Способ ранней диагностики диабетической нейропатии у детей

Способ ранней диагностики диабетической нейропатии у детей

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к детской эндокринологии, и может быть использовано для ранней диагностики диабетической нейропатии (ДНП) у детей, страдающих сахарным диабетом 1 типа (СД 1).

СД 1 - синдром хронической гипергликемии и глюкозурии, обусловленный абсолютной инсулиновой недостаточностью, приводящей к нарушению всех видов обмена веществ, поражению сосудов, нейропатии и патологическим изменениям в различных органах и тканях (М.И.Балаболкин, «Диабетология», М., 2000, с.155).

По данным ВОЗ, 2000, г., одним из наиболее частых, но наименее изученных осложнений, является ДНП, приводящая к ранней инвалидизации больных СД 1, что определяет актуальность изучения данной патологии. Если ранее ДНП являлась прерогативой взрослого населения, то в последние годы диагноз ДНП все чаще устанавливается уже в детском возрасте. Причем распространенность ДНП колеблется в достаточно широких пределах - 5-90% (В.А.Петеркова, 1997; Г.Р.Галстян, 2000). Расхождения данных в частоте ДНП наблюдаются из-за отсутствия стандартизированных диагностических критериев, использования диагностических методов с разной степенью специфичности, а также преобладанием в детском возрасте субклинической стадии. В этой связи разработка ранних диагностических критериев развития ДНП у детей представляет несомненный интерес.

Ранняя диагностика ДНП у детей, еще на доклинической стадии вызывает в повседневной практике детских эндокринологов настоятельную необходимость, так как в детском возрасте начальные проявления ДНП в большей степени обратимы (В.А.Петеркова с соавт. «Диагностика, лечение и профилактика диабетических осложнений у детей и подростков», М., 1997).

В настоящее время отсутствуют четкие диагностические критерии начальных проявлений ДНП у детей. Используемая Шкала Нейропатического Дисфункционального счета (НДС) для определения выраженности симптомов диабетической полинейропатии включает суммарную количественную оценку тактильной, температурной, болевой, вибрационной чувствительности и нарушений сухожильных рефлексов (Young M.J., Boulton A.J.M., Macleod A.F., Williams D.R.R., Sonsken P.Н.A multicentre study of the prevalence of diabetic peripheral neuropathy in the United Kingdom hospital clinic population. Diabetologia, 1993; 36:150-154). Данная методика носит субъективный характер и ее информативность во многом зависит от возраста ребенка, эмоционального статуса, условий проведения (в спокойном и расслабленном состоянии), состояния кожных покровов (наличие трофических изменений, отечности), невозможности четкой оценки ребенком поставленной перед ним задачи.

Электромиографическое исследование (ЭМГ) является объективным и воспроизводимым методом состояния периферических нервов (Э.П.Касаткина. «Отчет по оценке эффективности преперата «Мильгамма драже - 100», (фирма Верваг Фарма Гмбх, Германия) у детей и подростков с диабетической периферической полинейропатией», M., 1998). Однако, ЭМГ изменения в виде снижения проводимости нервного импульса чувствительных и двигательных периферических нервов, снижения амплитуды нервно-мышечных индуцированных потенциалов являются неспецифичными и могут отмечаться и при других нервно-мышечных заболеваниях. Отрицательными моментами данного исследования являются также возрастные ограничение (проводится только детям старше 7 лет), оно требует использования сложного дорогостоящего оборудования, которое применяется только в условиях специализированных диагностических центров.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ диагностики ранней диабетической оптической нейропатии по патенту РФ№2242008 от 10.12.2004.

Способ включает определение у больных сахарным диабетом активности щелочной фосфатазы в слезной жидкости и если ее активность менее 110 Ед/л, то диагностируют диабетическую оптическую нейропатию. Недостатками этого исследования являются специфичность способа диабетической оптической нейропатии, что позволило авторам высказать сомнение в использовании активности щелочной фосфатазы в слезной жидкости как маркера развития и прогрессирования других диабетических осложнений; а также отсутствие в исследовании данных при наличии ДНП. Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задачей изобретения является разработка более точного, объективного способа ранней диагностики ДНП у детей.

Поставленная цель достигается тем, что у пациентов, страдающих сахарным диабетом 1 типа с различной длительностью заболевания, определяют уровень ЭТ-1 и bFGF в сыворотке крови и при соотношении ЭТ-1 к bFGF, равном 40 и выше, диагностируют субклиническую стадию ДНП, что позволяет своевременно назначить превентивную терапию.

Заявляемый способ исключает наличие субъективизма, не зависит от возраста, эмоционального статуса пациента и позволяет врачу с высокой достоверностью по сывороточному уровню ЭТ-1 и bFGF сделать вывод об отборе ребенка, страдающего сахарным диабетом 1 типа, в группу риска по развитию ДНП, и своевременно назначить патогенетическую терапию. Эта мера будет способствовать снижению риска развития поздних сосудистых осложнений диабета, улучшению состояния здоровья и качества жизни детей с СД 1. В патогенезе диабетической нейропатии ведущую роль играют сосудистые нарушения, в частности изменение работы клеток эндотелия сосудов - эндотелиальная дисфункция (Кондратьев, 1998). Поскольку эндотелиальная дисфункция имеет место у большей части детей и подростков с диабетической микроангиопатией (Рыбкин А.И. и др., //Дисфункция эндотелия у детей и подростков как ранний признак диабетических микроангиопатий. - 3 Всероссийский диабетологический конгресс, тезисы докладов. - М. - 2004, С.580-581), мы сочли возможным использовать в качестве маркера ранней диагностики ДНП продуцируемый эндотелиальными клетками - ЭТ-1 и функционально сопряженный с ним bFGF.

Эндотелин-1, главный вазоконстрикторный пептид, является одним из важнейших регуляторов функционального состояния эндотелия. Образование ЭТ-1 происходит в эндотелиальных клетках как на поверхности, так и внутри клеточной мембраны эндотелия, а также на поверхности подлежащих гладкомышечных клеток. ЭТ-1 действует паракринным способом на рецепторы гладких мышц сосудов, вызывая их сокращение и рост, и аутокринно-/паракринным способом на эндотелиальные клетки, вызывая рилизинг вазорелаксантов и ростстимулирующих факторов.

Фактор роста фибробластов (FGF) стимулирует синтез ДНК и деление различных клеток мезенхимального происхождения, включая гладкомышечные и клетки сосудистого эндотелия (Stoker М. and Gherardi E., 1991).

В большом семействе FGF, насчитывающем более 20 разновидностей, наиболее изученным представляется bFGF. Причем bFGF причастен к функции нейрональных структур и секретирующих органов; он обладает хемотаксической активностью и стимулирует рост новых капилляров (Folkman J., Klagsbrun M., 1987), поддерживает и стимулирует дифференцировку клеток различных нейрональных типов in vivo и in vitro (Saunders K.B., D′Amore P.A., 1991). bFGF приписывается важная роль в репарации нервных клеток после травмы мозга (Kawamata Т., Yamaguchi Т., Shin-ya К., Hori Т. (2001) Neur. Res., 23, 327-330). Данный ростовой фактор также фигурирует в структуре патогенетических механизмов, описывающих ишемические и травматические повреждения мозга (Гомазков О.А., Нейрохимия ишемических и возрастных заболеваний мозга. Информационно-аналитическое издание. М., 2003).

В то же время согласно исследованиям in vitro FGF существенно влияет на функцию эндотелия, участвуя в контроле тонуса гладкомышечных клеток. bFGF стимулируют развитие коллатеральных сосудов и сохраняет эндотелиальную целостность, что было выявлено на модели ишемического повреждения сердца.

Таким образом, согласно представленным патогенетическим механизмам физиологически активные пептиды, такие как эндотелии-1 и основной фактор роста фибробластов, могут вносить свой вклад в развитие и прогрессирование ДНП у детей.

Высказанные теоретические предпосылки были подтверждены нашими исследованиями, выявившими обратно пропорциональную взаимосвязь между ЭТ-1 и bFGF на начальных этапах формирования ДНП, что позволило нам вывести коэффициент соотношения ЭТ-1 к bFGF, при значении которого 40 и выше можно диагностировать субклиническую стадию ДНП у детей с высокой точностью.

Подробное выполнение и работоспособность заявляемого способа подтверждаются следующими конкретными примерами.

Пример 1. Ребенок Полина М., 1988 г.р., история болезни №7821, наблюдается в детском эндокринном отделении РНИИАП в течение 1 года со поводу сахарного диабета 1 типа, течение заболевания тяжелое.

Жалоб при поступлении не предъявляет. Гликозилированный гемоглобин - 6,6%. Сумма баллов по шкале НДС составила 2 балла (расценена как вариант нормы) за счет умеренного снижения ахиллова рефлекса справа и некоторого снижения температурной чувствительности в дистальных отделах нижних конечностей.

При ЭМГ исследовании выявлена электрофизиологическая характеристика электрической активности исследуемых мышц аксонального типа; снижение электрической активности на икроножной, передней большеберцовой мышцах и длинном разгибателе пальцев стопы обеих ног, урежение частотных характеристик обследуемых групп мышц.

Определение уровня ЭТ-1 в сыворотке крови проводили наборами для ИФА фирмы DRG (США).

У больного брали 1 мл венозной крови в стеклянную пробирку с 1 мл ЭДТА. Центрифугировали в течение 15 минут при 1500 об/мин. Затем проводили экстракцию ЭТ из образца. К 200 мкл полученной плазмы добавляли 200 мкл экстрагирующего раствора, состоящего из ацетона, соляной кислоты и дистиллированной воды (в соотношении 40:1:5).

Центрифугировали содержимое пробирки 20 минут при 2000 g в холодовой центрифуге при +2-+8°С, переливали супернатант в пластиковую пробирку. Высушивали при +37°С в вентилируемом термостате в течение 4 часов.

К полученному осадку добавляли 200 мкл буфера для разведения образцов. Данный образец использовали непосредственно в опыте.

Перед проведением анализа отбирали необходимое количество стрипов, учитывая, что для каждого определения необходимо 6 лунок для построения калибровочной кривой и 1 лунка на каждый исследуемый образец предварительно подготовленной сыворотки.

Вставляли необходимое количество стрипов в держатель. Дважды промывали лунки промывочным фосфатно-солевым буфером.

Затем в первые 6 лунок прилили по 100 мкл приготовленных стандартных образцов с известной концентрацией ЭТ, в остальные лунки - по 100 мкл испытуемых образцов. Перемешивали содержимое встряхиванием на шейкере в течение 1 минуты, заклеивали лунки липкой лентой и инкубировали 1 час при +37°С в термостате.

По окончании инкубации промывали лунки 7 раз фосфатно-солевым буфером, высушив в конце стрипы постукиванием о фильтровальную бумагу.

Во все лунки добавляли по 100 мкл раствора конъюгата и инкубировали 30 минут в холодильнике при +4°С. Промывали лунки 9 раз фосфатно-солевым буфером.

Во все лунки добавляли по 100 мкл раствора субстрата и инкубировали 30 минут в термостате.

Останавливали реакцию добавлением 100 мкл останавливающего раствора в каждую лунку.

Регистрацию и обсчет результатов проводили на фотометре «Multiscan» (Дания) при 450 нм.

В компьютерное обеспечение прибора вводили численные значения концентрации стандартных образцов и при обсчете получали численные значения искомых концентраций испытуемых образцов в пкг/мл.

Длительность анализа 6,5 часов. Чувствительность метода 0,14 пкг/мл, специфичность - 99,4%.

Определение bFGF проводили методом твердофазного ИФА наборами фирмы CYTIMMUNE (США).

У больного брали 1 мл венозной крови в стеклянную пробирку с 1 мл ЭДТА. Центрифугировали в течение 15 минут при 1500 об/мин.

Перед проведением анализа все компоненты доводили до комнатной температуры и приготовили растворы реактивов, серийные разведения стандартов согласно инструкции к набору.

В соответствующие лунки планшета, покрытые козьими антикроличьими антителами, вносили по 100 мкл стандартных растворов. Опытные образцы сыворотки предварительно разводили следующим образом: 100 мкл пробы +100 мкл растворителя II+200 мкг растворителя I смешивали в пробирке. 100 мкл готового образца добавляли в соответствующую лунку.

Приливали 25 мкл разбавленных кроличьих античеловеческих анти bFGF поликлональных антител в каждую лунку. Накрывали планшет пленкой и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем осторожно снимали пленку и добавляли 25 мкл конъюгата в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем проводили пятикратную промывку планшета на вошере промывочным буфером. Во все лунки планшета добавляли 50 мкл разведенного стрептавидинового конъюгата с щелочной фосфотазой. Накрывали плашнет и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Повторяли процедуру промывки.

Добавляли 200 мкл приготовленного окрашивающего раствора в каждую лунку, инкубировали в течение 15 минут.

Останавливали цветную реакцию добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку.

Подсчет результатов проводили на многофункциональном фотометре Victor (Wallas, Финляндия) при 492 нм.

В компъютерное обеспечение прибора вводили численные значения концентрации стандартных образцов и при обсчете получали численные значения искомых концентраций испытуемых образцов в нг/мл. Полученные значения концентраций умножали на фактор разведения 4.

Длительность анализа 4,5 часа. Чувствительность метода 0,488 нг/мл.

У данного ребенка уровень ЭТ-1 в сыворотке крови составил 10 пкг/мл, bFGF - 0,25 нг/мл. Соотношение ЭТ-1 к bFGF составляет 40. Дальнейшее клиническое наблюдение в динамике, при повторном плановом поступлении через 10 месяцев, выявило 2 балла по шкале НДС, отрицательную динамику по данным ЭМГ исследования преимущественно со стороны длинного разгибателя пальцев стопы обеих ног, в виде появления умеренно выраженной полифазии. Таким образом, приведенный пример свидетельствует о выявлении субклинической стадии ДНП и необходимости проведения превентивной терапии.

Следует отметить, что установленный коэффициент предполагает, что исследуемые показатели должны быть в одинаковых единицах по системе СИ, то есть либо в нг/мл, либо в пкг/мл. Так как численные значения искомых концентраций испытуемых образцов ЭТ-1 получали в пкг/мл, а bFGF - в нг/мл, то коэффициент «ЭТ-1/bFGF» должен был бы выглядеть как 40*10^-3 и выше. Однако, учитывая, что в нашем случае приборы выдают численные значения именно в этих единицах измерения, для упрощения понимания и удобства практического использования мы предлагаем применять данный коэффициент как значение 40 и выше.

Пример 2. Ребенок Ангелина О., 1992 г.р., история болезни №1868, наблюдается в детском эндокринном отделении РНИИАП с диагнозам: Сахарный диабет 1 типа, длительность заболевания 1 год, тяжелое течение.

Жалоб не предъявляет. Гликозилированный гемоглобин - 6,8%. При обследовании неврологического статуса отмечалось незначительное снижение коленных и ахилловых рефлексов с обеих сторон, снижение вибрационной чувствительности до 6 баллов на первом пальце стопы обеих ног, при нормальных параметрах остальных видов чувствительности (тактильной, температурной, болевой). Шкала НДС составила 2 балла, что расценивается как вариант нормы.

Данные ЭМГ исследования: электрофизиологическая характеристика электрической активности исследуемых мышц аксонального типа; частотные характеристики и электрическая активность мышц в пределах физиологических сдвигов.

Уровень ЭТ-1 в сыворотке крови составил 15,5 пкг/мл, bFGF - 0,4 нг/мл. Следовательно, соотношение ЭТ-1 к bFGF составляет 38,8.

В динамике, через 6 месяцев при плановом поступлении, не выявлено отрицательной динамики при клиническом и функциональном обследовании.

Таким образом, из данного примера следует, что соотношение ЭТ-1 к bFGF ниже 40 свидетельствует об отсутствии патологических изменений со стороны нервной системы при данной патологии и не требует назначения превентивной терапии.

Заявляемым методом было обследовано 79 детей, страдающих сахарным диабетом I типа с различной длительностью заболевания, наблюдающихся в детском эндокринном отделении РНИИАП. Коэффициент «ЭТ-1/bFGF» 40 и выше отмечался у 39 детей, что позволило диагностировать субклиническую стадию развития ДНИ. У значительной части этих детей были выявлены умеренные патологические изменения на ЭМГ, преимущественно с вовлечением дистальных отделов нижних конечностей. Шкала НДС составила от 0 до 5 баллов. У 37 детей данный коэффициент был ниже 40 и не было выявлено клинико-функциональных признаков поражения периферической нервной системы. Три ребенка имели коэффициент «ЭТ-1/bFGF» ниже 40, хотя по данным ЭМГ исследования они имели нарушения нервно-рефлекторной проводимости.

Полученные данные свидетельствуют об участии сосудистых факторов, в частности ЭТ-1 и bFGF, в развитии и прогрессировании ДНП, особенно очевидно это проявляется в субклиническую стадию развития данного осложнения.

Таким образом, исследование соотношения ЭТ-1 к bFGF в крови у детей, страдающих сахарным диабетом I типа, показало, что точность заявляемого способа 96,2%.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ ранней диагностики ДНП детей с различной длительностью заболевания по сравнению с существующими имеет следующие преимущества:

1. Способ позволяет осуществить раннюю диагностику ДНП с целью назначения своевременного превентивного лечения.

2. Данный способ объективен и не зависит от возраста и эмоционального статуса ребенка.

3. Предлагаемый способ обладает достаточно высокой точностью, прост в исполнении и найдет широкое применение в эндокринологической практике.

Способ ранней диагностики диабетической нейропатии у детей путем исследования биологической жидкости, отличающийся тем, что в периферической крови больного исследуют уровень эндотелина-1 в пкг/мл и основного фактора роста фибробластов (bFGF) в нг/мл и при соотношении эндотелин-1 к bFGF равном 40 и выше диагностируют субклиническую стадию диабетической нейропатии.