Способ получения иммуногенного антигена trichinella spiralis

Способ получения иммуногенного антигена trichinella spiralis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммуннодиагностике и иммунопрофилактике опасного антропозооноза (трихинеллеза). Может быть использовано для прижизненной серодиагностики данного заболевания у человека и животных и в качестве основного компонента для изготовления вакцинного препарата.

Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 случаев заболевания этим опасным гельминтозом людей, причем в 40% они носят групповой характер. Стационарно неблагополучными по трихинеллезу в настоящее время остаются регионы Северного Кавказа, Восточной Сибири, Дальнего Востока, Кировской Области. Учитывая широкий круг восприимчивых животных и многообразие их трофических связей, передача возбудителя осуществляется на нескольких уровнях с вовлечением в циркуляцию как насекомых-трупоедов, так и мелких млекопитающих, плотоядных, всеядных животных и крупных хищников. Существует потенциальная эпизоотическая связь между природным и синантропным биоценозами, что при повышенном интересе к охоте с собаками соответствующих пород может привести к распространению трихинеллеза, поскольку в процессе охоты собаки постоянно контактируют с дикими животными. Поэтому необходимо регулярно обследовать домашних плотоядных животных после пребывания в природных очагах трихинеллеза. Одним из наиболее достоверных способов прижизненного выявления этого тканевого гельминтоза является серодиагностика, основывающаяся на определении наличия специфических антител в крови при их взаимодействии с антигенами трихинелл в ИФР.

Проблема профилактики и иммунодиагностики этого социально опасного тканевого гельминтозооноза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способы получения, исследование антигенов трихинелл имеют большую научную и практическую ценность. Этими вопросами занимаются зарубежные исследователи. Н.R.Gamble (3, 4) получал экскреторно-секреторные продукты личинок трихинелл методом культивирования в питательной среде ДМЕМ с добавлением глутамина и антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, гентамицина). Tyrcekova L. с соавторами (9) для аналогичных целей использовали среду RPMI-1640. Все авторы проводили работу в строго стерильных условиях с использованием СО₂-инкубатора с 5-10%-ным содержанием углекислоты, при температуре 37°С, сроки культивирования личинок варьировали от 18 до 48 ч. В экскреторно-секреторных продуктах исследователями выявлено 5 белков молекулярным весом от 43 - до 63 кДа.

Наиболее информативным методом иммунохимического исследования антигенов в настоящее время признан Western Blot анализ. Tyrcekova L. с соавторами (9) провели иммуноблотинг антигенов трихинелл с гипериммунными кроличьими сыворотками и установили наличие 6-ти иммуногенных белков молекулярным весом от 43 - до 70 кДа. Эти данные сопоставимы с результатами Ко и Fan, 1996 (6).

Western Blot анализ антигенов трихинелл проводил Ariaga et al (2), он идентифицировал пять главных белков с молекулярным весом 43-63 кДа, его данные совпадают с Tyrcekova L. (9), и по мнению автора, содержат основные антигенные эпитопы связывания антител и продуцируются гельминтом в течение всей инвазии.

Специфический антиген является главной составной частью иммунопрепарата, способствующего развитию гуморально-клеточных механизмов направленного действия, блокирующих жизненно важные функции паразита и обеспечивающих развитие иммунитета к последующему заражению.

Ценность изобретения заключается в оптимизации наработки препаративных количеств основных, так называемых "мажорных" антигенов трихинелл, предлагаются современные методы мониторинга за качеством произведенного продукта.

Цель изобретения состоит в получении биотехнологическим путем основного компонента - иммуногенных антигенов Т.spiralis для прижизненной серодиагностики и вакциннопрофилактики этого опасного антропозооноза.

Сущность изобретения состоит в разработке способа получения иммуногенных протеинов трихинелл, являющихся основным компонентом иммуноферментного диагностикума и вакцины.

Наиболее близким прототипом изобретения являются работы Gamble et all, 1984, 1985 (3, 4), Клименко В.В. 1987 г. (1).

Недостатками прототипов можно считать сложный, длительный и более дорогой процесс фракционирования и очистки антигенов, иное сочетание используемых антибиотиков, непродолжительный срок культивирования личинок в искусственных питательных средах, даже при наличии дорогостоящего оборудования (СО₂-инкубатор, стерильный бокс). У предшествующих авторов нет указаний на то, что целесообразно использовать прошедшие культивирование инвазионные личинки, значительно увеличившиеся в размерах за счет потребления питательных веществ из среды ДМЕМ, для получения полного соматического экстракта и фракционированного антигена. Также считаем не рациональным проводить процесс протеолиза в ИЖЗ при указанной предыдущими авторами температуре, более физиологичной для данного паразита является предложенная нами.

Наша работа отличается тем, что:

1. Предлагается более оптимальный режим переваривания мышечной ткани инвазированных трихинеллами животных в искусственном желудочном соке.

2. Использовано более рациональное применение антибиотиков для уничтожения сопутствующей микрофлоры.

3. Упрощен и удешевлен процесс биологического культивирования инвазионных личинок, т.к. не требует обязательного наличия CO₂ инкубатора, стерильного бокса.

4. За счет увеличения концентрации глутамина в среде ДМЕМ увеличен срок продуцирования живыми личинками экскреторно-секреторных протеинов до 5 суток.

5. Методами иммуноблота и ИФР доказана возможность использования белков-антигенов из биомассы личинок, оставшихся после культивирования в среде ДМЕМ, для получения соматических экстрактов, фракционирования, гипериммунизации животных с целью получения сывороток высокого титра.

6. Разработаны оптимальные недорогие биохимические методы (и впервые применены) фракционирования протеинов трихинелл с использованием сорбента Sephadex-G100.

7. Предлагается комплекс экономичных методов очистки, концентрирования, иммуннохимического анализа антигенного материала.

8. Проведенными опытами показана высокая иммунногенность получаемых антигенов, их высокая чувствительность и специфичность в ИФР.

Способ включает следующие этапы:

1. Получение инвазионного материала личинок трихинелл.

2. Биологическое культивирование личинок, получение экскреторно-секреторных продуктов.

3. Получение полного соматического экстракта, фракционированного антигена.

4. Анализ диагностических свойств соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов личинок Т.spiralis.

5. Иммунохимический анализ полученных белков-антигенов.

6. Изучение протективных свойств экскреторно-секреторных продуктов трихинелл.

Предварительную подготовку лабораторной посуды, инструментов и их стерилизацию проводили по общепринятым методикам из руководств "Биотехнология клеток животных" под ред. Спиер Р.Е. (1989). Непосредственно для культивирования личинок трихинелл применялись стерильные одноразовые чашки Петри (пр-ва "Ленполимер"), а для проведения ИФР - иммунологические планшеты отечественного производства или фирмы Costar (США). Биологическое культивирование проводили в искусственной питательной среде ДМЕМ с обязательным добавлением глутамина.

1. Получение инвазионных личинок трихинелл

Белых беспородных крыс заражают перорально личинками Т.spiralis в дозе 10 л/г живого веса. Через 1,5-2 месяца животных убивают методом цервикальной дислокации, снимают шкуру, удаляют внутренние органы и тушки переваривают в искусственном желудочном соке, изменив температурный режим по сравнению с общепринятой методикой. Переваривание мышечных тканей для высвобождения личинок трихинелл более целесообразно проводить не при 37°С, а при 38,5°-39,0°С, поскольку это нормальная температура тела плотоядных животных, основных хозяев данного гельминта. Полученных личинок трихинелл многократно отмывают стерильным физиологическим раствором с добавлением антибиотиков, состав которых определяют таким образом, чтобы на сопутствующие микроорганизмы и плесневые грибы воздействовало сразу несколько угнетающих агентов: β-лактамные антибиотики оказывают бактерицидное действие на микроорганизмы, находящиеся в фазе роста, ингибируя биосинтез их клеточной стенки; тетрациклинового ряда - подавляют биосинтез белка на уровне рибосом; на плесневые грибы, аспергиллы, грибы рода Candida угнетающе действует дисперсия леворина. В связи с этим в отмывающий физиологический раствор добавляют 5 мкг/мл ампициллина, 6 мкг/мл гентамицина, 50 ЕД/мл леворина, 2 мкг/мл доксициклина и промывают им 5-7 раз инвазионные личинки трихинелл.

2. Биологическое культивирование инвазионных личинок

Для получения экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл дальнейшую работу проводят в условиях бокса. Личинки трихинелл культивируют в чашках Петри в питательной среде ДМЕМ с добавлением L-глутамина (40 мкл/мл) и антибиотиков (гентамицина 2 мкл/мл и ампициллина 5 мкл/мл). Плотность посева 5 тыс.л/мл.

Белковые продукты личинок трихинелл получают, значительно упростив метод Gamble H.R. (1): без применения СО₂-инкубатора, фиксированного уровня (10%) содержания углекислоты и (70%) влажности; в обычном термостате при 38,5°С. Белковые продукты отбирают один раз в 24 часа в течение 3-5 суток, после каждого отбора экскреторно-секреторных продуктов первоначальный объем восполняют добавлением новой порции питательной среды с L-глутамином. Жизнеспособность личинок трихинелл ежедневно оценивают под микроскопом, при обнаружении более 30% мертвых культивирование прекращают, а биомассу трихинелл используют для получения соматического экстракта и фракционированного антигена.

Полученные экскреторно-секреторные продукты по разным срокам культивирования подвергают диализу в течение 48 ч против дистиллированной воды с добавлением физиологического раствора (NaCl 1:10) при температуре 4°С со сменой буфера каждые 6-8 часов. После диализа антиген концентрируют против ПЭГ-6000, концентрацию белка определяют на спектрофотометре при длине волны 280 нм, после чего пропускают через бактериальную мембрану с диаметром пор 0,22-0,24 мкм. Сохраняют экскреторно-секреторный антиген при -18°С или в кельвинаторе при -70°С.

3. Получение фракционированного антигена трихинелл

Для получения фракционированного соматического антигена трихинелл, оставшихся после биотехнологического культивирования, многократно отмывают физиологическим раствором, и затем личинки измельчают механическим способом с периодическим замораживанием и оттаиванием. Полученный гомогенат экстрагируют в течение 18 ч при 4°С с добавлением физиологического раствора на магнитной мешалке. После центрифугирования при 12000 g в течение 20 мин, супернатант отбирают и полученный соматический экстракт диализуют против забуференного физиологического раствора (1:10) в течение 48 ч при температуре 4°С. После диализа протеины концентрируют против ПЭГ-6000, концентрацию белка определяют при длине волны 280 нм.

Полный соматический экстракт в объеме 5 мл фракционируют на колонке с сефадексом G-100, диаметром 2,5 см, длиной 80 см, отбирают 2 белковую фракцию. Концентрацию белка определяют по методу Бредфорд (см. чертеж).

4. Анализ чувствительности и специфичности полученных антигенов ИФМ

Активность и специфичность экскреторно-секреторных протеинов и антигенов второй белковой фракции Т.spiralis определяют в реакции ELISA по общепринятой методике (5).

Гипериммунные поливалентные трихинеллезные сыворотки получают с помощью иммунизации кроликов по ранее разработанной методике полным соматическим антигеном в суммарной дозе 4,5 мг. Максимальный титр антител устанавливают в предварительной реакции ELISA, полученные антигены используют в концентрации 1 мкг на лунку.

Примеры конкретного исполнения:

Пример №1

В этом эксперименте проводили исследование диагностической эффективности в ИФР соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов T.spiralis с сыворотками крови лабораторных животных. В опыте использовались сыворотки крови от кроликов; экспериментально зараженных трихинеллезом в дозе 10 лич/г живого веса; вакцинированных антигенами тканевых гельминтов, а также спонтанно зараженных паразитарными болезнями. Результаты, представленные в таблице №1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность как фракционированного соматического, так и экскреторно-секреторного антигенов с сыворотками крови лабораторных животных составили 100%.

Пример №2.

В этом опыте определяли диагностическую эффективность ИФР с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигенами Т.spiralis с сыворотками крови спонтанно зараженных свиней их неблагополучных по трихинеллезу хозяйств и экспериментально зараженных трихинеллезом свиней (банк сывороток ВИГИС). Результаты представлены в таблице №2. По результатам ИФР установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови свиней при использовании фракционированного антигена составила 96,4%, а экскреторно-секреторного - 93,5%; специфичность обоих антигенов составила 84%.

Пример №3.

В этом эксперименте проводился сравнительный анализ диагностической эффективности антигенов 2 белковой фракции трихинелл в ELISA и Western blot. Сыворотки людей и свиней с подтвержденным диагнозом на трихинеллез в обеих реакциях были положительными, а из 42 сывороток из неблагополучного по трихинеллезу хозяйства в реакции ELISA было зафиксировано 10 положительных результатов; Western blot анализ выявил 2 положительные сыворотки из 10-и, прореагировавших в ELISA. На основании полученных данных можно заключить, что Western blot анализ можно использовать не только для уточнения диагноза, но и для непосредственной диагностики данного заболевания. Данные представлены в таблице №3.

5. Иммунохимический анализ антигенов трихинелл.

Проведенный градиентный электрофорез (концентрация полиакриламида от 6 до 18%) с последующей компьютерной обработкой данных показал, что во всех белковых продуктах трихинелл присутствуют пептиды с молекулярной массой 30, 43, 52-57, 64-69 кДа, причем мажорными протеинами как во фракционированном соматическом, так и в секреторно-экскреторном на всех сроках инкубации, являются антигены с молекулярной массой 43 и 53-57 кДа. Данные сопоставимы с результатами исследований зарубежных авторов (10).

Белковые продукты разделяют с помощью денатурирующего электрофореза в 12%-ном разделяющем и 4%-ном концентрирующем ПААГе, используя Bio-RAD mini protean Slab Cell. На лунку наносят по 20 мкл образца и разделение осуществляют при 240 V в течение 50 мин. Белки переносят из геля на фильтр электрофоретически, используя нитроцеллюлозные фильтры (Schleicher-Schuell, Германия) с диаметром пор 0,24 мкм. Перенос осуществляют в самодельной камере для полусухого переноса в течение 2 часов в условиях комнатной температуры при силе тока 80 мА. При этом контакт "сэндвича" из геля и нитроцеллюлозы с пластинчатыми графитовыми электродами обеспечивается за счет прокладок из фильтровальной бумаги, смоченных в буферах.

По окончании переноса часть геля отрезают и окрашивают для определения количественного переноса белков, фильтр используют для иммунного окрашивания с помощью поливалентных сывороток. Перед этим нитроцеллюлозную мембрану инкубируют 1 ч при 37°С 2%-ным обезжиренным сухим молоком (фирмы Sigma США), в 0,05%-ном Твине-20. После отмывки фосфатно-солевым буфером (PBS), мембрану инкубируют с гипериммунной сывороткой в разведении 1:100 в течение 1 ч, по окончании инкубации фильтр отмывают PBS от избытка антител и затем инкубируют с вторичными антителами (антикроличьими IgG в разведении 1:12000) и снова отмывают от избытка вторичных антител PBS. Отмытый фильтр погружают на 30 мин в 0,05%-ный раствор 4-хлор-1-нафтола в PBS, содержащий 0,06% перекиси водорода. После развития окраски, реакцию останавливают, промывая фильтр водой. Фильтр высушивают и для предотвращения выцветания хранят в темноте. По результатам Western blot анализа у экскреторно-секреторного и фракционированного соматического антигенов присутствуют мажорные полосы с молекулярной массой в диапазоне 43-, 50-55 кДа. Полученные результаты сопоставимы с данными зарубежных авторов (5).

6. Протективные свойства иммунопрепарата на основе экскреторно-секреторных антигенов трихинелл.

Пример №4.

Исследования проводили на 44 белых беспородных мышах весом 18-20 г, разделенных на 3 группы:

первая группа была иммунизирована подкожно двукратно с интервалом 14 дней препаратом, состоящим из экскреторно-секреторного антигена (30 мкг белка в 0,125 мл по объему) и равного количества полного адъюванта Фрейнда (0,125 мл);

вторая группа мышей была иммунизирована подкожно одним адъювантом Фрейнда в той же дозе двукратно с интервалом в 14 дней;

третьей группе был введен двукратно подкожно стерильный физраствор по той же схеме.

По истечении 14 дней после последней иммунизации было проведено заражение всех трех групп мышей инвазионными личинками трихинелл в дозе 100 личинок на одно животное. Учет результатов опыта через 60 дней после заражения представлен в таблице №4. У первой группы животных, иммунизированных Э/С АГ + ПАФ, количество личинок в 1 г мышечной ткани после переваривания в ИЖС составило в среднем по группе 75,2 личинки; у животных 2-й группы (ПАФ + физ. р-р) этот же показатель составил 1622 л/г. В контрольной группе (физ. р-р) интенсивность инвазии составила 2109,3 л/г. Приведенные расчеты, как видно из таблицы, показывают, что уровень защиты при экспериментальном заражении T.spiralis мышей, вакцинированных данным препаратом, составил 96,4% (((2109,3-75,2):2109,3)×100%=96,4%), что значительно превосходит протективный эффект, полученный зарубежными авторами (8).

7. Изучение протективных свойств препарата на основе экскреторно-секреторных антигенов трихинелл на кроликах. 8.

Пример №5.

Исследования проводили на 16 молодых кроликах породы "Советская Шиншилла", разделенных на две равноценные группы - опытную и контрольную. Опытная группа животных была двукратно (с интервалом в 10 дней) подкожно иммунизирована препаратом, состоящим из равных объемов (по 0,25 мл) полного адъюванта Фрейнда и экскреторно-секреторного антигена (доза по белку 250 мкг).

Контрольная группа кроликов была инъецирована в те же сроки стерильным физраствором. По истечении 14 дней после последней иммунизации обе группы заразили инвазионными личинками трихинелл в дозе 4 тысячи на одно животное.

Убой экспериментальных животных провели через 60 дней после заражения трихинеллами. С тушек кроликов отделили всю мышечную ткань и измельчили на электромясорубке (каждую по отдельности), тщательно перемешали и провели протеолиз трех аликвот (по 50 г) фарша от каждой тушки в искусственном желудочном соке. Результаты опыта представлены в таблице №5. Показатель среднего количества личинок в 1 г мышечной ткани по всей группе вакцинированных Э/С АГ трихинелл кроликов составил 38,8; в то время, как в контрольной группе этот показатель составил 1390,6 л/г. Приведенные расчеты показывают, что уровень защиты при экспериментальном заражении T.spiralis кроликов, двукратно вакцинированных данным препаратом, составил 97,2% (((1390,6-38,8):1390,6)×100%=97,2%).

Проведенные опыты показали высокую иммуногенность препарата на основе экскреторно-секреторного антигена трихинелл с ПАФ при двукратном подкожном введении лабораторным животным, эффект защиты составил 96-97%.

Проведенный иммунохимический анализ полностью характеризует основные иммуногенные антигены трихинелл на молекулярном уровне, а ИФМ показывает их высокую специфичность и чувствительность в серологических реакциях с сыворотками крови, как нескольких видов животных, так и зараженных трихинеллезом людей.

Источники информации.

1. Клименко В.В., Белозеров С.Н. Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1986. - вып.44 - С.31-38.

2. Arriaga С., Muniz E., Morilla A., Ortega-Pierres G. Trichinella spiralis: Recognition of muscle larva antigens during experimental infection of swains and its potential use in diagnosis. Exp. Parasit. 1989. 69:363-372.

3. Gamble H.R. Trichinella spiralis: Immunization of Mice Using Monoclonal Antibody Affinity-Isolated Antigens. Exp. Parasitology 59, 398-404, 1985.

4. Gamble H.R., Graham С.E. Monoclonal antibody-purified antigen for the immunodiagnosis of swine trichinosis. Vet. Res., 45, 67-74, 1984.

5. Helene Y., Shakir A. Development and Evaluation of a Western Blot Kit for Diagnosis of Human Trichinellosis (PubMed), 2003.

6. Ко, О.С., Fan L. Heat shock respons to Trichinella spiralis and T.pseudospiralis. Parasitology 1996, 112:89-95.

7. Parkhouse R.M., Philip M., Ogilvie В.М. Characterization of surface antigens of Trichinella spiralis infective larvae. Parasite Immunol., 1981, 3:339-352.

9. Silberstein D.S., Despommier D.D. Antigens from Trichinella spiralis that induce a protective response in the mouse. J. of Immunology, 132, 898-904, 1984.

9. Tyrcekova L., Borovkova О. Immunochemical analysis of larval antigens of Trichinella spiralis and T.pseudospiralis. Helmintologia, 34, 4:241-243, 1997.

10. Wu Z., Nagano I. A panel of antigens of muscle larvae of Trichinilla spiralis and T.pseudospiralis as revealed by two-dimensional western blot and immunoelectron microscopy. Parasitology, 118 (Pt 6): 118, 1999.

Таблица №1.Исследование диагностической эффективности в ИФР соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов Т.spiralis с сыворотками крови лабораторных животных.
Сыворотки крови кроликов	Кол-во животных в группе	Результаты ИФР
фракционированный соматический антиген	экскреторно-секреторный антиген
положит.	отриц.	чувствит.	специф.	положит.	отриц.	чувствит.	специф.
Экспериментально зараженные трихинеллезом	8	8	-	100%	100%	8	-	100%	100%
Гипериммунизиров. экстрактом личинок Т.spiralis	5	5	-	5	-
Иммунизирован. экскрет/секрет. АГ Т.spiralis + ПАФ	9	9	-	9	-
Гипериммунизиров. экстрактом Е.multilocularis (из протосколексов)	2	-	2	-	2
Иммунизирован. Аг Е.multilocularis + ПАФ с послед. заражением Е.multilocularis	12	-	12	-	12
спонтанно зараженные пассалурисами	2	-	2	-	2
Экспериментально зараженные культурой криптоспоридий	12	-	12	-	12
Спонтанно зараженные цистицеркозом пизиформным	3	-	3	-	3
Здоровые кролики	5	-	5	-	5

Таблица №3.Сравнительный анализ диагностической эффективности антигенов 2-й белковой фракции трихинелл в реакциях ELISA и Western blot
Сыворотки крови	количество	Результаты ELISA	Результаты Western blot
положительные	отрицательные	Проверены в Western blot	положительные	отрицательные
Сыворотки людей с подтвержд. диагнозом	3	3	-	3	3	0
Сыворотки свиней с подтвержденным трихинеллезом	16	16	-	16	16	-
Сыворотки свиней из неблагополучного по трихинеллезу хозяйства	42	10	32	10	2	8

Таблица №4.Изучение протективных свойств экскреторно-секреторных антигенов трихинелл в опыте на белых беспородных мышах
№ группы	Кол-во мышей в группе	Иммунизирующее средство	Иммунизация доза мкг белка	Кратность иммунизации	Интервал между иммунизациями (дни)	Доза заражения (кол-во личинок)	Среднее кол-во личинок в 1 г мышечной ткани после перев в ИЖС	Усредненный показатель в целом по группе(личинки)
1	2	3
1	30	Э/С АГ Т.spiralis + ПАФ (1:1)	30	2	14	100	89,5	64,7	71,3	75,2
2	12	ПАФ + физ. р-р	-	2	14	100	1576	1820	1470	1622
3	20	Стерильн. физ. р-р	-	2	14	100	2038	2301	1989	2109,3

Таблица №5.Изучение протективных свойств экскреторно-секреторных антигенов трихинелл в опыте на молодых кроликах породы "Советская Шиншилла".
№ группы	Иммунирующее средство	Иммунизирующая доза по белку	Кратн. иммунизации	Интервал между иммунизациями	Доза заражения (кол-во личинок)	Среднее количество личинок в 1 грамме мышечной ткани	Усредненный показатель по группе
1	2	3	4	5	6	7
1	Э/С АГ + ПАФ (1:1)	175	2	14	4000	25,4	111	67,8	7,9	0,6	26,3	46,8	38,8
2	Стерильн. физ. р-р	-	2	14	4000	1433,7	1021,3	1717,0	1390

Способ получения иммуногенного антигена Trichinella spiralis, включающий заражение лабораторных животных, отделение мышечной ткани и проведение ее протеолиза в искусственном желудочном соке, выделение инвазионных личинок и их культивирование в искусственной питательной среде, отделение белкового продукта, его очистку и иммунохимический скрининг, отличающийся тем, что протеолиз мышечной ткани лабораторного животного в искусственном желудочном соке проводят при температуре 38,5-39,0°С, выделенные инвазионные личинки трихинелл 5-7-кратно отмывают стерильным физиологическим раствором, в который добавляют антибиотики с различным спектром действия, после чего осуществляют культивирование инвазионных личинок в течение 3-5 суток при температуре 38,5°С, и после отделения белкового продукта путем проведения его диализа и концентрирования выделяют экскреторно-секреторный антиген, а оставшиеся после отделения белкового продукта личинки трихинелл измельчают, полученный гомогенат экстрагируют, центрифугируют и из соматического экстракта путем фракционирования его на колонке с сефадексом G-100 дополнительно получают фракционированный соматический антиген.