Применение процианидинов какао в сочетании с ацетилсалициловой кислотой как противотромбоцитного терапевтического средства

Применение процианидинов какао в сочетании с ацетилсалициловой кислотой как противотромбоцитного терапевтического средства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Данная заявка касается применения комбинации процианидинов какао и аспирина в качестве противотромбоцитного терапевтического средства.

Соединение, состоящее из одного ароматического кольца, которое содержит, по меньшей мере, одну гидроксильную группу, классифицируют как простой фенол. Следовательно, полифенол включает более одного ароматического кольца, причем каждое кольцо содержит, по меньшей мере, одну гидроксильную группу. Флавоноиды представляют полифенолы, которые имеют структуру дифенилпропана (С6-С3-С6) и обнаружены повсеместно в царстве растений. Класс флавоноидов, называемых проантоцианидинами, представляет олигомеры мономерных единиц флаван-3-ола, наиболее часто связанных 4-6 или 4-8. Одним из наиболее общих классов проантоцианидинов являются процианидины, которые представляют олигомеры катехина и эпикатехина и их эфиры галловой кислоты.

Известно, что регулярное потребление пищевых полифенолов, обычно обнаруживаемых в разнообразных фруктах и овощах, способствует снижению смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (CVD), включая инсульт, болезнь сердца и тромбоз сосудов. Красное вино, зеленый чай и какао идентифицированы как продукты, богатые полифенолами, а для красного вина и зеленого чая показано, что в промышленно развитых странах их употребление обратно пропорционально связано со смертностью от болезней сердца.

Показано, что кроме снижения риска атерогенеза пищевые полифенолы обладают другими разнообразными потенциально выгодными биологическими активностями. Например, показано, что они ингибируют вирусную обратную транскриптазу, ингибируют репликацию ВИЧ I in vitro, подавляют образование язв и являются антимутагенными, нейрозащитными, противовоспалительными, антибактериальными, гипотензивными агентами и цитотоксичны относительно разных типов раковых клеток.

Механизмы, по которым пищевые полифенолы проявляют свои биологические функции, понятны неполностью, но известно, что они обладают сильными антиоксидантными свойствами и оказывают ингибирующее действие на активность тромбоцитов.

Аспирин (ацетилсалициловая кислота) является прототипом нестероидного противовоспалительного агента. Его применяют в течение многих лет в противотромбоцитной терапии для снижения риска повторяющихся временных ишемических приступов или цереброваскулярных нарушений. Механизм действия аспирина хорошо известен (Vane J., Nature, 1971). Вкратце, он ингибирует метаболический путь арахидоновой кислоты, вызывая изменение простагландин G\H синтазы 1 тромбоцитов, что является причиной необратимой потери их циклооксигеназной активности. Это приводит к снижению превращения арахидоновой кислоты в простагландины, которые являются сильнодействующими медиаторами разнообразных групп физиологических процессов. Именно пониженное образование данных простагландинов, в особенности тромбоксана А2 и простагландина Е2, которое отвечает за разнообразные фармакологические эффекты аспирина, образует основу их терапевтического применения. К сожалению, те же факторы являются причиной хорошо изученной токсичности аспирина.

У тромбоцитов отсутствуют возможности для синтеза новых белков, что означает, что нарушение, обусловленное аспирином, нельзя устранить в течение периода жизни тромбоцита. Это означает, что ингибирующее действие повторяющихся дневных доз аспирина является кумулятивным и в конечном счете приводит к почти полному подавлению биосинтеза тромбоксана тромбоцитов через 7-10 дней. Биохимические, фармакологические и клинические данные подтверждают теорию, что подавление тромбоксана ведет к предотвращению тромбоксан-зависимой активации тромбоцитов, которая отвечает за антитромбоцитные эффекты аспирина.

Однако различные другие простагландины, продуцируемые по метаболическому пути арахидоновой кислоты, ответственны за некоторые важные гомеостатические механизмы, такие как секреция желудочной кислоты, первичный гемостаз, регуляция кровяного давления и почечная функция. Следовательно, длительное лечение аспирином дает вредные эффекты. Они включают серьезные желудочно-кишечные осложнения, включая кровотечение и перфорацию, осложнения, связанные с кровотечением, такие как случаи кровоизлияния, и повышение риска хронического почечного заболевания.

На протяжении многих лет повышенное понимание положительных и отрицательных аспектов длительного лечения аспирином привело к тенденции уменьшения рекомендуемой дневной дозы, иногда в сочетании со слабыми антикоагулянтами для перорального приема (у пациентов с высоким риском).

Ясно, что открытие противотромбоцитного агента, который не вызывает серьезных побочных эффектов аспирина и который можно применять для замещения аспирина при длительных схемах профилактики/лечения или в сочетании с очень малыми дозами аспирина, было бы громадным шагом вперед в лечении и профилактике любого заболевания или нарушения, вызванного дисфункцией тромбоцитов. Такое открытие было бы встречено с огромным энтузиазмом медиками и людьми с риском таких нарушений или желающих предупредить возможность появления таких заболеваний.

Краткое содержание изобретения

Показано, что процианидины, присутствующие в какао, оказывают противотромбоцитное действие in vitro и in vivo. Показано также, что механизм противотромбоцитного действия осуществляется не через ингибирование метаболического пути арахидоновой кислоты. Кроме того, должно быть ясно, что лечение низкими дозами аспирина в сочетании с процианидинами какао обеспечивает усиленный противотромбоцитный эффект, превышающий противотромбоцитные эффекты данных двух отдельных режимов лечения. Следовательно, данное изобретение обеспечивает альтернативный длительный способ противотромбоцитной терапии без неприятных и опасных побочных эффектов, свойственных аспирину.

Описание фигур

На фигуре 1А-В представлены сравнительные значения содержания тромбоксана и соотношения LT/PGI2 для четырех режимов лечения: аспирин, (+)-какао, аспирин в сочетании с (+)-какао и аспирин в сочетании с (-)-какао, регистрируемые через два временных интервала.

На фигуре 2A-D представлена сравнительная нестимулированная экспрессия рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов для четырех режимов лечения: аспирин, (+)-какао, аспирин в сочетании с (+)-какао и аспирин в сочетании с (-)-какао, регистрируемая через два временных интервала.

На фигуре 3A-D представлена сравнительная ADP-стимулированная экспрессия рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов для четырех режимов лечения: аспирин, (+)-какао, аспирин в сочетании с (+)-какао и аспирин в сочетании с (-)-какао, регистрируемая через два временных интервала.

На фигуре 4A-D представлена сравнительная эпинефрин-стимулируемая экспрессия рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов для четырех режимов лечения: аспирин, (+)-какао, аспирин в сочетании с (+)-какао и аспирин в сочетании с (-)-какао, регистрируемая через два временных интервала.

Подробное описание

Данное изобретение касается применения процианидинов какао в сочетании с аспирином в качестве противотромбоцитного терапевтического средства и композиций, содержащих процианидины какао и аспирин (ацетилсалициловую кислоту).

Использованное здесь выражение «процианидины какао» представляет мономеры и/или олигомеры эпикатехина и катехина. Термин «процианидины» также используют в данной области с более ограниченным значением, т.е. для обозначения олигомеров (но не мономеров) эпикатехина и катехина. Однако для краткости данный термин использован здесь для обозначения и мономеров, и олигомеров.

Данное изобретение касается композиции, включающей аспирин и процианидины какао. Композиция может быть приготовлена в любой подходящей форме, но обычно готовят в виде фармацевтической композиции, пищевого продукта, диетической добавки или пищевой добавки.

В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает композицию, подходящую для приема внутрь, включающую аспирин и процианидины какао в физиологически приемлемом носителе. Данную композицию можно приготовить в любой подходящей форме, но обычно готовят в виде фармацевтической композиции, пищевого продукта, диетической добавки или пищевой добавки.

Настоящее изобретение обеспечивает также:

- применение аспирина и процианидинов какао в производстве медикамента, пищевого продукта, диетической добавки или пищевой добавки для лечения или профилактики заболевания или нарушения, вызванного дисфункцией тромбоцитов (такой как патологическая активация тромбоцитов, в противоположность нормальной активации тромбоцитов, что ведет к образованию сгустков и предотвращению кровотечения);

- применение аспирина в производстве медикамента, пищевого продукта, диетической добавки или пищевой добавки для использования с процианидином какао при профилактике или лечении заболевания или нарушения, вызванного дисфункцией тромбоцитов; и

- применение процианидина какао в производстве медикамента, пищевого продукта, диетической добавки или пищевой добавки для использования с аспирином при профилактике или лечении заболевания или нарушения, вызванного дисфункцией тромбоцитов.

Полифенолы какао включают процианидины, которые являются мономерами и/или олигомерами эпикатехина и катехина.

Мономеры процианидинов имеют структуру

Процианидины включают вещества, обнаруженные в бобах какао, полученных от какао Theobroma и различных родственных видов какао, а также рода Herrania и их меж- и внутригенетических гибридов.

Мономеры процианидинов включают (+)-катехин, (-)-эпикатехин и их соответствующие эпимеры, (например, (-)-катехин, (+)-эпикатехин).

Синтетические линейные и/или разветвленные олигомеры, имеющие следующие структуры, являются иллюстрациями процианидинов какао.

Линейные олигомеры, где n равно целому числу от 0 до 16

Разветвленные олигомеры, где А и В представляют собой независимые олигомеры от 1 до 15 при общем количестве звеньев в конечном олигомере 3-18.

В данных олигомерах n равно целому числу от 2 до 18, предпочтительно от 3 до 12, более предпочтительно от 5 до 12 и наиболее предпочтительно 5. Олигомеры имеют связи между флаванами (4-6) и/или (4-8). Олигомеры могут быть представлены структурами, приведенными выше. Для линейного олигомера, если х равно 0, то олигомер называется «димером»; если х равно 1, то олигомер называется «тримером»; если х равно 2, то олигомер называется «тетрамером»; если х равно 3, то олигомер называется «пентамером»; и аналогично можно обозначить олигомеры, имеющие х до 18 включительно и выше, так, если х равно 18, то олигомер называется «октадекамером». Для разветвленного олигомера, если А или В равно 1, олигомер называется «тримером» с аналогичными обозначениями, как описано для линейных олигомеров.

Процианидины какао можно получить с помощью ингредиентов какао, в особенности ингредиентов какао, имеющих повышенное содержание процианидинов какао, или их можно получить синтетически. Ингредиентами какао являются вещества, получаемые из бобов какао, которые содержат процианидины какао и включают, например, шоколадный экстракт, масло какао, частично обезжиренные твердые вещества какао и/или полностью обезжиренные твердые вещества какао. Процианидины какао можно использовать в виде ингредиентов какао или их можно экстрагировать из бобов какао, молотых бобов какао или ингредиентов какао, которые упомянуты выше.

Способы определения содержания полифенолов какао описаны в патенте США №5554645 (от 10 сентября 1996), который включен здесь в виде ссылки. Собранные коробочки какао открывают и бобы с мякотью удаляют для сушки вымораживанием. Из высушенной вымораживанием массы вынимают вручную мякоть и проводят с бобами следующие манипуляции. Сначала высушенные вымораживанием бобы какао очищают от кожуры и измельчают до тонкой порошкообразной массы при помощи мельницы TEKMAR. Полученную массу далее обезжиривают в течение ночи экстракцией по Сокслету, используя в качестве растворителя повторно перегнанный гексан. Остаток растворителя удаляют из обезжиренной массы в вакууме при комнатной температуре.

Полифенолы какао, включая мономеры и/или олигомеры процианидина какао, можно также экстрагировать из свежих бобов какао, молотых бобов какао или фракций молотых бобов какао, предпочтительно из неферментированных, не полностью ферментированных бобов какао, которые имеют более высокое содержание полифенолов какао. Их можно также экстрагировать из шоколадного экстракта, частично обезжиренных твердых веществ какао и/или полностью обезжиренных твердых веществ какао, которые предпочтительно имеют более высокое содержание полифенолов. Используют растворитель, который растворяет полифенолы какао, включая процианидины.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения процианидины какао представляют олигомеры, мономеры или их смесь, причем данные олигомеры, мономеры или их смесь получают:

(а) подвергая обезжиренные молотые бобы какао, фракции молотых бобов какао, шоколадный экстракт, частично обезжиренные твердые вещества какао или полностью обезжиренные твердые вещества какао экстракции растворителем, используя растворитель, в котором растворимы процианидины какао; и

(b) выделяя из полученного экстракта какао фракцию, включающую мономер, олигомер процианидина или их смесь.

Подходящие растворители включают воду, метанол, этанол, ацетон, этилацетат или их смеси. Предпочтительные растворители представляют смеси воды и метанола или ацетона. Предпочтительная процедура экстракции представляет две экстракции смесью ацетон/вода/уксусная кислота (70%:29,5%:0,5%), с последующей третьей экстракцией смесью метанол/вода/уксусная кислота (70%:29,5%:0,5%). Растворители предпочтительно слегка подкислять. В некоторых случаях экстракт очищают, например, удаляя кофеин и/или теобромин, и далее очищают способом гель-проникающей хроматографии и/или жидкостной хроматографии высокого давления. Во время жидкостной хроматографии высокого давления экстракт можно фракционировать на мономерную и олигомерную фракции, содержащие, по меньшей мере, 50 мас.% мономеров или специфических олигомеров. Если фракции содержат мономеры и низшие олигомеры (до тетрамера включительно), фракции содержат примерно от 90 до 95 мас.% специфической олигомерной фракции.

В другом варианте полифенолы какао, обычно мономеры и/или олигомеры процианидина какао, присутствуют в ингредиентах какао (например, как описано выше), имеющих повышенные или сохраняемые уровни полифенолов какао. Повышенного содержания полифенолов какао можно достичь, добавляя к ингредиентам какао полифенолы какао, например мономеры, олигомеры процианидина или их смеси. Сохраняемого уровня полифенолов какао можно достичь, регулируя степень ферментации бобов какао, как обсуждается ниже, содержание полифенолов какао, включая содержание процианидинов какао, жаренных молотых бобов какао, шоколадного экстракта и частично обезжиренных или необезжиренных твердых веществ какао выше, если их получают из бобов какао или их смесей, которые неполностью ферментированы.

Сохраняемого уровня полифенолов какао можно также достичь, регулируя условия обработки бобов. Таким образом, способ получения из бобов какао масла какао и/или твердых веществ какао, имеющих сохраняемые уровни полифенолов какао, применяет уникальную комбинацию стадий обработки, которые не требуют отдельного оборудования для обжаривания бобов или измельчения экстракта, допуская выбор обработки бобов какао без тяжелой термической обработки в течение длительных периодов времени и/или экстракции жира. Выгода данного способа заключается в повышенной сохранности полифенолов в противоположность традиционным способам обработки какао, так что соотношение начального количества полифенола, обнаруженное в необработанных бобах к количеству, получаемому после обработки, составляет величину менее или равную 2.

Частично обезжиренные твердые вещества какао, имеющие высокое содержание полифенолов какао, включая высокое содержание процианидинов какао, можно получить при обработке бобов какао непосредственно до твердых веществ какао без стадии обжаривания бобов или молотых бобов. Данный способ сохраняет полифенолы какао, так как он опускает стадию традиционного обжаривания. Данный способ состоит, главным образом, из стадий: (а) нагревания бобов какао до внутренней температуры бобов, достаточной для снижения содержания влаги примерно до 3 мас.% и ослабления кожуры какао; (b) отсеивания молотых бобов какао от кожуры какао; (с) прессование с отжимом молотых бобов какао и (d) выделения масла какао и частично обезжиренных твердых веществ какао, которые содержат полифенолы какао, включая процианидины какао. До стадии нагревания бобы какао необязательно очищают, например, в воздушном сепараторе по плотности с псевдоожиженным слоем. Отсеивание также можно проводить в воздушном сепараторе по плотности с псевдоожиженным слоем. Предпочтительно нагревать бобы какао до внутренней температуры примерно от 100 до 110°С, более предпочтительно до температуры менее примерно 105°С, обычно применяя прибор инфракрасного нагревания в течение примерно 3-4 минут. Если требуется, твердые вещества какао можно подщелочить и/или размолоть до порошка какао.

Внутреннюю температуру бобов (IBT) можно измерить, заполнив бобами изолированный контейнер, такой как колба термоса (примерно 80-100 бобов). Затем изолированный контейнер закупоривают подходящим образом, чтобы сохранить температуру образца внутри него. В заполненный бобами изолированный контейнер вставляют термометр, и температура термометра уравновешивается с температурой бобов в термосе. Значение температуры представляет IBT бобов. IBT можно также считать равновесной температурой массы бобов.

Бобы какао можно разделить на четыре категории на основании их цвета: преобладающе коричневые (полностью ферментированные), пурпурно-коричневые, пурпурные и темно-серые (неферментированные). Предпочтительно, как указано выше, получать твердые вещества какао из неполностью ферментированных бобов какао, которые имеют более высокое содержание полифенолов какао, чем ферментированные бобы. Неполностью ферментированные бобы включают темно-серые бобы какао, пурпурные бобы какао, смесь темно-серых, пурпурных и коричневых бобов какао. Более предпочтительны темно-серые и/или пурпурные бобы какао. Неполностью ферментированные бобы обычно имеют коэффициент ферментации 275 или менее.

«Коэффициент ферментации» определяют, используя систему градации для характеристики ферментации бобов какао. Темно-серые обозначают 1, пурпурные - 2, пурпурно-коричневые - 3 и коричневые - 4. Процент бобов, попадающих в каждую категорию, умножают на массовое число. Таким образом, «коэффициент ферментации» для образца, состоящего из 100% коричневых бобов, составил бы 100×4 или 400, тогда как для образца из 100% пурпурных бобов он составил бы 100×2 или 200. Образец, состоящий из 50% темно-серых бобов и 50% пурпурных бобов, имеет коэффициент ферментации 150 [(50×1)+(50×2)].

В одном варианте можно применять в сочетании с аспирином производные процианидинов какао, например производные процианидинов и галловой кислоты и метилированные процианидины. К производным процианидина применимы также любые ссылки, сделанные здесь в отношении процианидинов какао и их применения. Производные процианидинов и галловой кислоты можно получить, как описано в международной патентной заявке №PCT/US98/21392, опубликованной как WO 99/19319. Метилированные процианидины можно получить, как описано, например, в примере 6.

В одном аспекте данного изобретения метилированный процианидиновый мономер или олигомер имеет формулу (А)_n, где n равно от 1 до 18, и А представляет мономерное звено формулы

где каждый из R¹-R⁵ и R⁸-R¹⁰, которые являются одинаковыми или разными, представляет собой Н или СН₃; и R⁶ и R⁷, которые являются одинаковыми или разными, представляют собой Н, СН₃ или связь с соседним мономерным звеном; при условии, что, по меньшей мере, одна группа от R¹ до R¹⁰, по меньшей мере, в одном мономерном звене является СН₃. Мономеры могут быть связаны, например, по одному или двум кольцевым положениям 4, 6 и 8 связями между флаванами, описанными выше.

В другом аспекте данного изобретения метилированный процианидиновый мономер или олигомер имеет формулу (А')_n, где n равно от 1 до 18 и А' представляет мономерное звено формулы

где каждый из R¹-R⁵ и R⁸-R¹⁰, которые являются одинаковыми или разными, представляет Н или СН₃; при условии, что, по меньшей мере, одна группа от R¹ до R⁵, по меньшей мере, в одном мономерном звене является СН₃. Мономеры могут быть связаны, например, по одному или двум кольцевым положениям 4, 6 и 8 связями между флаванами, описанными выше.

Например, олигомер может быть линейным олигомером следующей структуры, где n равно от 0 до 16

где R¹-R⁵ такие, как определены выше.

Альтернативно, или дополнительно, олигомер может быть разветвленным олигомером следующей структуры, где А и В представляют собой независимые олигомеры от 1 до 15 с общим количеством звеньев в конечном олигомере 3-18

где R¹-R⁵ определены выше.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает олигомер процианидина или смесь олигомеров, где каждый указанный олигомер представляет метилированный тетрамер.

Например, метилированный тетрамер является соединением формулы (А)₄, где А представляет мономерное звено формулы

где каждый из R¹-R⁵ и R⁸-R¹⁰, которые являются одинаковыми или разными, представляет собой Н или СН₃; и R⁶ и R⁷, которые являются одинаковыми или разными, представляют собой Н, СН₃ или связь с соседней мономерной единицей; при условии, что, по меньшей мере, одна группа от R¹ до R¹⁰, по меньшей мере, в одном мономерном звене является СН₃. Мономеры могут быть связаны, например, по одному или двум кольцевым положениям 4, 6 и 8 связями между флаванами, описанными выше.

Альтернативно, метилированный тетрамер может быть соединением формулы (А')₄, где А' представляет мономерное звено формулы

где каждый из R¹-R⁵, которые являются одинаковыми или разными, представляет собой Н или СН₃; при условии, что, по меньшей мере, одна группа от R¹ до R⁵, по меньшей мере, в одном мономерном звене является СН₃. Мономеры могут быть связаны, например, по одному или двум кольцевым положениям 4, 6 и 8 связями между флаванами, описанными выше.

Тетрамер метилированного процианидина какао или смесь тетрамеров данного изобретения можно получить метилированием выделенной фракции экстракта какао, содержащей тетрамеры процианидинов, или полученного синтетически тетрамера. Например, тетрамер может иметь формулу (А)₄, приведенную выше.

В одном варианте обеспечен тетрамер метилированного процианидина какао или смесь тетрамеров данного изобретения, причем данный тетрамер или смесь можно получить:

(a) подвергая обезжиренные молотые бобы какао, фракции молотых бобов какао, шоколадный экстракт, частично обезжиренные твердые вещества какао или полностью обезжиренные твердые вещества какао экстракции растворителем, в котором растворимы процианидины какао;

(b) выделяя фракцию, содержащую тетрамеры процианидинов, из полученного экстракта какао и

(c) метилируя выделенную фракцию.

Метилированный олигомер процианидина какао или смесь олигомеров, где указанный олигомер или смесь можно также получить:

(a) подвергая обезжиренные молотые бобы какао, фракции молотых бобов какао, шоколадный экстракт, частично обезжиренные твердые вещества какао или полностью обезжиренные твердые вещества какао экстракции растворителем, в котором растворимы процианидины какао;

(b) выделяя фракцию, содержащую олигомеры процианидинов, из полученного экстракта какао и

(с) метилируя выделенную фракцию.

Композиция настоящего изобретения находится в виде, подходящем для пероральной доставки, таком как таблетки, капсулы, гранулы, концентраты, порошки, жидкости, растворы или суспензии. Предпочтительно представлять ее в виде фармацевтической композиции, пищевого продукта, диетической или пищевой добавки. Она может также быть в виде ингредиента для корма домашних животных. Композиция может быть приготовлена в виде стандартных дозированных форм.

Активные соединения можно приготовить в виде формы с немедленным или отсроченным высвобождением. Таблетка может включать эффективное количество полифенола какао, мономеров и/или олигомеров процианидинов какао или композицию, содержащую полифенолы или процианидины какао, в сочетании с эффективным количеством аспирина и необязательно носитель или систему высвобождения активного ингредиента. В приготовлении композиции с регулируемым высвобождением особо полезны синтетические полимеры. Капсула может включать желатиновую капсулу, содержащую предварительно определенную дозу полифенола какао и аспирин-содержащую композицию. Продукт для пероральной доставки может также включать диетическую пищевую добавку, такую как дикальцийфосфат, стеарат магния, нитрат кальция, витамины и минералы. Препараты комбинаций процианидинов какао/аспирина и содержащие их композиции можно получить по стандартным методикам, хорошо известным специалистам в фармацевтической, пищевой науке, медицине и ветеринарии.

Получают композицию для доставки объединенной эффективной дозы процианидина (процианидинов) какао и аспирина. Эффективное количество процианидина какао можно вводить в виде однократной дозы или, альтернативно, два-три раза в день. Для человека эффективное дневное количество составляет, по меньшей мере, 50 мг, предпочтительно 100 мг и более предпочтительно 150 мг процианидинов какао. Максимальная доза не ограничена. Например, можно принимать процианидины в количестве примерно от 50 до 1000 мг, примерно от 100 до 800 мг, примерно от 300 до 600 мг, или принимать минимальные указанные дозы без ограничения максимальной дозы, например, по меньшей мере, 50, 100 или 300 мг/мл. Если препарат применяют в ветеринарии, например вводят кошкам, лошадям или собакам, специалист в данной области может определить эффективное количество из указанных выше дозировок, принимая во внимание, например, вес животного. Количество процианидинов можно определить способами, описанными в работе Adamson и др. ("HPLC Method for the Quantification of Procianidins in Cocoa and Chocolate Samples and Correlation to Total Antioxidant Capacity", J. Ag. Food Chem., Vol.7:10, 4184-4188), часть которой, относящаяся к делу, включена здесь в виде ссылки. Благодаря усиленным эффектам, достигаемым при введении аспирина в сочетании с процианидинами какао, его можно принимать с меньшей дозой, чем это необходимо, если применяют только аспирин в противотромбоцитной терапии, для достижения защитных сердечно-сосудистых эффектов, что составляет, например, 80 мг/день для человека. Таким образом, в способах и/или композициях данного изобретения аспирин можно использовать в количестве менее 80 мг/день, например, примерно от 10 до 80 мг/день и предпочтительно примерно от 20 до 80 мг/день. В других вариантах аспирин можно принимать примерно от 40 до 80 мг/день или при введении менее 70 мг/день примерно от 20 до 70 мг/день или примерно от 30 до 70 мг/день.

Кроме объединенной единой композиции для перорального приема процианидин (процианидины) какао и аспирин можно готовить в виде препаратов для раздельного приема. Согласно настоящему изобретению обеспечен также продукт, содержащий аспирин и процианидин какао, для раздельного одновременного или последовательного приема при лечении заболевания или нарушения, вызванного дисфункцией тромбоцитов. При раздельном приеме процианидин какао и аспирин следует вводить в течение периода времени, который гарантирует, что они одновременно присутствуют в организме млекопитающего при достаточных концентрациях для сочетанного эффекта. Специалист в данной области может определить такой период времени, основываясь на знаниях биологической доступности процианидинов какао и аспирина. Например, процианидины какао и аспирин следует вводить млекопитающему в течение 8 часов друг за другом, предпочтительно в течение 6 часов друг за другом и более предпочтительно в течение двух часов друг за другом.

Полифенол какао обычно присутствует в ингредиенте какао с повышенным или сохраняемым уровнем полифенолов какао, обеспеченным, например, как описано выше. Таким образом, в одном аспекте ингредиент какао содержит твердые вещества какао, которые можно получить:

(a) нагреванием бобов какао до внутренней температуры бобов, достаточной для снижения содержания влаги примерно до 3 мас.% и ослабления кожуры какао;

(b) отсеиванием молотых бобов какао от кожуры какао;

(c) прессованием с отжимом молотых бобов какао и

(d) выделением масла какао и частично обезжиренных твердых веществ какао, которые содержат полифенолы какао.

В предпочтительном варианте ингредиент какао с повышенным или сохраняемым уровнем полифенолов какао содержится в смеси для напитков, из которой готовят напитки для совместного приема с эффективным количеством аспирина. Предпочтительный напиток или смесь напитков включает: твердые высшие полифенолы какао и/или экстракт какао и необязательно природный или искусственный подслащающий агент, природный или синтетический ароматизатор и пищевой продукт. Напиток также может быть насыщен углекислым газом. Подслащающий агент может представлять сахарный сироп, твердый сахар или заменитель сахара. Термин «заменитель сахара» включает объемные агенты, сахарный спирт (т.е. полиолы, такие как глицерин), высокоэффективные подслащающие агенты или их комбинации. Пищевыми углеводородными подслащающими агентами с разными степенями интенсивности подслащивания могут быть любые из обычно применяемых в данной области агентов, включая (но не ограничиваясь этим) сахарозу, декстрозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, твердые сиропы глюкозы, твердые кукурузные сиропы, инвертированный сахар, гидролизованную лактозу, мед, кленовый сахар, коричневый сахар, мелассу и подобное. Заменители сахара могут частично или полностью заменять пищевой углеводородный подслащающий агент. Высокоэффективные заменители сахара включают аспартам, цикламаты, сахарин, ацесульфам-К, неохесперидин, дигидрохалькон, сукралозу, алитам, подсластитель на основе посконника крапиволистного, глицирризин, тауматин и подобное, а также их смеси. Примеры сахарных спиртов включают обычно применяемые в данной области спирты, такие как сорбит, маннит, ксилит, мальтит, изомальт, лактит и подобные. Примерами молочных компонентов являются сухое обезжиренное молоко, молочный жир, сладкие сливки, кефир и снятое молоко.

Для целей данной заявки следующие определения позволят яснее понять то, что раскрыто и заявлено.

Используемый здесь термин «пищевой продукт» обозначает материал, состоящий по существу из белка, углевода и/или жира, который используется в организме для процессов поддержания роста, восстановления и жизнедеятельности и снабжения энергией. Пищевые продукты могут также содержать дополнительные вещества, такие как минералы, витамины и приправы. Смотри Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, издание 10-е, 1993.

Используемые здесь термины «фармацевтический препарат» или «медикамент» обозначают лекарственные средства. Смотри Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, издание 10-е, 1993.

Используемые здесь термины «пищевая добавка» или «диетическая добавка» обозначают продукт (отличный от табака), который, как подразумевается, дополняет пищу, который имеет или содержит один или более из следующих пищевых ингредиентов: витамин, минерал, трава или другой растительный продукт, аминокислота, пищевое вещество для применения человеком с целью добавления к пище при повышении общего дневного потребления, или концентрат, метаболит, составная часть, экстракт или комбинация данных ингредиентов. Смотри Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, издание 10-е, 1993.

Используемый на этикетках пищевых продуктов термин «добавка» обычно означает, что к питательным веществам добавлено количество, более чем на 50% превышающее U.S. RDA («Understanding Normal and Clinical Nutirition, Third Edition», редакторы Whitney, Cataldo and Rolfes, стр.525).

Для лечения или профилактики любых нарушений или заболеваний, вызванных дисфункцией тромбоцитов, можно вводить (человеку или животному, такому как домашнее животное) процианидин какао, или смесь мономеров и/или олигомеров процианидинов какао, или композицию, содержащую мономеры и/или олигомеры процианидинов какао, в сочетании с эффективным количеством только аспирина, или аспирина с другими лекарственными средствами, как описано практикующими специалистами-медиками, в соответствии со способами, включенными в данное описание и известными в данной области. Например, лечение, включающее совместное введение аспирина и процианидинов какао, может быть назначено практикующим специалистом-медиком при первых признаках или симптомах дисфункции тромбоцитов или вскоре после этого, как требуется, без необходимости чрезмерного исследования. Таким образом, композиция и способы лечения данного изобретения можно применять, например, на пациентах, страдающих или с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, которые включают инфаркт, инсульт и периферические сосудистые заболевания, периферические артериальные заболевания, заболевание коронарных артерий, заболевание сонной артерии, атеросклероз, рестиноз.

Совместное введение процианидинов какао и аспирина или их композиции, отдельно или совместно с другими лекарственными средствами, можно продолжать по схеме, например, в течение месяца, в течение двух месяцев, в течение двух лет, в течение года, или по другой схеме лечащего специалиста-медика в течение необходимого периода времени без необходимости чрезмерного исследования.

Кроме того, область данного изобретения включает упаковку, содержащую пищевой продукт, диетическую добавку или медикамент и этикетку, указывающую повышенное содержание полифенолов какао, включая процианидины какао, в сочетании с аспирином, или указывающую полезные свойства данных соединений, и необязательно инструкции по применению. Используемое здесь понятие «полезные свойства» включает ингибирование дисфункции тромбоцитов, например, при профилактике или лечении сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений, вызванных воспалением.

Данное изобретение описано, кроме того, в следующих неограничительных примерах.

Пример 1

Аналитические способы количественного определения процианидинов какао

Описанный ниже аналитический способ применяют для разделения и количественного определения по степени полимеризации композиции процианидинов в семенах Theobroma cacao и шоколаде. Описанный ниже аналитический способ основан на работе, представленной Hammerston J.F., Lazarus S.A., Mitchel A.E., Rucker R., Schmitz H.H., Identification of Procyanidins in Cocoa (Theobroma cacao} and Chocolate Using High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry, J. Ag. Food Chem., 1999, 47(10), 490-496). Описанный ниже аналитический способ применяют для количественного исследования широкого диапазона образцов пищевых продуктов и напитков, которые содержат разнообразные типы проантоцианидинов, как сообщается в работе Lazarus S.A., Adamson G.E., Hammerston J.F., Schmitz H.H, High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis of Proanthocyanidins in Foods and Beverages, J. Ag. Food Chem., 1999, 47(9), 3693-3701). В работе Lazarus S.A. и др. (1999) излагается исследование, использующее детектирование флюоресценции вследствие ее высокой селективности и чувствительности.

Для каждого олигомера процианидина до декамера получают стандартные составные основные растворы и калибровочные кривые, применяя описанный ниже аналитический способ, который