Агонисты рецептора кортикотропин-рилизинг фактора 2

Агонисты рецептора кортикотропин-рилизинг фактора 2

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к применению новых пептидов и кодирующих их нуклеиновых кислот для лечения расстройств, модулируемых CRF2R.

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Приоритетными для настоящей заявки являются временная заявка США 60/349117, временная заявка, подданная 16 января 2002, временная заявка США 60/376337, подданная 29 апреля 2002, временная заявка США 60/388895 подданная 14 июня 2002, и временная заявка США 60/411988, подданная 19 сентября 2002, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки в полном объеме.

ПРЕДПОСЫЛКИ

CRFR и лиганды

Существует, по меньшей мере, два идентифицированных до настоящего времени рецептора кортикотропин-рилизинг фактора (CRF₁R и CRF₂R), которые относятся к классу рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Активация агонистами CRF₁R или CRF₂R приводит к Gαs-активации аденилатциклазы. Аденилатциклаза катализирует образование цАМФ, который в свою очередь оказывает множественные действия, включая активацию протеинкиназы А, внутриклеточное высвобождение кальция и активацию активируемой митогенами протеинкиназы (МАР-киназы). Показанное в других исследованиях усиление синтеза внутриклеточного инозитолтрифосфата после активации агонистами рецепторов CRF свидетельствует о том, что CRFR также связаны с Gαq.

Клонированы CRF₁R и CRF₂R человека, крысы, мыши, цыпленка, коровы, сома, лягушки и овцы. Каждый из CRF₁R и CRF₂R имеет уникальный характер распределения. Клонированы три изоформы рецептора CRF₂R, альфа, бета и гамма человека. Гомологи альфа- и бета-CRF₂R идентифицированы у крыс.

Известны несколько лигандов/агонистов CRFR, и они включают кортикотропин-рилизинг фактор (или гормон, CRF, CRH), урокортин I, урокортин II (или пептид, родственный стресскопину), урокортин III (или стресскопин), уротензин I, саувагин и другие родственные пептиды. Кортикотропин-рилизинг фактор связывается и активирует CRF₁R и CRF₂R. CRF является основным модулятором реакций организма на стресс. Указанный 41-аминокислотный пептид осуществляет контроль над множеством нервных, эндокринных и иммунных процессов в качестве первичного регулятора гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой гормональной оси (HPA-оси). Кроме того, имеет место значительная гомология последовательностей между всеми известными лигандами CRFR. Более того, идентифицированы два избирательных лиганда CRF₂R, урокортин II (или родственный стресскопину пептид) и урокортин III (стресскопин). Указанные пептиды идентифицированы у множества видов млекопитающих и рыб.

Рецепторы CRF можно отличить от не-CRFR фармакологически, используя избирательные агонисты и антагонисты рецепторов. Указанные избирательные агонисты и антагонисты, а также нокаутированные по CRFR мыши применялись для определения того, какой рецептор CRF опосредует конкретный биологический ответ.

Роль CRF₁R довольно хорошо установлена. Мыши, у которых ген CRF₁R нарушен (нокаут по CRF₁R), проявляли ослабленную стресс-реакцию и ослабленное поведение, подобное состоянию тревоги. CRF₁R является основным медиатором HPA-оси. В частности, CRF, который высвобождается из гипоталамуса и транспортируется в передний гипофиз через гипоталамо-гипофизарную воротную систему, взаимодействует с CRF₁R, присутствующим на клетках, расположенных в переднем гипофизе. Активация CRF₁R агонистами приводит к высвобождению АКТГ из клеток переднего гипофиза в круг кровообращения. Высвобождаемый АКТГ связывает рецептор АКТГ, присутствующий на клетках, расположенных в коре надпочечников, приводя к высвобождению адренальных гормонов, включая кортикостероиды. Кортикостероиды опосредуют множество эффектов, включая, но не ограничиваясь указанным, супрессию иммунной системы посредством механизма, в который вовлечена атрофия тимуса и селезенки. Таким образом активация CRF₁R опосредованно приводит к понижающей регуляции иммунной системы через активацию HPA-оси.

Роль CRF₂R установлена хуже. Мыши, у которых был нарушен ген CRF₂R (нокаут по CRF₂R), проявляют ослабленное или сниженное потребление пищи после стимуляции урокортином, отсутствие вазодилатации, но нормальную стресс-реакцию. Эксперименты с CRF₂R показали, что CRF₂R ответственен за гипотензивное/сосудорасширяющее действие агонистов CRFR и за снижение потребления пищи, наблюдаемое после обработки мышей агонистами CRFR.

Атрофия и гипертрофия скелетных мышц

Кроме того, CRF₂R вовлечен в модулирование атрофии скелетных мышц и индукцию гипертрофии. Скелетная мышца является пластичной тканью, которая легко адаптируется к изменениям либо в физиологических потребностях для работы, либо в метаболических потребностях. Гипертрофия относится к увеличению массы скелетной мышцы, тогда как атрофия скелетной мышцы относится к уменьшению массы скелетной мышцы. Острая атрофия скелетной мышцы может быть вызвана несколькими причинами, включая, но не ограничиваясь указанным: прекращение использования вследствие хирургического вмешательства, постельного режима или перелома костей; денервацию/повреждение нервов вследствие повреждения спинного мозга, аутоиммунного заболевания или инфекционной болезни; использование глюкокортикоидов в случае несвязанных состояний; сепсис в результате инфекции или по другим причинам; ограничение питательных веществ из-за болезни или голодания; и космические полеты. Атрофия скелетных мышц происходит в ходе нормальных биологических процессов, однако в некоторых медицинских случаях указанный нормальный биологический процесс приводит к уровню мышечной атрофии, ослабляющему здоровье. Например, острая атрофия скелетных мышц дает существенное ограничение при реабилитации пациентов от иммобилизации, включая, но не ограничиваясь указанным, иммобилизацию, сопровождающую ортопедическую процедуру. В таких случаях период реабилитации, требуемый для того, чтобы устранить атрофию скелетной мышцы, часто намного длиннее, чем период времени, необходимый для восстановления исходного повреждения. Такая острая атрофия в случае прекращения использования является особой проблемой для пожилого человека, который уже может страдать от значительного связанного с возрастом дефицита мышечной функции и массы, так как такая атрофия может приводить к стойкой нетрудоспособности и преждевременной смертности.

Атрофия скелетных мышц также может быть результатом хронических состояний, таких как кахексия при злокачественной опухоли, хроническое воспаление, кахексия, связанная со СПИДом, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), застойная сердечная недостаточность, генетические заболевания, например мышечная дистрофия, нейродегенеративные заболевания и саркопения (связанная с возрастом потеря мышечной массы). В случае указанных хронических состояний атрофия скелетных мышц может приводить к преждевременной потере подвижности, добавляемой к заболеваемости, связанной с болезнью.

Мало известно о молекулярных процессах, которые контролируют атрофию или гипертрофию скелетной мышцы. Несмотря на то, что запускающий механизм инициации атрофии скелетной мышцы различен в случае разных событий, инициирующих атрофию, в пораженном волокне скелетной мышцы происходит несколько общих биохимических изменений, включая уменьшение синтеза белка и увеличение деградации белка и изменения изоформ как сократительных белков, так и белков метаболических ферментов, характерных для переключения с медленных волокон (высокий окислительный метаболизм/медленные изоформы сократительных белков) на быстрые волокна (высокий гликолитический метаболизм/быстрые изоформы сократительных белков). Дополнительные изменения в скелетной мышце, которые имеют место, включают потерю сосудов и ремоделирование внеклеточного матрикса. И в быстрой, и в медленной мышце в соответствующих условиях наблюдается атрофия, при этом относительная потеря мышечной массы зависит от конкретных стимулов атрофии или условий. Важно, что все указанные изменения регулируются согласованно и включаются и выключаются в зависимости от изменений в физиологических и метаболических потребностях.

Процессы, благодаря которым возникает атрофия или гипертрофия, консервативны среди видов млекопитающих. Многие исследования показали, что при атрофии и у грызунов, и у человека происходят одни и те же основные молекулярные, клеточные и физиологические процессы. Таким образом, модели атрофии скелетных мышц на грызунах успешно использовали для понимания и предсказания атрофических реакций у человека. Например, атрофия, индуцированная множеством способов у грызунов и человека, приводит к сходным изменениям в анатомии мышц, площади поперечного сечения, функции, переключении типов волокон, экспрессии сократительных белков и гистологии. Кроме того, показано, что несколько агентов регулируют атрофию скелетных мышц как у грызунов, так и у человека. К указанным агентам относятся анаболические стероиды, гормон роста, инсулиноподобный фактор роста I, бета-адренергические агонисты и агонисты CRF₂R. Указанные данные, вместе взятые, свидетельствуют о том, что атрофия скелетных мышц является результатом общих механизмов как у грызунов, так и у человека.

Хотя показано, что некоторые агенты регулируют атрофию скелетных мышц и одобрены для применения на человеке в случае такого показания, указанные агенты обладают нежелательными побочными эффектами, такими как гипертрофия сердечной мышцы, неоплазия, гирсутизм и андрогенизация у женщин, повышенная заболеваемость и смертность, повреждение печени, гипогликемия, скелетно-мышечная боль, повышенный тканевой тургор, тахикардия и отек. В настоящее время не существует высоко эффективных и избирательных способов лечения ни острой, ни хронической атрофии скелетных мышц. Таким образом, остается необходимость в идентификации других терапевтических средств, которые лечат атрофию скелетных мышц.

Мышечная дистрофия

Мышечная дистрофия охватывает группу наследственных, прогрессирующих мышечных заболеваний, клинически отличающихся избирательным распределением слабости скелетной мышцы. Двумя наиболее распространенными формами мышечной дистрофии являются дистрофия Дюшенна и дистрофия Бекера, каждая из которых возникает в результате наследования мутации в гене дистрофина, который локализован в локусе Xp21. Другие дистрофии включают, но не ограничены указанным, мышечную дистрофию Лейдена, которая возникает в результате мутации множественных генетических локусов, включая локусы калпаина p94, адхалина, γ-саркогликана и β-саркогликана; лице-лопаточно-плечевую мышечную дистрофию (Ландузи-Дежерина), миотоническую дистрофию и мышечную дистрофию Эмери-Дрейфусса. Симптомы мышечной дистрофии Дюшенна, которая возникает почти исключительно у мужчин, включают утиную походку, хождение на цыпочках, лордоз, частые падениях и трудности при вставании и поднимании по лестнице. Симптомы начинаются примерно в 3-7-летнем возрасте, при этом большинство пациентов к 10-12 годам прикованы к инвалидной коляске и многие умирают примерно в 20-летнем возрасте вследствие респираторных осложнений. Современное лечение мышечной дистрофии Дюшенна заключается во введении преднизона (кортикостероидного лекарственного средства), которое хотя и не излечивает, но замедляет снижение мышечной силы и отсрочивает наступление нетрудоспособности. Полагают, что кортикостероиды, такие как преднизон, действуют путем блокирования активации иммунных клеток и инфильтрации, которые ускоряются при повреждении мышечных волокон, возникающем в результате заболевания. К сожалению, лечение кортикостероидами также приводит к атрофии скелетных мышц, что сводит на нет некоторую вероятную пользу блокирования иммунного ответа у данных пациентов. Таким образом, продолжает существовать необходимость в идентификации терапевтических средств, которые замедляют повреждение мышечных волокон и отсрочивают наступление нетрудоспособности у пациентов с мышечными дистрофиями, но в меньшей степени вызывают атрофию скелетных мышц, чем современные способы лечения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предлагаются изолированные пептиды, которые являются агонистами CRF₂R. В частности, в изобретении предлагается изолированный пептид или кодирующая его нуклеиновая кислота, которые являются производными CRF, урокортина I, урокортина II, урокортина III, саувагина, уротензина I или родственных пептидов. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей безопасное и эффективное количество изолированного пептида согласно данному изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Изобретение, кроме того, относится к набору, содержащему изолированный пептид в дозированной лекарственной форме и инструкции по применению.

Введение пептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, фармацевтической композиции или набора согласно данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту эффективно для лечения модулируемых CRF₂R расстройств, таких как атрофия или истощение мышц. Изобретение также относится к антителу, которое специфично по отношению к пептидам согласно данному изобретению. Наконец изобретение относится к применению пептида согласно данному изобретению или кодирующей его нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения модулируемого CRF₂R расстройства у нуждающегося в этом субъекта.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к аминокислотной последовательности:

IVLSLDVPIGLLQILLEQX₁₉KX₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅QATTNARILARV (SEQ ID NO: 531)

где:

(a) X₁₉ выбран из группы, включающей D и Е;

(b) X₂₁ выбран из группы, включающей А и Q;

(c) Х₂₂ выбран из группы, включающей R, Е и К;

(d) Х₂₃ выбран из группы, включающей А, К и N;

(e) Х₂₄ выбран из группы, включающей А, Е и L;

(f) X₂₅ выбран из группы, включающей R и К; и

(g) Х₂₆ выбран из группы, включающей Е и Q.

Данное изобретение охватывает изолированные не нативные пептиды согласно формуле (I):

где:

(а) альфа содержит последовательность формулы Х₁Х₂Х₃Х₄Х₅Х₆, где:

каждый из X₁, Х₂ и Х₃ выбран из группы, состоящей из нуля. А, Е, D, G, N, Р, Q, S, Т и Z;

Х₄ выбран из группы, состоящей из F, I, L, Р, Т и V;

Х₅ выбран из группы, состоящей из А, I, Р, S, Т и V;

Х₆ выбран из группы, состоящей из I, L, M и N;

(b) бета содержит последовательность формулы SX₈DX₁₀; где: каждый из X₈ и Х₁₀ независимо выбран из группы, состоящей из I, L и V;

(c) гамма содержит последовательность формулы X₁₁X₁₂X₁₃; где: Х₁₁ выбран из группы, состоящей из Р, Т, V и S, и каждый из X₁₂ и X₁₃ независимо выбран из группы, состоящей из А, нафтилаланина (изображенного в виде В), С, D, Е, F, G, Н, I, К, L, M, N, Р, Q, R, S, T, V, W и Y;

(d) дельта содержит последовательность формулы X₁₄X₁₅X₁₆, где:

X₁₄ выбран из группы, состоящей из I, L и M;

X₁₅ выбран из группы, состоящей из L и M; и

X₁₆ выбран из группы, состоящей из S, N, Q и R;

(e) эпсилон содержит последовательность формулы X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁, где:

X₁₇ выбран из группы, состоящей из V, I, L, T, K, E, N и Q;

X₁₈ выбран из группы, состоящей из L, M, V, A и T;

X₁₉ выбран из группы, состоящей из I, F, L и M;

X₂₀ выбран из группы, состоящей из D, E, N и H; и

X₂₁ выбран из группы, состоящей из L, V, I, Q, M и R;

(f) дзета содержит последовательность формулы X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅, где:

X₂₂ выбран из группы, состоящей из нуля, A, D, E, S и T;

X₂₃ выбран из группы, состоящей из нуля, K и R;

X₂₄ выбран из группы, состоящей из нуля, A, H, M, N, Q, T и Y;

X₂₅ выбран из группы, состоящей из нуля, E, D, I, K, N, Q и R;

(g) эта содержит последовательность формулы X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁, где:

X₂₆ выбран из группы, состоящей из A, D, G, H, K, N, Q и S;

X₂₇ выбран из группы, состоящей из A, E, I, L, M и Q;

X₂₈ выбран из группы, состоящей из A, H, K, Q, R и V;

X₂₉ выбран из группы, состоящей из A, E, K, N, M и Q;

X₃₀ выбран из группы, состоящей из H, K, N, Q и R;

X₃₁ выбран из группы, состоящей из A и K;

(h) тета содержит последовательность формулы X₃₂X₃₃NX₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁, где:

X₃₂ выбран из группы, состоящей из A, E, H и T;

X₃₃ выбран из группы, состоящей из A, D, E, I, L, N, Q, R, S и T;

X₃₅ выбран из группы, состоящей из A и R;

X₃₆ выбран из группы, состоящей из E, H, I, K, L, N, Q и R;

X₃₇ выбран из группы, состоящей из F,I, L, M и Y;

X₃₈ выбран из группы, состоящей из L, F и M;

X₃₉ выбран из группы, состоящей из A, D, E, N и Q;

X₄₀ выбран из группы, состоящей из A, D, E, H, I, K, N, Q, R, S и T;

X₄₁ выбран из группы, состоящей из A, F, I и V; и их варианты.

Все процитированные документы в соответствующей части включены в данное описание в виде ссылки; цитирование любого документа не следует рассматривать как признание того, что он представляет предшествующий уровень техники по отношению к данному изобретению.

ОПИСАНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В таблице 1 описаны различные последовательности белков и белковых фрагментов, которые связываются с рецепторами CRF. Указанные выбранные последовательности включены с соответствующим номером(ами) доступа в Genbank или Derwent и названием вида животного, для которого они опубликованы, а также номерами доступа для родственных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют идентичные или почти идентичные аминокислотные последовательности. Указанные известные и новые последовательности согласно изобретению, кроме того, представлены в списке последовательностей.

Таблица 1
Описаниепоследовательности	Аминокислотная SEQ ID NO:	Вид	Номер доступа для нуклеотидной последовательности в Genbank (GB), Swiss-Prot (SP) или Derwent (D)	Связанные номера доступа в Genbank (GB) или Derwent (D);
фрагмент урокортина I	2	Homo sapiens	Фрагмент AF038633 (GB) аминокислотные остатки 83-122	AC109828 (GB)AX015619 (GB)AV708591 (GB)AV708591 (GB)AAZ35707 (D)AAT73432 (D)
фрагмент урокортина II	4	Homo sapiens	Фрагмент AF320560 (GB) аминокислотные остатки 72-109
фрагмент урокортина III	6	Homo sapiens	Фрагмент AF361943 (GB) аминокислотные остатки 118-157	AY026949 (GB)
фрагмент кортикотропин-рилизинг гормона	8	Homo sapiens	Фрагмент V00571 (GB) аминокислотные остатки 154-194	AC090195 (GB)AC090196 (GB)BC002599 (GB)AC021240 (GB)E00245 (GB)
фрагмент кортикотропин-рилизинг фактора	10	Ovis. sp.	E00212 (GB)	J00803 (GB)M22853 (GB)
саувагин	11	Phyllomedusa sauvagei	P01144 (SP)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Глоссарий терминов

Ниже следует список определений терминов, используемых в данном описании.

«Агонист» означает любое соединение, включая, но не ограничиваясь указанным, антитело, которое активирует рецептор. Например, агонисты CRFR включают, но не ограничены указанным, CRF, урокортин, урокортин II, урокортин III, уротензин I, саувагин и родственные аналоги.

«Антитело» в его различных грамматических формах означает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфично связывает антиген. В используемом в данном описании смысле «изолированное антитело» означает антитело, которое было частично или полностью отделено от белков и встречающихся в природе органических молекул, с которыми оно связано в природе.

«Аффинность связывания» означает склонность лиганда взаимодействовать с рецептором и обратно пропорционально связана с константой диссоциации специфичного взаимодействия CRF-лиганд--CRFR. Константу диссоциации можно непосредственно измерить, используя стандартные способы насыщения, конкурентного связывания или определения кинетики связывания, или опосредованно, используя фармакологические способы, которые включают функциональные анализы и конечные результаты.

«Химерное антитело» означает антитело, которое содержит структурные элементы из двух или более различных молекул антител, т.е. от разных видов животных. Химерные антитела включают, но не ограничены указанным, антитела, известные как «гуманизированные антитела», которые включают, но не ограничены указанным, химерные антитела, образованные способом, известным под названием прививка областей, определяющих комплементарность.

«CRF» означает кортикотропин-рилизинг фактор, что значит то же самое, что и кортикотропин-рилизинг гормон (CRH). Примеры пептидов CRF включают r/h-CRF и овечий CRF (см. патент США No. 4415558) и т.п.

«Аналог CRF» означает вещества, которые действуют в качестве лигандов CRFR. Подходящие аналоги CRF можно получить из различных видов позвоночных, и они включают, но не ограничены указанным, такие вещества, как саувагин (см., например, патент США No. 4605642), уротензин (см., например, патенты США No. 4908352 и 4533654), урокортин II мыши, родственный урокортину пептид человека (Reyes, T. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 2843-2848 (2001)), урокортин (см., например, WO 97/00063), урокортин II человека (родственный стресскопину пептид), урокортин III человека (стресскопин), URP 1 рыбы-собаки, URP II рыбы-собаки, уротензин I и аналоги CRF, описанные в патентах США No: 4415558; 4489163; 4594329; 4605642; 5109111; 5235036; 5278146; 5439885; 5493006; 5663292; 5824771; 5844074 и 5869450. Конкретные аналоги CRF включают hUcnI (урокортин I человека, AF038633 (GB)); hUroII (урокортин II человека или родственный стресскопину пептид) (AF320560); hUroIII (урокортин III человека или стресскопин, AF361943); hCRF (кортикотропин-рилизинг фактор человека) (V00571 (GB)); oCRF (кортикотропин-рилизинг фактор овцы E00212 (GB)); Svg (саувагин, P01144 (SP)).

«Агонист CRFR» означает соединение или молекулу, которая обладает способностью активировать CRF₁R, CRF₂R или оба рецептора.

«CRFR» означает CRF₁R или CRF₂R. Термин «CRFR» также включает укороченные и/или мутантные белки, в которых области молекулы рецептора, не требуемые для связывания лиганда или передачи сигнала, были делетированы или модифицированы.

«CRF₁R» означает любые изоформы CRF₁R из любого вида животного. CRF₁R ранее называли CRF-RA, PC-CRF, CRF, (Perrin, M. H., et al. Endocrinology 133: 3058-3061 (1993), Chen, R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8967-8971 (1993), Chang, C-P. et al., Neuron 11: 1187-1195 (1993), Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1108-1112 (1995) и Vita, N., et al., FEBS Lett. 335: 1-5 (1993) ) или рецептором CRH.

Определение CRF₁R включает, но не ограничено указанным, те рецепторы, для которых кДНК или геномная последовательность, кодирующая рецептор, была депонирована в базе данных последовательностей. Указанные последовательности включают последовательности с номерами доступа: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM_004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM_007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 и L41563. Нуклеотидные и белковые последовательности указанных рецепторов доступны из GenBank или Derwent.

«CRF₂R» означает любую изоформу CRF₂R из любого вида животного. CRF₂R также названы HM-CRF, CRF-RB, (Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1108-1112 (1995) и Perrin, M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2969-2973 (1995)).

Определение рецептора CRF₂R включает, но не ограничено указанным, те рецепторы, для которых последовательность ДНК, кодирующая рецептор, была депонирована в базе данных последовательностей. Указанные последовательности включают последовательности с номерами доступа: U34587, E12752, NM_001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM_009953, Y14037 и AF229360. Нуклеотидные и белковые последовательности указанных рецепторов доступны из GenBank или Derwent.

«Ингибировать» означает частичное или полное блокирование конкретного процесса или активности. Например, соединение ингибирует атрофию скелетной мышцы, если оно либо полностью, либо частично предотвращает атрофию мышц.

«Изолированный пептид» означает, что о молекуле пептида говорят, что она «изолирована», когда используют физические, механические или химические способы для извлечения пептида из клеточных компонентов, которые обычно связаны с белком. Специалист в данной области легко может использовать стандартные способы очистки, чтобы получить изолированный пептид.

«Изолированная нуклеиновая кислота» означает, что молекула нуклеиновой кислоты по существу отделена от загрязняющих молекул нуклеиновых кислот, кодирующих другие полипептиды. Способы очистки и идентификации последовательностей хорошо известны в данной области.

В используемом в данном описании смысле говорят, что две последовательности ДНК «функционально связаны», если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не является результатом введения мутации со сдвигом рамки считывания, (2) не препятствует способности области промотора управлять транскрипцией кодирующих последовательностей или (3) не препятствует способности соответствующего РНК-транскрипта транслироваться в белок. Например, кодирующая последовательность и регуляторные последовательности функционально связаны в том случае, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы поместить транскрипцию кодирующей последовательности под влияние или контроль регуляторных последовательностей. Таким образом, область промотора функционально связана с кодирующей последовательностью в том случае, когда область промотора способна к осуществлению транскрипции данной последовательности ДНК так, чтобы полученный в результате транскрипт обладал способностью транслироваться в требуемый пептид.

«Избирательный агонист» означает, что агонист, как правило, обладает большей, предпочтительно значительно большей активностью по отношению к определенному рецептору(рам) по сравнению с другими рецепторами, а не то, что он полностью неактивен по отношению к другим рецепторам.

«Идентичность последовательностей» или «гомологию» на уровне аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с помощью анализа BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), используя алгоритм, применяемый в программах blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 и Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264- 2268), которые специально созданы для поиска сходства последовательностей. Подход, используемый в программе BLAST, состоит в том, что сначала рассматривают сходные участки с пробелами (прерывистые) и без пробелов (непрерывные), между запрашиваемой последовательностью и последовательностью в базе данных, затем оценивают статистическую значимость всех совпадений, которые идентифицированы, и, наконец, суммируют только те совпадения, которые удовлетворяют предварительно выбранному порогу значимости. Для обсуждения основных проблем при поиске сходства в базе данных последовательностей см. Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6, 119-129. Параметры поиска для гистограммы, описаний, выравниваний, ожидания (т.е. порога статистической значимости для указываемых совпадений с последовательностями в базе данных), отсечения, матрицы и фильтра (низкой сложности) представляют собой параметры, устанавливаемые по умолчанию. Используемая по умолчанию матрица подсчета очков, применяемая в blastp, blastx, tblastn и tblastx, представляет собой матрицу BLOSUM62 (Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), рекомендованную для запрашиваемых последовательностей свыше 85 нуклеотидов или аминокислот в длину.

В случае blastn матрицу для подсчета очков устанавливают на основе соотношения M (т.е. количества очков награды для пары совпадающих остатков) и N (т.е. количества штрафных очков за несовпадающие остатки), где значения по умолчанию M и N составляют +5 и -4, соответственно. Четыре параметра blastn корректировали следующим образом: Q=10 (штраф за образование пробела); R=10 (штраф за расширение пробела); wink=1 (генерирует попадания слов в каждом просматриваемом в данный момент положении вдоль запроса) и gapw=16 (устанавливает ширину окна, в котором создаются выравнивания с пробелами). Эквивалентные установки параметров Blastp представляли собой Q=9; R=2; wink=1 и gapw=32. Сравнение Bestfit между последовательностями, доступное в пакете GCG, версия 10.0, использует параметры для ДНК GAP=50 (штраф за создание пробела) и LEN=3 (штраф за расширение пробела), и эквивалентными установками для сравнений белков являются GAP=8 и LEN=2.

«Гипертрофия скелетной мышцы» означает увеличение массы скелетной мышцы, или функции скелетной мышцы, или и того, и другого.

«Атрофия скелетной мышцы» означает то же самое, что и «истощение мышцы», и означает уменьшение массы скелетной мышцы, или функции скелетной мышцы, или и того, и другого.

При описании структуры и функции белков даны указания аминокислот, составляющие белок. Аминокислоты также могут быть указаны с помощью их обычных сокращений, как показано: A = Ala = аланин; T = Thr = треонин; V = Val = валин; C = Cys = цистеин; L = Leu = лейцин; Y = Tyr = тирозин; I = Ile = изолейцин; N = Asn = аспарагин; P = Pro = пролин; Q = Gln = глутамин; F = Phe = фенилаланин; D = Asp = аспарагиновая кислота; W = Trp = триптофан; E = Glu = глутаминовая кислота; M = Met = метионин; K = Lys = лизин; G = Gly = глицин; R = Arg = аргинин; S = Ser = серин; H = His = гистидин. Букву Z = Glx = пирролидонкарбоновая кислота используют для обозначения N-концевой глутаминовой кислоты или глутамина, который образовал внутренний циклический лактам. Это описано в списке последовательностей в виде признака «модифицированный остаток» там, где это уместно. Букву B используют в описании для обозначения нафтилаланина, модификации аланина в некоторых пептидах, и это указано в списке последовательностей в виде «прочий признак» в списке последовательностей в пептидных последовательностях, где это имеет место. Сокращение «Ac» использовано для обозначения модифицированного ацетилированного NH₂-конца в описании и описано в виде признака «модифицированный остаток» там, где это уместно. Пептиды согласно изобретению также модифицируют для того, чтобы они имели амидную группу на карбоксильном конце. Это указано в списке последовательностей в виде признака «модифицированный остаток». Чтобы обозначить делецию или отсутствие аминокислоты в контексте природного гомолога, на протяжении заявки используют «-» или «ноль».

Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, как значение, обычно подразумеваемое специалистом в области химии белков, фармакологии или молекулярной биологии. Способы, вещества и примеры, описанные в данной заявке, не предназначены в качестве ограничивающих. Другие способы и вещества, сходные или эквивалентные способам и веществам, описанным в данной заявке, можно использовать в практике или при проверке данного изобретения.

Пептиды

Данное изобретение охватывает изолированные не нативные пептиды согласно формуле (I):

альфа-бета-гамма-дельта-эпсилон-дзета-эта-тета

(I)

В формуле (I) альфа содержит последовательность формулы X₁X₂X₃X₄X₅X₆, где: каждый из X₁, X₂ и X₃ выбран из группы, состоящей из нуля, A, E, D, G, N, P, Q, S, T и Z; X₄ выбран из группы, состоящей из F, I, L, P, T и V; X₅ выбран из группы, состоящей из A, I, P, S, T и V; и X₆ выбран из группы, состоящей из I, L, M и N. В одном аспекте изобретения альфа содержит последовательность формулы X₁X₂X₃X₄X₅X₆, где X₁ означает ноль, X₂ выбран из группы, состоящей из D, E и Z; X₃ выбран из группы, состоящей из D, G и N; X₄ выбран из группы, состоящей из L и P; X₅ выбран из группы, состоящей из P и S; и X₆ выбран из группы, состоящей из I, L, M и N. В одном варианте альфа, кроме того, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из -EDLPL (SEQ ID NO: 388), -DNPSL (SEQ ID NO: 389), -DDPPL (SEQ ID NO: 390), -ZGPPI (SEQ ID NO: 391), ---PSL и ---IVL, где «-» означает ноль. В другом варианте альфа содержит последовательность -ZGPPI. В другом варианте альфа содержит последовательность -DNPSL. В другом варианте альфа содержит последовательность ---IVL. В другом варианте альфа содержит последовательность ---PSL.

В другом аспекте изобретения альфа содержит последовательность формулы X₁X₂X₃X₄X₅X₆, где X₁ является нулем; X₂ является нулем; X₃ является нулем; X₄ выбран из группы, состоящей из F, I, L, P и V; X₅ выбран из группы, состоящей из A, I, S, T и V; X₆ является L. В одном варианте альфа содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ---IVL, ---FTL, ---LTL, ---FAL, ---VIL и ---PSL. В другом варианте альфа содержит последовательность ---IVL.

В еще одном аспекте изобретения альфа содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SQEPPI (SEQ ID NO: 392), SEEPPI (SEQ ID NO: 393), -DNPSL, ---IVL, -TKFTL (SEQ ID NO: 394), -ZGPPI, SQEIVL (SEQ ID NO: 395), SEEIVL (SEQ ID NO: 396), DNPIVL (SEQ ID NO: 397), TKIVL (SEQ ID NO: 398), ZGIVL (SEQ ID NO: 399), SDNPSL (SEQ ID NO: 401), STKFTL (SEQ ID NO: 402), SZGPPI (SEQ ID NO: 403), и NDDPPI (SEQ ID NO: 404).

В еще одном аспекте изобретения альфе может предшествовать полигистидин (HHHHHH, SEQ ID NO: 400) или другая пептидная метка, которую можно применять при очистке или детекции пептидов согласно изобретению.

В формуле (I) бета содержит последовательность формулы SX₈DX₁₀, где каждый X₈ и X₁₀ выбран из группы, состоящей из I, L и V. В одном варианте бета содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SIDL (SEQ ID NO: 405), SLDV (SEQ ID NO: 406), SLDL (SEQ ID NO: 407), SIDI (SEQ ID NO: 408) и SIDV (SEQ ID NO: 409). В другом варианте бета содержит последовательность, кроме того, выбранную из группы, состоящей из SIDL и SLDV. В еще одном варианте бета содержит последовательность SIDL. В еще одном варианте бета содержит последовательность SLDV. В еще одном варианте бета содержит последовательность SIDV.

В формуле (I) гамма содержит последовательность формулы X₁₁X₁₂X₁₃; где X₁₁ означает P T, V или S и каждый X₁₂ и X₁₃ выбран из группы, состоящей из A, B (нафтилаланина), C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W и Y. В одном варианте изобретения X₁₁ является P. В другом варианте гамма содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из PAB, PAF, PAH, PAQ, PAY, PFB, PFE, PFF, PFG, PFH, PFI, PFL, PFQ, PFV, PFW, PFY, PGY, PHB, PHF, PHH, PHQ, PHW, PHY, PIA, PIB, PID, PIE, PIF, PIG, PIH, PII, PIL, PIQ, PIR, PIT, PIV, PIW, PIY, PKY, PLB, PLE, PLF, PLG, PLH, PLI, PLL, PLQ, PLV, PLW, PLY, PNY, PQB, PQF, PQH, PQI, PQL, PQQ, PQV, PQW, PQY, PRY, PSY, PTB, РТЕ, PTF, PTH, PTI, PTL, PTV, PTW, PTY, PVB, PVY, PWF, PWH, PWQ, PWW, PWY, PYB, PYF, PYH, PYI, PYL, PYQ, PYT, PYV, PYW, PYY, SLE, SLG, SIG, и VIG. В еще одном варианте изобретения гамма содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из PFE, PFG, PFH, PFQ, PFY, PLE, PLG, PLH, PLQ, PLY, PTE, PTH, PTY, PIE, PIH, PIQ, PIY, PIG, PTN и PTS. В еще одном варианте гамма содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из PFE, PFG, PFH, PFQ, PFY, PLE, PLG, PLH, PLQ, PLY, PTE, PTH, PTY, PIE, PIH, PIQ, PIY, PYY, PFE, PTW, PQY, PHY, PII, PIL, PTI, PTF, PTL, PIV, PIT, PTV и PIE. В еще одном варианте гамма содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из PIG, PTN, PTS и PIG. В еще одном варианте гамма содержит последовательность, выбранную из PFQ, PYW, PLQ, PIG, PLY, PUY, PTY, PIG, PLL, PLF и PFF. В еще одном варианте гамма содержит последовательность PIG. В еще одном варианте гамма содержит PFQ.

В формуле (I) дельта содержит последовательность формулы X₁₄X₁₅X₁₆, где X₁₄ выбран из группы, состоящей из I, L и M; X₁₅ выбран из группы, состоящей из L и M; и X₁₆ выбран из группы, состоящей из S, N, Q и R. В одном варианте дельта содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ILS, IMN, LLQ, LLR и MLR. В одном варианте дельта содержит последовательность LLQ или LLR.

В формуле (I) эпсилон содержит последовательность формулы X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁, где X₁₇ выбран из группы, состоящей из V, I, L, T, K, E, N и Q; X₁₈ выбран из группы, состоящей из L, M, V, A и T; X₁₉ выбран из группы, состоящей из I, F, L и M; X₂₀ выбран из группы, состоящей из D, E, N и H; и X₂₁ выбран из группы, состоящей из L, V, I, Q, M и R. В одном варианте эпсилон содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из VLIDL (SEQ ID NO: 410), VLFDV (SEQ ID NO: 411), VLIEI (SEQ ID NO: 412), ILFNI (SEQ ID NO: 413), LLIEI (SEQ ID NO: 414), LLFNI (SEQ ID NO: 415), ILLEQ (SEQ ID NO: 416), ILIEI (SEQ ID NO: 417), ILLEI (SEQ ID NO: 418), TLLEL (SEQ ID NO: 419), KMIEI (SEQ ID NO: 420), KVIEI (SEQ ID NO: 421), EVLEM (SEQ ID NO: 422), EMIEI (SEQ ID NO: 423), EVIEI (SEQ ID NO: 424), EAIEI (SEQ ID NO: 425), ETIEI (SEQ ID NO: 426), EIIEI (SEQ ID NO: 427), ELIEI (SEQ ГО NO: 428), NMIEM (SEQ ID NO: 429), NMIHR (SEQ ID NO: 430), NMIHM (SEQ ID NO: 431), QMMEM (SEQ ID NO: 432), и LLFNI (SEQ ID NO: 433). В одном варианте изобретения эпсилон содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из VLIDL, VLFDV, ILFNI, LLFNI, ILLEQ, TLLEL и KMIEI. В другом варианте эпсилон содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из VLIDL, VLFDV, ILFNI и ILLEQ. В еще одном варианте эпсилон содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из KMIEI или ILLEQ. В еще одном варианте эпсилон содержит последовательность KVIEI, KMIEI, ILLEI, ILLEQ или TLLEL. В еще одном варианте эпсилон