидном гель-электрофорезе с додецил-сульфатом натрия, и которые элюируют при 52 мМ и 60 мМ NaCl, соответственно, из колонки жидкостной экспресс-хроматографии белков Mono Q при специфических условиях. Кроме того, для достижения целей в соответствии с настоящим изобретением заявитель раскрывает фармацевтические композиции, содержащие по крайней мере один из активных компонентов, ингибитор ИЛ-1 предлагаемого изобретения или его биологически активный аналог.

Более того, для достижения целей настоящего изобретения также раскрывается система рекомбинантных ДНК для создания этих ингибиторов ИЛ-1 и их аналогов. Предпочтительный вариант данной системы включает по меньшей мере один кДНК-клон или его синтетический эквивалент, кодирующий по крайней мере один ингибитор ИЛ-1, вместе с векторами и клетками, составляющими систему экспрессии, способную экспрессировать раскрываемые здесь ингибиторы ИЛ-1. Также предлагаются антисыворотки для использования при идентификации этих кДНК клонов. Помимо этого, предлагаются системы экспрессии для получения этих ингибиторов ИЛ-1 с использованием указанных кДНК-клонов, их аналоги или другие ДНК-последовательности, кодирующие эти ингибиторы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1а и 1b изображают белковый профиль хроматографии Mono Q двух метаболически меченных моноцитных супернатантов. Клетки культивируют на чашках, покрытых ИгГ (1а) или фетальной телячьей сывороткой (1b).

Фиг.2а показывает окрашенные серебром гели фракций из областей, указанных на Фиг.1а и 1b.

Фиг.2b представляет собой авторадиограмму гелей, показанных на Фиг.2а.

Фиг.3а, b и с показывают данные относительно очищенного ингибитора ИЛ-1 Примера 1. Фиг.3а приводит данные хроматографии с рисунком радиоактивности. Фиг.3b представляет собой окрашенные серебром гели относительно образцов фракций, показанных на Фиг.3а, Фиг.3с показывает авторадиограммы гелей на Фиг.3b.

Фиг.4a и b отображают результаты гель-фильтрационных хроматограмм ингибитора ИЛ-1, очищенного на колонке Mono Q.

Фиг.5а и b показывают результаты Вестерн-анализа мышиных антисывороток.

Фиг.6 изображает конструирование плазмиды pSVXVPL 2-11-1i.

Фиг.7 изображает конструирование плазмиды рМК - SGE:IL-1i.

Фиг.8а-d изображают данные относительно IL-1i-α (ингибитора ИЛ-1-альфа), Фиг.8а и 8b отображают хромотографические данные. Фиг.8с изображает окрашенный серебром гель на образцах фракций, указанных на Фиг.8b. Фиг.8d изображает авторадиограмму.

Фиг.9а и 9 представляют данные относительно ингибитора ИЛ-1-бета (IL-1i-β). Фиг.9а отображает данные хроматографии. Фиг.9 отображает данные полиакриламидного гель-электрофореза с додецилсульфатом натрия.

Фиг.10 отображает данные относительно фракционирования пептицидов IL-1i-α.

Фиг.11 отражает данные относительно фракционирования пептидов IL-1i-α.

Фиг.12а представляет собой фотографию геля с GT10-IL 1i-2A, переваренного с применением EcoRI после электрофореза в соответствии с Примером 6.

Фиг.12b отражает данные авторадиограммы Саузерн-блоттинга геля, приведенного на Фиг.12а.

Фиг.13 изображает часть ДНК-последовательности протеинкодирующей области лямбда GT10-IL 1i-2А и предсказанной аминокислотной последовательности в соответствии с Примером 6.

Фиг.14 изображает нуклеотидную последовательность GT-10-IL 11i-2А.

Фиг.15 изображает пептид, включающий, inter alia, последовательность IL-1i и секреторную лидерную последовательность мономерных остатков.

Ниже приведены более подробно предпочтительные варианты изобретения, которые вместе с приводимыми примерами способствуют пояснению принципов настоящего изобретения.

А. Ингибитор из Человеческих Моноцитов

Как отмечается выше, настоящее изобретение относится к ингибиторам ИЛ-1, которые выделены в очищенной форме. Предпочтительно, ингибиторы ИЛ-1 настоящего изобретения получают из среды, кондиционированной человеческими моноцитами, в которой моноциты выращивают в сосудах, покрытых ИгГ. Кроме того, настоящее изобретение охватывает в основном очищенные ингибиторы ИЛ-1 любого происхождения, которые биологически эквивалентны ингибитору, полученному из человеческой моноцитсодержащей среды.

В описании изобретения и в ее формуле под термином "биологически эквивалентный" заявитель подразумевает композиции настоящего изобретения, способные предотвращать действие ИЛ-1 аналогично, однако необязательно в такой же степени, что и нативный ингибитор ИЛ-1, выделенный из моноцитов. Под термином "в основном гомологичный" в описании и формуле изобретения подразумевается степень гомологии к нативному ингибитору ИЛ-1, выделенному из моноцит-кондиционированной среды, превышающая ту степень гомологии, которая проявляется любыми ранее приведенными ингибиторами ИЛ-1. Предпочтительно, если степень гомологии превышает 70%, более предпочтительно - превышает 80% и наиболее предпочтительно - превышает 90%. Особенно предпочтительная группа ингибиторов имеет свыше 95% гомологии к нативному ингибитору. Процент гомологии вычисляют как процентное содержание аминокислотных остатков в наименьшей из двух последовательностей, которые располагаются на одном уровне с идентичными аминокислотными остатками в последовательности, сравниваемой тогда, когда можно ввести четыре промежутка в длину из 100 аминокислот с тем, чтобы способствовать данному расположению, как указано Дэйхоффом М. в Атласе Белковой Последовательности и Структуры, Том 5, стр.124 (1972), Национальная Организация по Биохимическим Исследованиям, Вашингтон, округ Колумбия, причем данная работа упоминается здесь в качестве отсылки.

Предпочтительные ингибиторы ИЛ-1 настоящего изобретения получают из моноцит-кондиционированной среды и они впервые выделены в очищенной форме. Для целей настоящей заявки "чистая форма" или "очищенная форма" относительно раскрываемых ингибиторов ИЛ-1 означает препарат, который является в значительной степени свободным от других белков, которые не есть белки ингибиторов ИЛ-1. Предпочтительно, ингибиторы ИЛ-1 настоящего изобретения имеют по меньшей мере 90% чистоты, более предпочтительно 95% чистоты.

По крайней мере, три очищенных ингибитора ИЛ-1 выделены методами Примера. Они включают ингибитор 1, ингибитор 2 и ингибитор 5. Ингибитор 1 проявляет себя как молекула с молекулярной массой 22-23 кД при полиакриламидном гель-электрофорезе с додецилсульфатом натрия с приближенной изоэлектрической точкой 4,8, и его элюируют из колонки жидкостной экспресс-хроматографии белков Mono Q при 52 мМ NaCl в Трис-буфере, рН 7,6. Ингибитор 2 также представляет собой белок с молекулярной массой 22-23 кД, изоэлектрической точкой 4,8, однако его элюируют из колонки Mono Q при 60 мМ NaCl. Ингибитор 3 представляет собой белок с молекулярной массой 20 кД и элюирует из колонки Mono Q при 48 мМ NaCl. Ингибиторы 1, 2 и 3 родственны иммунологически и функционально. Получение этих ингибиторов в очищенной форме позволяет заявителю создать их аминокислотные последовательности. С использованием очищенных ингибиторов, описанных впервые в настоящей заявке, и методов, таких, которые описаны здесь и в технических руководствах по Белковому Секвенатору ABI, можно вывести значительную часть аминокислотных последовательностей данных ингибиторов. Пример 3 показывает данные аминокислотной последовательности, полученные от трех видов ингибиторов ИЛ-1, а именно IL-1i-X, IL-1i-α и IL-1i-β.

Заявитель обнаружил по крайней мере одно антитело против ингибитора ИЛ-1. Другие поликлональные и моноклональные антитела против данного и других ингибиторов ИЛ-1 можно получить известными в данной области техники способами. Одно конкретное поликлональное антитело описано в Примере 4.

В. Рекомбинантный Ингибитор

1. Общее

В настоящее время раскрыт метод рекомбинантных ДНК для получения ингибитора ИЛ-1. В одном варианте изобретения активный сайт функционирует биологически эквивалентным образом относительно нативного ингибитора ИЛ-1, выделенного из человека. Последовательность натуральной или синтетической ДНК можно использовать для непосредственного получения ингибиторов ИЛ-1. Данный способ предусматривает:

(a) получение ДНК-последовательности, способной направлять клетку-хозяина к получению белка, имеющего активность ингибирования ИЛ-1,

(b) клонирование ДНК-последовательности в вектор, способный трансфецироваться и реплицироваться в клетке-хозяине, причем указанный вектор содержит операционные элементы, необходимые для экспрессии ДНК-последовательности,

(с) перенос вектора, содержащего синтетическую ДНК-последовательность и операционные элементы, в клетку-хозяина, способную экспрессировать ДНК, кодирующую ингибитор ИЛ-1,

(d) культивирование клеток-хозяев при условиях, подходящих для амплификации вектора и экспрессии ингибитора,

(е) сбор ингибитора и

(f) наделение ингибитора активной третичной структурой, посредством чего он обладает активностью ингибирования ИЛ-1.

2. Последовательности ДНК

Последовательности ДНК, предусмотренные для использования в данном способе, обсуждены частично в Примере 5 и частично в Примере 6. Предполагается, что эти последовательности включают синтетические и натуральные ДНК-последовательности. Натуральные последовательности, кроме того, включают сегменты кДНК или геномной ДНК.

Пример 6 предлагает молекулярный клон ДНК, кодирующей белок, идентичный выделенному в Примерах 1-3. В примере 6 бляшку GT10-IL 1i-2A выделяют из библиотеки GT10. Размножают фаг в пределах данной бляшки и ДНК выделяют и переваривают с помощью EcoRI. Фрагмент EcoRI величиной 1850 пар оснований несет кодирующую последовательность для ингибитора IL 1. Фиг.13 показывает частичную ДНК-последовательность фрагмента EcoRI.

С учетом приведенных здесь доктрин и методик специалист в данной области знания в состоянии получить другие синтетические полинуклеотидные последовательности. В качестве примера настоящего уровня техники, относящегося к полинуклеотидному синтезу, можно привести работы Matt euccl, М.Д. and Carutners, М.Н., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981) и Beaucage, S.L. and Caruthers, М.Н., Tetrahedron lett. 22: 1859 (1981), а также инструкции, представленные с олигонуклеотидным синтезатором ABI.

Эти синтетические последовательности могут быть идентичными натуральным последовательностям, описанным более подробно ниже, или они могут содержать другие нуклеотиды. В одном варианте, если синтетические последовательности содержат нуклеотиды, отличающиеся от тех, которые обнаружены в натуральных ДНК-последовательностях настоящего изобретения, предполагается, что эти отличающиеся последовательности все же кодируют полипептид, который имеет ту же первичную структуру, что и ИЛ-1и, выделенный из моноцитов. В альтернативном варианте синтетическая последовательность, содержащая отличающиеся нуклеотиды, кодирует полипептид, который имеет такую же биологическую активность, что и ИЛ-1и, описываемый в данной заявке.

Кроме того, последовательностью ДНК может быть фрагмент натуральной последовательности, то есть фрагмент полинуклеотида, который встречается в природе и который выделен и очищен в первый раз настоящим заявителем. В одном варианте ДНК-последовательность представляет собой рестрикционной фрагмент, выделенный из кДНК-библиотеки.

В альтернативном варианте ДНК-последовательность выделяют из человеческой геномной библиотеки. Пример такой библиотеки, пригодной в данном варианте, приведен Lawn et al. Cell, 75: 1157-1174 (1978), и данная работа приведена здесь в качестве отсылки.

В предпочтительной версии, данного варианта предполагается, что натуральную ДНК-последовательность получают способом, который предполагает:

(a) получение человеческой кДНК-библиотеки из клеток, предпочтительно моноцитов, способных генерировать ингибитор ИЛ-1 в векторе и клетке, способных амплифицировать и экспрессировать всю или часть этой кДНК,

(b) зондирование библиотеки человеческой геномной ДНК, по меньшей мере, одним зондом, способным связываться с геном или его белковым продуктом ингибитора ИЛ-1,

(c) идентифицирование, по меньшей мере, одного клона, содержащего ген, кодирующий ингибитор, благодаря способности клона связывать по меньшей мере один зонд для гена или его белкового продукта,

(d) выделение гена или части гена, кодирующего ингибитор, из клона или клонов,

(е) связывание гена или его пригодных фрагментов с операционными элементами, необходимыми для поддержания и экспрессии гена в клетке-хозяине.

Натуральные ДНК-последовательности, пригодные в данном способе, также могут быть идентифицированы и выделены при помощи метода, который предусматривает:

(а) получение библиотеки человеческой геномной ДНК, предпочтительно размноженной в хозяине Е.coli recA recBC,

(b) зондирование библиотеки человеческой геномной ДНК, по меньшей мере, одним зондом, способным связываться с геном или его белковым продуктом ингибитора ИЛ-1,

(с) идентификацию, по меньшей мере, одного клона, содержащего ген, кодирующий ингибитор, благодаря способности клона связывать, по меньшей мере, один зон для гена или его белкового продукта,

(d) выделение гена, кодирующего ингибитор, из клона (клонов), который идентифицирован, и

(е) связывание гена или его пригодных фрагментов с операционными элементами, необходимыми для поддержания и экспрессии гена в клетке-хозяине.

При выделении натуральной ДНК-последовательности, пригодной для использования в вышеприведенном способе, предпочтительно идентифицировать два рестрикционных сайта, расположенных в пределах и в непосредственной близости к концевым частям соответствующего гена или секций гена. ДНК-сегмент, содержащий соответствующий ген, затем удаляют из оставшегося геномного материала с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции. После иссечения 3' и 5' концы ДНК-последовательности и любые соединения экзона подвергают реконструкции с получением соответствующих ДНК-последовательностей способных кодировать N- и С-концы белка ингибитора ИЛ-1 и способных синтезировать ДНК-последовательность с ее операционными элементами.

3. Векторы

(а) Микроорганизмы, в частности, E.coli

Векторы, предусмотренные для использования в настоящем изобретении, включают любые векторы, в которые можно ввести обсуждаемую здесь ДНК-последовательность вместе с любыми предпочтительными или необходимыми операционными элементами, и которые затем можно последовательно перенести в клетку-хозяина и реплицировать в такой клетке. Предпочтительными векторами являются те, чьи рестрикционные сайты хорошо документированы и которые содержат операционные элементы, являющиеся предпочтительными или необходимыми для транскрипции ДНК последовательности. Тем не менее, предусматриваются некоторые варианты настоящего изобретения, которые используют нераскрытые к настоящему времени векторы, которые могли бы содержать одну или несколько кДНК-последовательностей, обсуждаемых в настоящей заявке. В частности, предпочтительно, чтобы все эти векторы имели некоторые или все следующие характеристики: (1) обладание минимальным числом последовательностей организма-хозяина, (2) устойчивое поддержание и размножение в желательном хозяине, (3) способность присутствовать в желательном хозяине с высоким числом копий, (4) обладание регулируемым промотором, расположенным так, чтобы промотировать транскрипцию искомого гена, (5) наличие, по меньшей мере, одной маркерной ДНК-последовательности, кодирующей селектируемый признак, присутствующий на части плазмиды отдельно от той части, куда инсерцируют ДНК-последовательность, (6) ДНК-последовательность, способную терминировать транскрипцию.

В различных предпочтительных вариантах изобретения эти клонирующие векторы, содержащие и способные экспрессировать ДНК-последовательности настоящего изобретения, содержат различные операционные элементы. Эти "операционные элементы", как они обсуждаются в данной заявке, включают по меньшей мере один промотор, по меньшей мере одну последовательность Shine - Dalgarno и инициаторный кодон, а также по меньшей мере один терминирующий кодон. Предпочтительно, если эти "операционные элементы" также включают по меньшей мере один оператор, одну лидерную последовательность для белков, экспортируемых из внутриклеточного пространства, по меньшей мере один ген для регуляторного белка, а также любые другие ДНК-последовательности, необходимые или предпочтительные для соответствующей транскрипции и последующей трансляции векторной ДНК.

Некоторые из этих операционных элементов могут присутствовать в каждом из предпочтительных векторов настоящего изобретения. Предполагается, что любые дополнительные операционные элементы могут быть включены в данные векторы с использованием методов, известных в данной области техники, в частности, в свете приведенных здесь положений.

На практике можно конструировать каждый из этих векторов таким образом, который позволяет осуществить беспрепятственное выделение, сборку и взаимозаменяемость. Это облегчает сборку многочисленных функциональных генов из комбинаций этих элементов и кодирующей области ДНК-последовательностей. Кроме того, многие из этих элементов могут использоваться в более чем одном хозяине. Предполагается также, что в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения векторы могут содержать ДНК-последовательности, способные функционировать в качестве регуляторов ("операторов"), и другие ДНК-последовательности, способные кодировать регуляторные белки.

(I) Регуляторы

В одном варианте настоящего изобретения эти регуляторы служат целям предотвращения экспрессии ДНК-последовательности в присутствии определенных окружающих условий, позволяют осуществить транскрипцию и последующую экспрессию белка, кодируемого ДНК-последовательностью. В частности, предпочтительно, если регуляторные сегменты инсерцированы в вектор так, что не происходит экспрессия ДНК-последовательности, или происходит в значительной степени ограниченно в отсутствие, например, изопропилтио-бета-D-галактозида. В данной ситуации трансформированные микроорганизмы, содержащие ДНК-последовательность, можно выращивать до желательной плотности перед началом экспрессии ИЛ-1и. В данном варианте экспрессию желательного белка индуцируют путем прибавления вещества в микробную среду, которое способно вызывать экспрессию ДНК-последовательности после достижения желательной плотности.

(II) Промоторы

Векторы экспрессии должны содержать промоторы, которые могут быть использованы организмом-хозяином для экспрессии его собственных белков. Хотя обычно используют систему лактозных промоторов, выделены и охарактеризованы другие микробные промоторы, позволяющие специалистам использовать их для экспрессии рекомбинантного ИЛ-1и.

(III) Терминатор транскрипции

Предполагаемые терминаторы транскрипции обеспечивают стабилизацию вектора. В частности, последовательности, описанные в работе Rosenberg, М. and Court, Д., Ann. Rev. Genet. 13: 319-353 (1979), предполагается использовать в настоящем изобретении.

(IV) Нетранслированная последовательность

Следует отметить, что в предпочтительном варианте изобретения можно реконструировать 3' или 5' конец кодирующей области с тем, чтобы осуществить введение 3' или 5' нетранслированных последовательностей в генный транскрипт. Среди этих нетранслированных последовательностей можно отметить те, которые идентифицированы Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg, M. and Court, D., J. Molec. Biol., 176: 39-53 (1984), причем данная работа введена в описание изобретения в качестве отсылки.

(V) Сайты рибосомного связывания

Микробная экспрессия инородных белков требует наличия определенных операционных элементов, которые, не ограничиваясь, включают сайты рибосомного связывания. Сайт рибосомного связывания представляет собой последовательность, которую рибосома распознает и привязывается к которой в начале белкового синтеза, как указано в работе Gold, L., et al., Ann. Rev. Microbio. 35: 557-580, или работе Marguis, D.M., et al., Genc 42: 175-183 (1986), которые введены в данное описание в качестве отсылок. Предпочтительным сайтом рибосомного связывания является GAGGGCGAAAAA (ATC).

(VI) Лидерная последовательность и Трансляционный линкер

Помимо этого, предпочтительно, если ДНК, кодирующая соответствующую секреторную лидерную (сигнальную) последовательность, присутствует у 5' конца ДНК-последовательности, как указано в работе Watson, M.E., Nucl. Acids. Res. 12: 5145-5163, которая введена в данное описание в качестве отсылки, если белок необходимо секретировать из цитоплазмы, ДНК для лидерной последовательности может быть в положении, которое обеспечивает производство гибридного белка, в котором лидерная последовательность непосредственно примыкает к ингибитору и ковалентно с ним связана, то есть между двумя ДНК-кодирующими последовательностями не должно быть сигналов транскрипционной или трансляционной терминации. Присутствие лидерной последовательности желательно частично по одной или более следующим причинам. Во-первых, присутствие лидерной последовательности может облегчить процессинг ингибитора ИЛ-1 со стороны хозяина. В частности, лидерная последовательность может направлять расщепление продукта начальной трансляции с помощью лидерной пептидазы, удаляя лидерную последовательность и оставляя полипептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет потенциальную белковую активность. Во-вторых, присутствие лидерной последовательности может облегчать очистку ингибитора ИЛ-1 путем удаления белка из клеточной цитоплазмы. В некоторых видах микроорганизмов хозяина присутствие подходящей лидерной последовательности способствует транспортировке нативного белка в периплазматическое пространство, как в случае с некоторыми Е.coli. В случае с определенными Е.coli, Saccharomyces и штаммами Bacillus и Pseudomonas соответствующая лидерная последовательность способствует транспортировке белка через клеточную мембрану в экстрацеллюлярную среду. В данном случае белок может быть очищен от экстрацеллюлярного белка. В-третьих, в случае некоторых белков, полученных в соответствии с настоящим изобретением, присутствие лидерной последовательности может быть необходимым для расположения нативного белка в среде, в которой он может быть упорядочен с тем, чтобы принять его активную структуру, которая обладает соответствующей белковой активностью.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дополнительную ДНК-последовательность располагают непосредственно перед ДНК-последовательностью, которая кодирует ингибитор ИЛ-1. Дополнительная ДНК-последовательность способна функционировать как трансляционный линкер (сшивающий агент), то есть она представляет собой ДНК-последовательность, которая кодирует РНК, служащую для расположения рибосом в непосредственной близи от сайта рибосомного связывания РНК ингибитора, с которой она соприкасается. В одном варианте настоящего изобретения трансляционный линкер можно получить с использованием ДНК-последовательности TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG и способов, известных в настоящее время специалистам в области, относящейся к трансляционным линкерам.

(VII) Трансляционный терминатор

Предполагаемые трансляционные терминаторы служат цели приращения трансляции мРНК. Они могут быть либо натуральными, как описано в работе Kohli, J., Mol. Gen. Genet. 182: 450-439, или синтетическими, как описано в работе Pettersson, R.F. Gene 24: 15-2 (1983), причем обе работы введены в данное описание в качестве отсылок.

(VIII) Селектируемый маркер

Предпочтительно, чтобы клонирующий вектор содержал селектируемый маркер, который вызывает экспрессию селектируемого признака микроорганизмом хозяина. В одном варианте настоящего изобретения в вектор включен ген, придающий устойчивость к ампициллину, тогда как в других плазмидах включен ген, придающий устойчивость к тетрациклину, или ген, придающий устойчивость к хлорамфениколу.

Такой селектируемый маркер или другой предназначен для частичного содействия в селекции трансформантов. Кроме того, присутствие такого селектируемого маркера в клонирующем векторе может найти применение в деле сохранения загрязняющих микроорганизмов в стороне от пр