Рентгеноконтрастное средство

Рентгеноконтрастное средство

Реферат

Изобретение относится к новым лекарственным препаратам, а именно к средствам контрастирования внутренних органов, и может найти применение в лучевой диагностике (ЛД) при ангиографии, компьютерной томографии (КТ) и лимфографии.

Известно, что возможности ЛД значительно увеличиваются при использовании рентгеноконтрастных средств (РКС). При этом необходимо, чтобы РКС сочетали в себе максимальную способность поглощать рентгеновские лучи, фармакологическую инертность, химическую стабильность, органоспецифичность, низкую вязкость, минимальную осмотическую активность и токсичность и быстрое выведение из организма.

Наиболее приемлемым компонентом таких средств является йод ввиду его высокой плотности, относительно низкой токсичности и прочного ковалентного связывания в молекуле органического вещества.

Этим требованиям в наибольшей степени удовлетворяют йодированные масляные РКС, поскольку они

- не являются солями и не диссоциируют на ионы в водной среде,

- обладают продолжительным действием,

- легко ассимилируются организмом,

- за счет прочного связывания йода в молекуле РКС не вызывают отравления организма свободным йодом,

- характеризуются низкой всасываемостью стенками сосудов, что снижает их токсическое действие на организм.

В последние годы рентгеноконтрастные методы исследования с использованием масляных контрастных веществ нашли широкое применение в экспериментальной и клинической медицине. Традиционными областями их применения стали лимфография, сиалография, рентгеноэндоваскулярная окклюзия и химиоэмболизация злокачественных новообразований различных локализаций и пр.

Однако количество пригодных для этих целей масляных РКС в настоящее время недостаточно. Основной задачей при разработке новых йодсодержащих рентгеноконтрастных препаратов является снижение токсичности, вязкости, улучшение качества визуализации и уменьшение вероятности осложнений, которые могут возникать при их использовании.

Йодированные масла известны с 1896 года, когда было получено йоднокунжутное масло, названное йодипином. В 1901 г. было изготовлено йодированное маковое масло, получившее название липиодол. Известно около 20 аналогичных препаратов, полученных йодированием растительных масел: рафинированного подсолнечного масла (йодолипол), сурепкового (кампиодол), вышеназванных кунжутного (йодипин) и макового (липиодол) и многих других. С 1961 г. началось широкое использование масляных РКС для прямой клинической лимфографии, при этом преимущественное применение получил липиодол.

Липиодол получают из макового масла, представляющего собой смесь стеариновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой кислот. Масло подвергают йодированию, после чего длительно и тщательно очищают. Содержание йода в липиодоле составляет 40%, уд. вес его 1.350, вязкость - 4.3 П.

Серьезным недостатком липиодола является, в первую очередь, высокая вязкость и опасность жировых эмболий, а также сложный состав, поскольку он представляет собой смесь йодированных и нейодированных продуктов, что затрудняет его идентификацию.

Применение липиодола и других масляных контрастных препаратов вызывает ряд осложнений в зависимости от области их применения (высокая вязкость масляных РКС, как выше сказано, может стать причиной жировых эмболий, наиболее опасного осложнения, у некоторых пациентов наблюдаются аллергические реакции, в лимфе масляные РКС подвергаются фрагментации, что обусловливает прерывистость изображения лимфатических сосудов). В связи с этим усилия исследователей направлены на создание РКС с меньшей вязкостью, пригодных для лимфографии.

Анализ зарубежной литературы свидетельствует об интенсивных исследованиях в области создания более совершенных масляных контрастных препаратов. В нашей стране производство РКС отсутствует и в клинической практике используются только импортные средства, в связи с чем создание отечественных РКС чрезвычайно актуально и явилось задачей настоящего изобретения.

Наиболее близким к предлагаемому РКС является сверхжидкий липиодол (Lipiodol ultra fluid) (прототип) [C.Maiorovici et al., Pharmazie, 1956, v.4, N2, p.126-130], вязкость которого равна 38 сП (при 25°С), уд. вес. - 1.27 (при 25°С), содержание йода составляет 48%. Рентгеноконтрастность (денситометрическая плотность по шкале Хаунсфилда) - 2984. Препарат широко применяется для контрастирования внутренних органов, лимфатического русла и лимфатических узлов.

Получают его йодированием очищенного макового масла посредством газообразной йодистоводородной кислоты. Йодированное масло с вязкостью 4.3 П (липиодол) этерифицируют посредством этилового спирта с получением менее вязкого продукта, получившего название сверхжидкий липиодол (Guebert, Франция).

Однако использование этого РКС все же может приводить к жировым эмболиям, а также к уменьшению капиллярного объема легочных артерий - опасного сопутствующего явления. Достаточно высокая вязкость препарата приводит к длительной по времени инъекции и требует электрических инжекторов для его введения. Кроме того, препарат не дает четких изображений некоторых групп лимфатических узлов. Помимо этого, он представляет собой смесь йодированных эфиров жирных кислот и потому трудно идентифицируется.

Техническая задача настоящего изобретения состояла в получении отечественного РКС, представляющего собой легко идентифицируемое индивидуальное соединение с более низкой вязкостью, что делает его пригодным для безопасного системного применения.

Эта задача решена получением масляного РКС, представляющего собой дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты с добавлением к ней 5% этилового эфира линолевой кислоты.

Получают заявляемое РКС следующим образом.

Исходным сырьем для получения дийодоэтилового эфира линолевой кислоты является индивидуальная линолевая кислота (торговый продукт), которую после перегонки в вакууме обрабатывают этиловым спиртом в бензоле в присутствии катализатора (серной кислоты) при перемешивании в течение 3-х часов и температуре 80°С. Для повышения выхода эфира в процессе реакции осуществляют азеотропную отгонку воды до полного удаления ее и избытка этилового спирта. Затем полученный этиловый эфир линолевой кислоты отделяют (жирный слой), промывают его дистиллированной водой, нейтрализуют насыщенным раствором соды и снова промывают водой, после чего сушат прокаленным сульфатом натрия. Фракция с температурой кипения 160-170°С при вакуумной разгонке полученной реакционной массы представляет собой этиловый эфир линолевой кислоты.

Этиловый эфир линолевой кислоты в петролейном эфире обрабатывают 57% раствором йодистоводородной кислоты в присутствии фосфорного ангидрида Р₂О₅ при температуре 20°С, охлаждая реакционную смесь льдом с солью. После этого нижний слой реакционной смеси отделяют (фосфорная кислота), а верхний (дийодированный эфир линолевой кислоты в петролейном эфире) нейтрализуют, дегалогенизируют, отмывают и сушат, после чего отгоняют петролейный эфир. В полученный йодированный эфир линолевой кислоты добавляют 5% исходного этилового эфира линолевой кислоты (для повышения его стабильности). Содержание йода в готовом продукте составляет 48%, плотность его - 1.18, вязкость - 15.2 сП, рентгеноконтрастность - 2958 (для сравнения вязкость сверхжидкого липиодола - 38 сП, плотность - 1.27, рентгеноконтрастность - 2984, содержание йода - 48%).

Результаты доклинических испытаний заявляемого РКС приведены ниже. Поскольку применение липиодола, его производных, а также других масляных РКС, как показывает клиническая практика, связано с возможностью жировых эмболий, исследования ученых были направлены на дальнейшее снижение вязкости РКС за счет создания эмульсий из них, которые за счет небольших размеров взвешенных частиц в них могут предотвращать такие серьезные осложнения, как легочные эмболии. Эмульсии лучше смешиваются с биологическими жидкостями, например с лимфой, что позволяет выявлять детальную структуру лимфатической системы. Кроме того, эмульгированные масляные РКС быстрее элиминируют из организма.

Первое сообщение о создании рентгеноконтрастной эмульсии липиодола появилось в 1930 г. [Proc.Exp.Biol.Med., 1930, 27, 538]. Однако она оказалась непригодной для применения из-за высокой токсичности и неустойчивости. С помощью эмульгаторов Твин 80 и Спан 80 авторам Hom F.S. et al. [J. Amer.pharmacol.Ass. sci Edit, 1957, 46, 254] удалось получить эмульсию липиодола ультра-флюид и использовать ее в эксперименте с получением четких изображений трудно доступных лимфатических узлов с хорошей переносимостью препарата. Однако при автоклавировании с целью стерилизации эмульсия расслаивалась и не эмульгировалась при встряхивании.

Перед разработчиками РКС по-прежнему стояла задача сочетания требований к создаваемым препаратам как технологического, так и клинико-токсикологического характера.

Таким требованиям соответствовала эмульсия на основе сверхжидкого липиодола, описанная в работе Fritisch G. [Pharmazie 1970, v.25, N4, p.248-252], взятая нами в качестве прототипа.

Эмульсия имеет следующий состав, мл:

Lipiodol UF	10
Cremophor EL	1
Glycerol	4
S.Glucosi	5

Вязкость этой эмульсии 48.1 сП (при 20°С). Доля частиц с размерами 0.85-5.10 мкм составляет 80% до стерилизации и 90% после нее (соответственно уменьшается доля мелких частиц). Стабильность эмульсии при комнатной температуре сохраняется свыше 2 мес. В конце этого периода обнаруживается разделение фаз, которое устраняется путем встряхивания перед инъекцией. Рентгеноконтрастность эмульсии проверена в экспериментах на собаках и кроликах на лингвальных, субментальных и субмандибулярных лимфатических узлах. Авторами сделан вывод о том, что эмульсия пригодна для использования в лимфографии. Сравнение эмульсии с исходным Lipiodol UF показало ее существенное преимущество перед ним, заключающееся в том, что четко контрастировались лимфатические узлы через 1-2 дня после инъекции эмульсии. Lipiodol UF обеспечивал отчетливые изображения лимфатических узлов через 14 дней, вызывая при этом значительные набухания их. При введении эмульсии ни у одного животного не наблюдалось увеличения лимфатических узлов. Гистологические исследования репрезентативных органов не выявили никаких достойных упоминания реакций.

Нестабильность описываемой эмульсии можно объяснить тем, что липиодол, используемый для приготовления эмульсии, представляет собой смесь йодированных эфиров жирных кислот, которая труднее очищается от различных примесей. Авторы отмечают, что контрастность лимфограмм была слабее при использовании эмульсии по сравнению с лимфограммами при использовании Lipiodol UF. На наш взгляд, это происходит потому, что она содержит 50% контрастного вещества.

Технический результат настоящего изобретения состоит в получении стабильной эмульсии, обладающей рентгеноконтрастностью, сопоставимой с контрастностью исходного масляного РКС.

Эта задача решена использованием эмульсии, содержащей дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты, этиловый эфир линолевой кислоты, буферный раствор монофосфата натрия с pH 7.4 и фармацевтически приемлемые наполнители при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты	22.50-23.00
Этиловый эфир линолевой кислоты	1.12-1.15
Фармацевтически приемлемые наполнители	5.8-6.20
Буферный раствор монофосфата натрия, pH 7.4	До 100.0

При этом в качестве фармацевтически приемлемых наполнителей она содержит Твин и Спан в соотношении 1:3.

Такой состав эмульсии обеспечивает следующие физико-химические свойства: содержание йода - 230 мг/мл, вязкость - 5.9 сП (25°С), плотность - 1.09 (25°С). Размер частиц эмульсии от 1000 до 3000 нм (1 и 3 мкм соответственно). Рентгеноконтрастные свойства (денситометрическая плотность по шкале Хаунсфилда) - 2500-2600, что обеспечивает высокую рентгеноконтрастность, практически равную контрастности дийодоэтилового эфира линолевой кислоты (2958) несмотря на то, что она содержит 25% исходного дийодоэтилового эфира линолевой кислоты. Меньшее содержание контрастного вещества в эмульсии обеспечивает и меньшую токсичность ее. Стабильность эмульсии сохраняется после стерилизации и длительного хранения.

При экспериментальной проверке эмульсии не обнаружено липогранулематозной реакции. Она хорошо контрастирует ретростеральные лимфатические узлы, нетоксична и может применяться как для прямой, так и непрямой лимфографии и контрастирования лимфатических структур средостения.

Результаты доклинического изучения эмульсии представлены ниже.

Для приготовления эмульсии в качестве водной фазы используют буферный раствор монофосфата натрия с рН 7.4, в который добавляют дийодэтиловый эфир линолевой кислоты и смесь эмульгаторов (Твин и Спан в соотношении 1:3).

Смесь перемешивают дробно со скоростью 4000 и 10000 об/мин. Общее время перемешивания 7 мин.

Полученную эмульсию расфасовывают в ампулы по 5, 10 мл и стерилизуют. Содержание йода в ней составляет 24-25%, плотность - 1.09 (25°С), вязкость - 5.90 сП (25°С), рентгеноконтрастность - 2557 по шкале Хаунсфилда. Размер частиц эмульсии 1000-3000 нм.

Анализировалась устойчивость эмульсии в процессе длительного хранения. Измерение дисперсного состава эмульсии через 9, 14, 28, 66 дней, а также через 4 и 6 мес показало, что она остается устойчивой в течение этого времени. Сравнение графиков распределения весовых долей частиц эмульсии по размерам в процессе хранения показывает, что при длительном хранении исчезает доля мелких частиц и растет доля крупных, но скорость этого процесса небольшая и практически дисперсный состав эмульсии в процессе хранения не меняется.

Объем проводимых доклинических испытаний заявляемых масляного РКС и эмульсии из него определялся "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (МЗ РФ, М., 2000, 398 с.) и "Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств Good Laboratory Practice (GLP)".

Доклинические испытания заявляемых препаратов проведены как для масляного РКС, так и для полученной из него эмульсии, при этом дозы препаратов в мг/кг брались из расчета на дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты.

ИЗУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ ЗАЯВЛЯЕМЫХ ПРЕПАРАТОВ

1. ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ

Острую токсичность препаратов изучали на половозрелых белых мышах и белых крысах линии Wistar.

В экспериментах на грызунах методом рандомизации животных разбивали на группы. В качестве критерия приемлемости рандомизации считали отсутствие у животных признаков заболеваний и гомогенность групп (по 5 животных) по полу и массе тела (±20%). Белым мышам препараты вводили внутрибрюшинно, крысам - внутривенно в возрастающих дозах по Литчфолду-Уилкоксону (точность дозирования достигалась изменением объема вводимого препарата). Дозы веществ (из расчета на дийодоэтиловый эфир линолевой кислоты) при внутрибрюшинном введении составили 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1000, 2000 и 3000 мг/кг.

После острого опыта грызуны наблюдались в течение 14 дней (1-й день - непрерывное наблюдение). Оценивали интегральные показатели: внешний вид животных (состояние волосяного и кожного покровов, места инъекции), поведение, симптомы интоксикации, прирост массы тела (определение исходной массы, на 7 и 14 сутки), потребление пищи и воды за сутки (определение исходного потребления, на 7 и 14 сутки). Также проводили оценку выделительной системы (частота мочеиспускания, цвет мочи), сердечно-сосудистой и дыхательной систем (частота дыхательных движений, частота сердечных сокращений - определение исходной частоты, на 7 и 14 сутки), пищеварительной системы (количество и консистенция фекальных масс - определение исходного количества за сутки, на 7 и 14 сутки), центральной и периферической нервной системы (поведенческие реакции, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, реакция на тактильные, звуковые, болевые и световые раздражители).

Проводили макроскопическое исследование внутренних органов погибших животных (головной мозг, сердце, печень, почки, легкие, селезенка, надпочечники, желудок, кишечник, мочевой пузырь, поджелудочная железа, тимус). При отсроченной гибели проводилось микроскопическое исследование органов.

Результаты исследования острой токсичности

1.1. Токсикометрия

Летальность белых мышей при внутрибрюшном введении препаратов в течение 14 дней наблюдения отсутствовала.

Летальность крыс линии Wistar при внутривенном введении отмечена лишь в дозе 3000 мг/кг и составила к 14 дню 6 крыс (3 самца и 3 самки).

Расчет острой токсичности по методу пробит-анализа

Дозы (мг/кг):

ED16=2296, ED50=2842, ED84=3519.

Как свидетельствуют полученные данные, препараты обладают крайне низкой токсичностью.

1.2. Влияние однократного введения препаратов на интегральные и функциональные показатели.

На протяжении всего периода наблюдения (вводимые дозы препаратов ежедневно в течение 14 дней белым мышам внутрибрюшинно по 2000, 3500 и 5000 мг/кг, крысам - внутривенно по 1000, 2000 и 3000 мг/кг) отклонений от нормы по общему состоянию и поведению у выживших животных опытных групп отмечено не было. Наблюдалась равномерная прибавка массы животных во время всего срока наблюдения, что доказывало отсутствие отсроченного токсического действия препаратов.

Для регистрации потребления животными воды и пищи в эти же временные сроки через 2 часа после введения препаратов животных на сутки высаживали в обменные клетки.

Проведенные исследования показали, что при введении препаратов во всех дозах отмечалось небольшое увеличение потребления корма к 14 суткам после введения. В группах животных с внутривенным введением препаратов в дозах 2000 и 3000 мг/кг наблюдалось и увеличение потребления воды.

Оценка выделительной функции почек проводилась по количеству суточной мочи крыс. Также оценивалась частота мочеиспускания, цвет и прозрачность мочи.

Моча во всех группах на всех сроках наблюдения была прозрачная, цвет колебался от светло-желтого до темно-желтого. Динамика суточного количества мочи у крыс позволила сделать вывод об отсутствии влияния препаратов на ее суточное количество. Статистически значимого различия между исходными показателями и суточным количеством мочи после введения препаратов выявлено не было.

Параметром оценки сердечно-сосудистой системы (ССС) была выбрана частота сердечных сокращений (ЧСС). Проведенное исследование показало, что у животных (крыс) с однократным внутривенным введением препаратов в дозах 1000, 2000 и 3000 мг/кг только при введении дозы 3000 мг/кг отмечается склонность к тахикардии.

Параметром оценки дыхательной системы (ДС) крыс была частота дыхательных движений (ЧДД) при однократном внутривенном введении препаратов в дозах 1000, 2000 и 3000 мг/кг. Полученные результаты показали, что во всех дозах статистически значимых различий с исходными значениями по параметру ЧДД выявлено не было.

Функцию пищеварительной системы у белых мышей и крыс оценивали по количеству и консистенции фекальных масс. При внутрибрюшинном и внутривенном введении препаратов во всех дозах изменений по количеству и консистенции фекальных масс ни у белых мышей, ни у крыс зарегистрировано не было.

1.3. Патологоанатомические исследования.

Животные всех экспериментальных групп по истечении периода наблюдения (14 дней) были выведены из эксперимента. Дозы препаратов при внутрибрюшинном введении составили 2000, 3500 и 5000 мг/кг, при внутривенном - 1000, 2000, 3000 мг/кг (по 10 животных на каждую группу - 5 самок, 5 самцов). Внешних различий между животными опытных групп не выявлено.

Шерсть мышей и крыс имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Питание животных удовлетворительное. Кожа и подкожная клетчатка в месте введения препаратов изменений не представляли. Инфильтратов, раздражения или некроза тканей в месте введения не наблюдалось.

При макроскопическом исследовании отчетливого влияния препаратов на состояние внутренних органов не установлено. При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось.

Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и плотность, розовато-красный цвет. Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию.

Величина и форма сердца изменений не имели. Мышца сердца была коричневой, плотной.

Поверхность легких имела бледно-розовую окраску; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка вне легочных бронхов была гладкой, блестящей, бледно-розовой.

Желудок имел обычную форму и размеры, просвет был заполнен плотным пищевым содержимым. Слизистая тела желудка была бледно-розовой, блестящей, складчатой. Слизистая тонкой и толстой кишки была блестящей, гладкой.

Печень умеренно увеличена. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию.

Поджелудочная железа была бледно-розовой, дольчатой.

Величина и форма почек не отличались от контроля, капсула легко снималась. Поверхность органа была гладкой, однородной коричнево-сероватой окраски. На разрезе почек четко различались корковое и мозговое вещество.

Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или яичек не отличались от обычных.

Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотную консистенцию.

Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество головного мозга имело умеренную плотность. Расширения желудочков мозга не наблюдалось.

У крыс с летальным исходом при внутривенном введении препаратов в дозе 3000 мг/кг при вскрытии были обнаружены следующие изменения:

- в легких на поверхности разреза выступает пенистая жидкость бледно-розового цвета;

- сосуды оболочек мозга полнокровны;

- печень умеренно увеличена, ткань бледного цвета, зернистой консистенции.

Проведенные испытания свидетельствуют об отсутствии противопоказаний для медицинского применения исследуемых препаратов по показателям острой токсичности.

2. ПОДОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ

Эксперименты по изучению подострой токсичности препаратов выполнялись на 48 половозрелых крысах обоего пола линии Wistar, объединенных в рандомизированные группы для проведения исследования.

Исследуемые препараты вводили ежедневно в течение 28 дней внутрибрюшинно в дозах 900 мг/кг и 1800 мг/кг и внутривенно (в хвостовые вены) в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг. Каждая группа животных состояла из 5 самцов и 5 самок.

Общая продолжительность наблюдения за животными составила 28 дней. Состояние животных (состояние волосяного и кожного покрова, места инъекции, поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, симптомы интоксикации) фиксировалось ежедневно. Взвешивание животных, потребление пищи и воды за сутки выполнялось раз в неделю.

Физиологические и биохимические исследования проводили до начала опыта (фоновые значения), на 7 и 14 дни.

После окончания введения препаратов животные всех экспериментальных групп были подвергнуты эвтаназии и направлены на вскрытие и патоморфологическое исследование.

2.1. Токсикометрия

При введении препаратов в дозах 900 мг/кг внутрибрюшинно и 140 мг/кг внутривенно смертности животных в течение 28-дневного ежедневного введения препаратов отмечено не было. Так как в течение первых 14 суток от момента ежедневного введения летальности среди животных даже с дозами внутрибрюшинного и внутривенного введения 1800 и 1400 мг/кг соответственно не отмечалось, сроки введения препаратов продлили до 28 суток. После 16 суток животные умирали (4 самки и 4 самца) на фоне дыхательной недостаточности при внутривенном введении и на фоне общей интоксикации при внутрибрюшинном введении.

Расчет подострой токсичности при внутрибрюшинном введении

ДОЗА - 1800 мг/кг

Самцы: Дозы (мг/кг)

ED16=28046, ED50=35622, ED84=45246.

Самки: Дозы (мг/кг)

ED16=21570, ED50=32588, ED84=49236.

Вывод: Результаты проведенных исследований показали, что изучаемые соединения обладают низкой токсичностью при внутрибрюшинном введении. Суммарная летальная доза препаратов при внутрибрюшинном введении составила 32588 мг/кг, что соответствует VI классу токсичности (относительно безвредно). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Расчет подострой токсичности при внутривенном введении препаратов

ДОЗА - 1400 мг/кг

Самцы: Дозы (мг/кг)

ED16=23966, ED50=28007, ED84=32729.

Самки: Дозы (мг/кг)

ED16=21245, ED50=26928, ED84=34132.

Вывод: Результаты проведенных исследований показали, что изучаемые соединения обладают низкой токсичностью при внутривенном введении. Полученные данные позволили рассчитать коэффициент кумулятивной активности ЛД_50(N)/ЛД_50(l), который составил около 10, что соответствует очень слабой кумулятивной активности (практически отсутствие). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Общий вывод: Вещества относятся к 4 классу опасности по степени воздействия на организм.

2.2. Влияние препаратов на лабораторные показатели периферической крови крыс.

Биохимические и гематологические исследования проводили на 14 и 28 дни от начала введения препаратов. Кровь получали пункцией хвостовой вены или (в конце исследования) после одномоментного гильотирования животных.

После ежедневного внутрибрюшинного введения препаратов в дозах 900 мг/кг и 1800 мг/кг и внутривенного введения в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг в периферической крови крыс определяли следующие лабораторные показатели: эритроциты, гемоглобин, гематокрит, цветовой показатель, средний объем эритроцитов, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, тромбоциты, лейкоциты, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, продолжительность свертывания, начало и окончание свертывания крови.

Полученные данные свидетельствовали о том, что ежедневное внутрибрюшинное введение препаратов не приводит к значимым отклонениям в лабораторных показателях крови на 14-й день, на 28-й день отмечен лейкоцитоз и повышение относительного содержания нейтрофилов, что следует расценить как признак реактивной воспалительной реакции брюшины (перитонит) в результате длительного введения препарата. При внутривенном введении препаратов в дозе 140 мг/кг отклонений в лабораторных показателях от нормы не наблюдалось. При введении препарата в дозе 1400 мг/кг на 14-й день отклонений также не отмечалось, а к 28 дню имела место 100%-ная летальность животных.

Биохимические показатели крови определяли после ежедневного внутрибрюшинного введения препаратов в дозах 900 и 1800 мг/кг и внутривенного введения в дозах 140 и 1400 мг/кг, которые включали общий белок, креатинин, мочевину, холестерин, глюкозу, билирубин общий, аланинаминотрансферазу, щелочную фосфатазу, натрий и калий также через 14 и 28 дней от начала введения препаратов.

Полученные данные свидетельствовали о том, что ежедневное внутривенное и внутрибрюшинное введение препаратов не приводит к значимым отклонениям биохимических показателей периферической крови у выживших животных.

2.3. Результаты гистологического исследования

Объекты исследования фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Для гистологического исследования использовались препараты головного мозга, печени, сердца, почек и легких в окрасках гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и Суданом Ш.

Исследование препаратов животных, погибших в ходе эксперимента при внутривенном введении препаратов в дозе 1400 мг/кг, показало следующее:

В печени резко выраженное полнокровие, особенно в центральных отделах долек. Балочная и дольковая структура печени сохранена. Цитоплазма гепатоцитов хлопьевидна или мелко вакуолизирована. Купферовские клетки немногочисленны.

В мозге резко выраженное полнокровие сосудов мозга и оболочек. В части сосудов мозга очаговые экстравазаты. Обратимые дистрофические изменения нейронов. Вокруг сосудов встречаются отдельные клетки в состоянии апоптоза (апоптозные тельца и обломки ядерного хроматина).

В селезенке отмечается полнокровие. Лимфоидные фолликулы довольно крупные. Светлые центры отсутствуют. Периартериальные зоны широкие. В красной пульпе диффузно расположенные макрофаги в умеренном количестве.

Таким образом, изучение органов животных, погибших в ходе эксперимента, выявило резко выраженные нарушения кровообращения в изученных органах, что сопровождалось дистрофическими изменениями паренхиматозных элементов в головном мозгу и печени.

При исследовании почек, сердца, головного мозга животных на 14-е и 28-е сутки от введения препаратов не получено существенной разницы изученных параметров. Не выявлено зависимости структуры указанных органов от дозы и пути введения, а также от сроков эксперимента.

В печени состояние гепатоцитов характеризовалось большей выраженностью дистрофических изменений на 14-е сутки (варианты белковой дистрофии) по сравнению с 28 сутками. Убедительных признаков жировой дистрофии или накопления препаратов в печени не выявлено ни у одного животного.

В легких на поздних сроках эксперимента вне зависимости от пути введения препаратов постоянно выявлялось накопление жирсодержащих веществ (препарата) в сосудах мелкого калибра и/или макрофагах (у 6 из 7 животных против 2 из 8 на ранних сроках). Это не сопровождалось существенными изменениями структуры бронхов или респираторных отделов. Не было отмечено и обогащения свободными клетками.

Резюме по подострой токсичности

Описанные выше результаты экспериментов на половозрелых крысах линии Wistar показали, что изучаемые соединения обладают низкой токсичностью при внутрибрюшинном и внутривенном путях введения. Суммарная летальная доза их при внутрибрюшинном введении составила 32588 мг/кг, при внутривенном - 26928 мг/кг, что соответствует VI классу токсичности (относительно безвредно). Анализ половой чувствительности показал отсутствие статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Вещества относятся к 4 классу опасности по степени воздействия на организм. Многократное введение препарата может вызвать воспалительную реакцию.

3. Изучение аллергенных свойств препаратов

Исследование аллергенных свойств препаратов проводили в соответствии с "Методическими указаниями по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" МЗ РФ, 2000.

Эксперименты проводились на белых крысах линии Wistar с массой тела 200-225 г, белых беспородных мышах с массой тела 18-20 г, морских свинках-альбиносах (масса тела 250-300 г).

Все экспериментальные животные проходили карантин длительностью 14 дней. В течение этого периода проводили ежедневный осмотр животных, оценивали поведение и общее состояние, больных или отличающихся по поведению животных отбраковывали. Перед началом эксперимента животные, отвечающие критериям включения в исследование, распределены на группы с помощью метода рандомизации.

При исследовании аллергенных свойств препаратов применяли регистрацию реакции общей анафилаксии (морские свинки), исследовали реакции иммунных комплексов (крысы), реакцию гиперчувствительности замедленного типа (мыши), применяли метод накожных аппликаций (морские свинки).

3.1. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)

Морским свинкам препараты вводили в эффективной диагностической дозе (140 мг/кг) и в дозе, в 10 раз ее превышающей (1400 мг/кг): первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в объеме, соответствующем объему исследуемых препаратов.

На 21 день после сенсебилизирующей инъекции животным внутривенно вводили разрешающую дозу препаратов, равную суммарной сенсебилизирующей. Аналогичную дозу вводили морским свинкам контрольных групп. Учет интенсивности анафилактического шока проводился в индексах по Wiegle:

++++ - шок со смертельным исходом;

+++ - шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает);

++ - шок умеренный (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма);

+ - шок слабый (некоторое беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошенная);

0 - шок не развился, признаки его отсутствуют.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что препараты в диагностической дозе обладают незначительными аллергизирующими свойствами. У половины животных был зафиксирован шок слабой степени (+ по шкале Wiegle). При введении препаратов в дозе 1400 мг/кг в ряде случаев отмечался шок со смертельным исходом (++++ по шкале Wiegle). Следует отметить, что и в группе контрольных животных, получивших ту же разрешающую дозу, также отмечался шок со смертельным исходом.

3.2. Реакция иммунных комплексов

Для постановки реакции использовали белых крыс линии Wistar, которым препараты вводили в дозах 140 и 1400 мг/кг. В контрольных группах использовали физиологический раствор в таком же объеме. Сенсибилизацию проводили подкожно, пятикратно с интервалом в 6 суток. Через 10 суток после последнего введения препаратов осуществляли введение разрешающей дозы внутрикожно.

Разрешающую дозу препаратов определяли на интактных животных. За разрешающую дозу принимали наибольшее разведение антигена, не вызывающее видимых изменений в коже через час после введения. В контрольных группах в таком же объеме вводили растворитель.

Учет реакции проводили визуально по пятибальной системе:

0 - видимой реакции нет;

1 - бледно-розовая эритема по всему участку или его периферии;

2 - ярко-розовая эритема по всему участку или его периферии;

3 - красная эритема по всему участку;

4 - инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы;

5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления (некроз), возможны геморрагии, образование корочек.

В положительном случае уже через 30 минут на месте инъекции может развиться отек и гиперемия. Через 2-3 часа воспалительный очаг может уплотниться и кожа становится буро-красной. При гистологическом исследовании в случае положительной реакции может быть обнаружено острое геморрагическое воспаление, в инфильтрированном участке могут быть видны полиморфно-ядерные лейкоциты.

Из полученных в результате проведенных исследований данных следует, что при сенсибилизации животных диагностической дозой признаков реакции иммунных комплексов обнаружено не было. В случае десятикратного ее превышения в месте введения отмечался лишь незначительный отек без гиперемии.

По данным гистологического исследования при сенсибилизации дозой 140 мг/кг признаков отека, полнокровия, клеточной реакции нет. При окраске по Ван-Гизону соединительная ткань фуксинофильна. Судан-положительные включения располагаются на уровне придатков, местами достигают сосочкового слоя.

При сенсибилизации крыс дозой 1400 мг/мл в гистологических препаратах кожи отмечается отек и полнокровие дермы, очаговые кровоизлияния. При окраске по Ван-Гизону выраженная пикринофилия. Судан-положительные каплевидные включения располагаются преимущественно на уровне придатков кожи, местами - вплоть до сосочкового слоя дермы. Клеточной реакции нет.

3.3. Метод накожных аппликаций

Исследование сенсибилизирующего действия препаратов проводили путем 10 повторных накожных аппликаций на участок боковой поверхности туловища морских свинок-альбиносов. Нанесение препаратов на кожу в дозах 140 мг/кг и 1400 мг/кг проводилось 5 раз в неделю на протяжении двух недель. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб С.В.Суворова.

Возникновение красной эритемы по всему участку кожи отмечалось у животных с нанесением 1400 мг/кг через 7 аппликаций. У животных с нанесением 140 мг/кг отмечалось лишь возникновение транзиторной бледно-розовой эритемы по всему участку. У ряда животных этой группы визуально изменений на коже выявить не удалось.

Таким образом, развитие контактного дерматита при