Деградированное антитело, являющееся агонистом tpo

Деградированное антитело, являющееся агонистом tpo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к модифицированным антителам, содержащим две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи антитела, которые проявляют ТРО-агонистическую активность путем поперечного сшивания ТРО-рецептора. Модифицированные антитела обладают активностью ТРО-агонистов, трансдуцируя сигнал в клетки путем поперечного сшивания ТРО-рецептора, и могут применяться как лекарственные средства в различных целях.

Уровень техники

Открытый в 1994 г. тромбопоэтин (ТРО) представляет собой фактор, регулирующий образование тромбоцитов, и, как известно, состоит из гликопротеина с молекулярной массой 70-80 тыс. Да и вырабатывается главным образом в печени. Тромбопоэтин - это цитокин, помогающий клеткам предшественника тромбоцитов в костном мозге выживать, размножаться, дифференцироваться и созревать, то есть он стимулирует дифференцировку и пролиферацию мегакариоцитов. Рецептор тромбопоэтина (ТРО) был идентифицирован ранее ТРО как с-Mpl, рецептор специфического фактора регуляции образования тромбоцитов (М. Souyri et al., Cell 63: 1137 (1990)). Как сообщалось, с-Mpl распространен преимущественно в клетках предшественника тромбоцитов, мегакариоцитах, и в клетках тромбоцитов, и подавление экспрессии с-Mpl избирательно тормозит образование мегакариоцитов (М. Methia et al., Blood 82: 1395 (1993)). Сообщение о том, что лигандом к с-Mpl является ТРО, основывалось на результатах анализа пролиферации клеток, специфичных к лиганду к с-Mpl, и очистки лиганда с использованием с-Mpl (F. De Sauvage et al., Nature 369: 533 (1994); TD. Bartley et al., Cell 77: 1117 (1994)). В настоящее время Mpl называют ТРО-рецептором. Как полагают, агонисты ТРО и ТРО-рецептора могут быть применены, таким образом, в качестве терапевтического средства против тромбоцитопении, например, как лекарственный препарат, снижающий тромбоцитопению, вызванную подавлением костного мозга или резекцией костного мозга при лечении больных раком.

Помимо этого, разрабатывались модифицированные антитела, в частности антитела с уменьшенными размерами молекулы, как, например, одноцепочечные Fv, для улучшения проникающей способности в ткани и опухоли за счет уменьшения размера молекул и которые можно было бы получать рекомбинантным способом. В последнее время димеры одноцепочечных Fv, особенно биспецифичные димеры, используют для наглядного сшивания клеток. Типичными примерами подобных димеров являются гетеродимеры одноцепочечных Fv, распознающие антигены раковых клеток и антигены клеток-хозяина, например, NK клеток (естественные киллеры) и нейтрофилов (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998). Их получают методами конструирования из одноцепочечных Fv в виде модифицированных антител, которые более эффективны при лечении разновидностей рака путем индуцирования поперечного межклеточного сшивания. Как полагают, образование межклеточных поперечных сшивок индуцируется антителами и их фрагментами (например, Fab-фрагментом), биспецифичными модифицированными антителами и даже димерами одноцепочечных Fv, которые сами по себе моноспецифичны.

Примеры антител, о которых известно, что они способны трансдуцировать сигнал путем образования поперечных сшивок поверхностных молекул/молекулы клетки, включают такие как антитело к ЕРО-рецептору, участвующему в дифференцировке и пролиферации (JP-A 2000-958000), антитело к MuSK-рецептору (Xie et al., Nature Biotech. 15, 768-771, 1997) и др. Известно также антитело-агонист к рецептору ТРО, его фрагменты и одноцепочечные Fvs (WO 99/17364). Однако никаких сведений о том, что димеры одноцепочечных Fv и такие модифицированные антитела, как одноцепочечные бивалентные антитела, обладают агонистической активностью, не приводилось.

Обратив внимание на тот факт, что мономеры одноцепочечных Fv, происходящие от моноклональных антител (антитело MABL-1 и антитело MABL-2, полученные авторами настоящего изобретения), индуцирующих апоптоз IAP-содержащих клеток, не индуцируют апоптоз клеток, а димеры индуцируют апоптоз, авторы изобретения открыли, что димеры поперечно сшивают (димеризируют) IAP-рецептор на клеточной поверхности и таким путем сигнал трансдуцируется в клетки, что в итоге приводит к индуцированию апоптоза. Это дало основание предположить, что димеры моноспецифичных одноцепочечных Fv поперечно сшивают молекулу/молекулы на поверхности клетки (т.е. рецептор) и трандуцируют сигнал, подобно лиганду, функционируя таким образом как агонисты.

Сосредоточив свое внимание на образовании межклеточных поперечных сшивок, авторы обнаружили, что вышеуказанные димеры одноцепочечных Fv не вызывают гемагглютинации, в то время как вышеуказанные моноклональные антитела вызывают ее. Такие же результаты были получены и для одноцепочечных двухвалентных антител (одноцепочечные полипептиды, содержащие две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи). Из этого следовало, что моноклональные антитела могут образовывать межклеточные поперечные сшивки, тогда как модифицированные антитела типа димеров одноцепочечного Fv и одноцепочечных двухвалентных антител, поперечно сшивают молекулу/молекулы поверхности клетки, однако межклеточных поперечных сшивок не образуют.

Основываясь на данных наблюдениях, авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что такие модифицированные антитела, как димеры одноцепочечных Fv и одноцепочечные бивалентные антитела, поперечно сшивают молекулу/молекулы на поверхности клетки или же внутриклеточную молекулу/молекулы той же клетки, помимо уже известного межклеточного поперечного сшивания, и что они приемлемы в качестве лигандов к молекуле/молекулам (в частности, в качестве лиганда, имитирующего действие естественного лиганда).

Обнаружив помимо этого, что молекулу антитела (цельный IgG) можно модифицировать в димеры одноцепочечного Fv, одноцепочечные бивалентные антитела и т.п., которые образуют поперечные сшивки молекулы/молекул поверхности клетки, уменьшая тем самым нежелательные последствия межклеточного поперечного сшивания и обеспечивая новые лекарственные средства, оказывающие только желательное воздействие на клетку, авторы таким образом завершили свое изобретение. Модифицированные антитела настоящего изобретения обладают значительно более высокой активностью, чем цельные антитела (IgG), содержащие ту же самую V-область, что и модифицированные антитела. Благодаря уменьшенным, по сравнению с молекулами антител, молекулярным размерам и благодаря отсутствию у них константных областей, они обладают улучшенной проникающей способностью в ткани.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является получение модифицированных антител-агонистов с уменьшенным размером молекулы, содержащих две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи моноклонального антитела и проявляющих ТРО-агонистическую активность путем поперечного сшивания ТРО-рецептора.

Таким образом, настоящее изобретение относится к модифицированным антителам, содержащим две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, предпочтительно от 2 до 6 каждой, особенно предпочтительно от 2 до 4 каждой, наиболее предпочтительно по две каждой, и проявляющим активность как ТРО-агонисты путем поперечного сшивания ТРО-рецептора.

"Модифицированные антитела" в настоящем описании означают любое вещество, содержащее две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, в котором вышеозначенные V-области связаны напрямую или же через линкер с помощью ковалентной или нековалентной связи. Например, полипептиды и соединения, полученные соединением каждой V-области антитела через пептидный линкер или с помощью химического поперечносшивающего агента или т.п. Две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, используемые в настоящем изобретении, могут быть производными одного и того же антитела или же разных антител.

Модифицированными антителами, согласно настоящему изобретению, могут быть любые вещества, пока они сохраняют способность специфического распознавания и поперечного сшивания ТРО-рецептора и таким образом могут трансдуцировать сигнал в клетки. Сюда входят модифицированные антитела, полученные дальнейшей модификацией одной из частей аминокислотной последовательности V-области модифицированных антител.

Предпочтительными примерами модифицированных антител по настоящему изобретению являются такие мультимеры, как димеры, тримеры и тетрамеры одноцепочного Fv, содержащие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, или одноцепочечные полипептиды, содержащие две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи. Для случаев, когда модифицированные антитела по настоящему изобретению являются мультимерами одноцепочного Fv, например димерами, тримерами, тетрамерами и т.п., содержащими V-область Н-цепи и V-область L-цепи, предпочтительно, чтобы V-область Н-цепи и V-область L-цепи, присутствующие в одной и той же цепи, не были бы соединены таким образом, чтобы образовывать антигенсвязывающий центр.

Более предпочтительными примерами являются димеры одноцепочечного Fv, содержащего V-область Н-цепи и V-область L-цепи, или одноцепочечный полипептид, содержащий две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. Предпочтительно, чтобы V-область Н-цепи и V-область L-цепи в этих модифицированных антителах были соединены через линкер.

Примеры вышеуказанного мультимера одноцепочечного Fv включают мультимеры с нековалентной связью, мультимеры с ковалентной связью, полученные при помощи поперечносшивающего радикала, и мультимеры, полученные посредством поперечносшивающего реагента (антитела, фрагмента антитела или двухвалентного модифицированного антитела). В качестве поперечносшивающих радикалов для образования мультимера могут быть использованы стандартные поперечносшивающие радикалы, применяемые для поперечной сшивки пептидов. В качестве примера можно привести дисульфидную мостиковую связь по остаткам цистеина, другие поперечносшивающие радикалы, например С₄-С₁₀ алкилен (т.е. тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, гептаметилен и октаметилен и т.д.), или С₄-С₁₀ алкенилен (цис-/транс-3-бутенилен, цис-/транс-2-пентенилен, цис-/транс-3-пентенилен, цис-/транс-3-гексенилен и т.д.).

Кроме того, таким поперечносшивающим реагентом, который может соединяться с одноцепочечнным Fv, является, например, аминокислотная последовательность, которую можно необязательно вводить в Fv, например, антитело к FLAG-последовательности или подобной или его фрагмент или модифицированное антитело, происходящее из антитела, например одноцепочечный Fv.

"ТРО-агонистическое действие" в настоящем описании обозначает биологическое действие, протекающее в клетке/клетках, сигнал в которую/которые трансдуцируется путем поперечного сшивания ТРО-рецептора, например, пролиферация, дифференцировка или стимуляция роста мегакариоцитов или образование тромбоцитов.

ED50 ТРО-агонистического действия, согласно изобретению, определяют общепринятыми для измерения агонистического действия способами. Примеры методов такого измерения включают анализ клеточной пролиферации с применением клеточных линий, чувствительных к ТРО, типа BaF/mpl или UT7/TPO; измерение фосфорилирования белка MPL; анализ дифференциации колонии мегакариоцитов из клеток костного мозга; анализ восстановительного синтеза в тромбоцитах мышей in vivo; измерение индукции экспрессии тромбоцитарного антигена GPIIbIIIa (анти-GPIIbIIIa) с использованием линии мегакариобластных клеток лейкемии человека (СМК) или измерение индукции полиплоидии клеточной линии мегакариобластов (DAMI). ED50 - это доза, необходимая для достижения 50% реакции по отношению к максимуму активности, принятому за 100% на кривой "доза-реакция".

Предпочтительные модифицированные антитела по настоящему изобретению обладают ТРО-агонистическим действием (ED50), равным или же большим, чем у антитела с той же антигенсвязывающей областью, как у модифицированного антитела, то есть, чем у целого антитела (далее по тексту "исходное антитело"), например IgG, имеющего ту же пару V-области Н-цепи и V-области L-цепи, что и пара V-области Н-цепи и V-области L-цепи, образующая антигенсвязывающую область модифицированного антитела. Более предпочтительными являются модифицированные антитела, у которых ТРО-агонистическое действие (ED50) более чем в два раза выше, чем у исходного антитела, еще более предпочтительны модифицированные антитела с более чем 5-кратным превышением, наиболее предпочтительны с более чем 10-кратным превышением. Настоящее изобретение относится к модифицированным антителам с ТРО-агонистическим действием, содержащим V-область Н-цепи и V-область L-цепи, образующие такую же антигенсвязывающую область, как и исходное антитело, которое связывается с ТРО-рецептором, однако не обладает ТРО-агонистическим действием в отношении молекулы.

Соединения, содержащие две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи по настоящему изобретению, - это любые соединения, которые содержат две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи антитела и оказывают ТРО-агонистическое действие (ED50), равное или лучшее, чем у тромбопоэтина (ТРО). Предпочтительными являются такие, у которых ТРО-агонистическое действие (ED50) выше, чем у ТРО, более чем в два раза, более предпочтительны с более чем 5-кратным превышением, наиболее предпочтительны с более чем 10-кратным превышением.

Упоминаемые здесь "соединения" включают не только модифицированные антитела по изобретению, но также и любые соединения, содержащие две или более, предпочтительно от 2 до 6, более предпочтительно от 2 до 4, наиболее предпочтительно 2, антигенсвязывающие области, такие, как целые антитела или F(ab')₂.

У предпочтительных модифицированных антител или соединений по настоящему изобретению, содержащих две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи антитела, межклеточное адгезионное действие (ED50) не превышает 1/10 сравнительно с исходным антителом, у более предпочтительных сколько-нибудь существенное межклеточное адгезионное действие отсутствует.

Вышеуказанное ED50 межклеточного адгезионного действия определяется стандартными способами измерения межклеточного адгезионного действия, например измерением агломерации клеток, экспрессирующих ТРО-рецептор.

Изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим модифицированные антитела.

Изобретение относится к клеткам животных или микроорганизмов, которые продуцируют модифицированные антитела.

Изобретение относится к использованию модифицированного антитела в качестве ТРО-агониста.

Изобретение относится к способу трансдукции сигнала в клетки путем поперечного сшивания ТРО-рецептора с помощью модифицированного антитела и индуцирования таким образом ТРО-агонистического действия, как, например, пролиферации, дифференцировки-индукции, или стимуляции роста мегакариоцитов, образования тромбоцитов, фосфорилирования белка ТРО-рецептора и т.д.

Изобретение относится к лекарственному средству для лечения тромбоцитопении и т.п., которое содержит модифицированное антитело в качестве активного компонента.

Изобретение относится к применению модифицированного антитела в качестве лекарственного средства.

Изобретение относится к способу скрининга или количественного определения модифицированного антитела, которое содержит две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи антитела и оказывает ТРО-агонистическое действие путем поперечного сшивания ТРО-рецептора, причем способ включает 1) получение модифицированного антитела, содержащего две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи антитела и специфически связывающегося с ТРО-рецептором, 2) контактирование модифицированного антитела с клетками, экспрессирующими ТРО-рецептор и 3) измерение ТРО-агонистического действия, которое происходит в клетках путем образования поперечных сшивок ТРО-рецептора. Способ количественного определения применяется для контроля качества при производстве модифицированных антител по изобретению в качестве лекарственных средств и в других целях.

Модифицированные антитела могут быть как моноспецифичными модифицированными антителами, так и мультиспецифичными модифицированными антителами, например биспецифичными модифицированными антителами. Предпочтительными являются моноспецифичные модифицированные антитела.

Настоящее изобретение относится также к модифицированным антителам, у которых V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи - это V-область Н-цепи, происходящая из человеческого антитела, и/или V-область L-цепи, происходящая из человеческого антитела. V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи, происходящие из человеческого антитела, можно получить путем скрининга библиотеки моноклонального антитела, как это описано в WO 99/10494. V-область Н-цепи и/или V-область L-цепи, происходящие из человеческих моноклональных антител, продуцируемых трансгенными мышами и т.п., также включены в изобретение.

Кроме того, изобретение относится также к модифицированным антителам, у которых V-области Н-цепи и/или V-области L-цепи являются гуманизированными V-областями Н-цепи и/или гуманизованными V-областями L-цепи. Конкретно, гуманизированные модифицированные антитела состоят из гуманизированной V-области L-цепи, которая содержит каркасные области (FR), происходящие из V-области L-цепи человеческого моноклонального антитела, и области, определяющие комплементарность (далее по тексту "CDR"), происходящие из V-области L-цепи моноклонального антитела какого-либо млекопитающего, кроме человека (например, мышь, крыса, корова, овца, человекообразная обезьяна), и/или гуманизированной V-область Н-цепи, содержащей FR, происходящие из V-области Н-цепи человеческого моноклонального антитела, и CDR, происходящие из V-области Н-цепи моноклонального антитела какого-либо млекопитающего, кроме человека (например, мышь, крыса, корова, овца, человекообразная обезьяна). В этом случае аминокислотные последовательности CDR и FR могут быть частично изменены, например делетированы, замещены или добавлены.

V-области Н-цепи и/или V-области L-цепи модифицированных антител по изобретению могут быть V-областями Н-цепи и/или V-областями L-цепи, происходящими из моноклональных антител млекопитающих, кроме человека (например, мышь, крыса, корова, овца, человекообразная обезьяна, цыпленок и т.п.). В этом случае аминокислотные последовательности CDR и FR могут быть частично изменены, например делетированы, замещены или добавлены.

Изобретение относится также к молекулам ДНК, кодирующим различные модифицированные антитела, как это было указано выше, и к генно-инженерным методам получения рекомбинантных векторов, включающих ДНК.

Изобретение относится также к клеткам-хозяевам, трансформированным рекомбинантными векторами. Примерами клеток-хозяев могут быть человеческие клетки, мышиные и т.п. и микроорганизмы, как Е.colli. Bacillus sublilis. дрожжи и т.д.

Изобретение относится также к способу получения модифицированных антител, который включает культивирование вышеупомянутых клеток-хозяев и экстрагирование модифицированных антител из полученной культуры.

Кроме того, изобретение относится также к способу получения димера одноцепочечного Fv, который включает культивирование животных клеток-хозяев, продуцирующих одноцепочечный Fv, в бессывороточной среде для секреции одноцепочечного Fv в среду и выделение димера одноцепочечного Fv, образующегося в среде.

Изобретение относится также к применению модифицированных антител в качестве ТРО-агониста. Это значит, что оно относится к агонисту трансдукции сигнала, который включает в себя в качестве активной составляющей модифицированное антитело, полученное вышеуказанным способом.

Таким образом, фармацевтические препараты, содержащие ТРО-агонистические модифицированные антитела по изобретению в качестве активного компонента, могут быть использованы в качестве профилактических или лечебных средств при заболеваниях крови, связанных с уменьшением содержания тромбоцитов, тромбоцитопении, вызванной химиотерапией при раковых заболеваниях или лейкемии, и т.п.

Модифицированные антитела настоящего изобретения содержат две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, происходящие из антител. По своей структуре модифицированное антитело может быть димером одноцепочечного Fv, содержащего одну V-область Н-цепи и одну V-область L-цепи, или полипептидом, содержащим две V-области Н-цепи и две V-области L-цепи. У модифицированных антител по изобретению V-области Н-цепи и L-цепи связаны предпочтительно через пептидный линкер, который состоит из одной или более аминокислот. Получающиеся модифицированные антитела содержат вариабельные области антител и связываются с антигеном с такой же специфичностью, что и исходные моноклональные антитела.

V-область Н-цепи

Согласно настоящему изобретению, V-область Н-цепи, происходящая из антитела, распознает ТРО-рецептор и олигомеризует, например димеризует, вышеназванную молекулу путем образования поперечной сшивки, трансдуцируя таким образом сигнал в клетки. V-область Н-цепи по настоящему изобретению включает V-области Н-цепи, происходящие из какого-либо млекопитающего (например, человеческие, мышиные, крысиные, бычьи, овечьи, человекообразных обезьян и т.п.), и V-области Н-цепи, содержащие частично модифицированные аминокислотные последовательности V-областей Н-цепей. Более предпочтительной является гуманизированная V-область Н-цепи, содержащая FR V-области Н-цепи человеческого моноклонального антитела и CDR-участок V-области Н-цепи мышиного моноклонального антитела. Также предпочтительной является V-область Н-цепи, имеющая аминокислотную последовательность, происходящую из человека, которую можно получить рекомбинантным методом. V-область Н-цепи по изобретению может быть фрагментом вышеуказанной V-области Н-цепи, каковой фрагмент сохраняет способность связывать антиген.

V-область L-цепи

Согласно настоящему изобретению, V-область L-цепи, происходящая из антитела, распознает ТРО-рецептор и олигомеризует, например димеризует, вышеназванную молекулу путем образования поперечной сшивки, трансдуцируя таким образом сигнал в клетки. V-область L-цепи по настоящему изобретению включает V-области L-цепи, происходящие из млекопитающего (например, человеческие, мышиные, крысиные, бычьи, овечьи, человекообразных обезьян и т.п.), и V-области L-цепи, содержащие частично модифицированные аминокислотные последовательности V-областей L-цепи. Более предпочтительной является гуманизированная V-область L-цепи, содержащая FR V-области L-цепи человеческого моноклонального антитела и CDR V-области L-цепи мышиного моноклонального антитела. Также предпочтительной является V-область L-цепи, имеющая аминокислотную последовательность, происходящую из человека, которую можно получить рекомбинантным методом. V-область L-цепи по изобретению может быть фрагментом вышеуказанной V-области L-цепи, каковой фрагмент сохраняет способность связывать антиген.

Область, определяющая комплементарность (CDR)

Каждая V-область L-цепи и Н-цепи образует антигенсвязывающий сайт. Вариабельная область L- и Н-цепей составлена из четырех сравнительно консервативных общих каркасных областей, соединенных с тремя гипервариабельными участками, или областей, определяющих комплементарность (CDR) (Kabat E.A. et al., "Sequences of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Главные части четырех каркасных областей (FRs) образуют β-складчатые структуры, а три CDR образуют, таким образом, петлю. В некоторых случаях CDR могут образовывать часть β-складчатой структуры. Три CDR удерживаются в пространственно близком положении друг к другу с помощью FR, который вносит вклад в формирование антигенсвязывающего сайта наряду с тремя CDR.

Эти CDR можно идентифицировать, сравнивая аминокислотную последовательность V-области полученного антитела с установленными аминокислотными последовательностями V-областей известных антител согласно эмпирическому правилу Kabat E.A. et al., "Sequences of Protein of Immunological Interest".

Одноцепочечный Fv.

Одноцепочечный Fv - это полипептитдный мономер, содержащий связанные друг с другом V-область Н-цепи и V-область L-цепи, происходящие из антител. Полученные одноцепочечные Fv включают вариабельные области исходных антител и сохраняют области, определяющие комплементарность, и, следовательно, одноцепочечные Fv связываются с антигеном с той же специфичностью, что и исходные антитела (JP-Appl. 11-63557). Часть вариабельной области и/или CDR одноцепочечного Fv по изобретению или часть ее аминокислотной последовательности можно частично изменить, например, делетировать, заместить или присоединить. Вышеуказанные V-область Н-цепи и V-область L-цепи, входящие в состав одноцепочечного Fv изобретения, можно соединять непосредственно или через линкер, предпочтительно через пептидный линкер. У одноцепочечного Fv может быть следующее строение: [V-область Н-цепи] - [V-область L-цепи] или [V-область L-цепи] - [V-область Н-цепи]. Согласно настоящему изобретению можно сделать так, чтобы одноцепочечный Fv образовывал димер, тример или тетрамер, из которых может быть образовано модифицированное антитело изобретения. Одноцепочечное модифицированное антитело

Одноцепочечные модифицированные антитела настоящего изобретения, содержащие две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, предпочтительно от двух до четырех каждой, особенно предпочтительно по две каждой, содержат две или более V-области Н-цепи и V-области L-цепи, как указано выше. Каждая из областей пептида должна быть организована так, чтобы модифицированное одноцепочное антитело образовывало специфическую пространственную структуру, точно имитирующую пространственную структуру, образуемую димером одноцепочечного Fv. Например, V-области можно расположить в нижеследующем порядке:

[V-область Н-цепи] - [V-область L-цепи] - [V-область Н-цепи] - [V-область L-цепи] или [V-область L-цепи] - [V-область Н-цепи] - [V-область L-цепи] - [V-область Н-цепи], где данные области соединяются соответственно через пептидный линкер.

Линкер

Согласно изобретению, линкером для соединения V-области Н-цепи с V-областью L-цепи может быть любой пептидный линкер, который может быть введен с помощью методов генной инженерии, или любой химически синтезируемый линкер. Например, согласно изобретению, можно использовать линкеры, раскрытые в литературе, например, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996. Линкеры в одной и той же молекуле могут быть одинаковыми или разными. Если требуются пептидные линкеры, то ниже приводятся их примеры:

Ser

Gly-Ser

Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly

(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n и

(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)_n,

где n - целое число не менее единицы. Предпочтительная длина пептида-линкера варьирует в зависимости от того, какой рецептор будет антигеном, для одноцепочечных Fv обычно предпочтительным является диапазон 1-20 аминокислот. В случае одноцепочечных модифицированных антител, содержащих две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, пептидные линкеры, соединяющие области, образующие один и тот же антигенсвязывающий центр, включающий [V-область Н-цепи] - [V-область L-цепи] (или [V-область L-цепи] - [V-область Н-цепи]), имеют длину от 1-30 аминокислот, предпочтительно 1-20 аминокислот, более предпочтительно 3-18 аминокислот. Пептидные линкеры, соединяющие области, не образующие общий антигенсвязывающий центр, включающий [V-область Н-цепи] - [V-область L-цепи] (или [V-область L-цепи] - [V-область Н-цепи]), имеют длину от 1-40 аминокислот, предпочтительно 3-30 аминокислот, более предпочтительно 5-20 аминокислот. Способ введения этих линкеров будет описан ниже при объяснении конструирования ДНК, кодирующей модифицированные антитела изобретения.

Химически синтезированными линкерами, то есть химическими поперечносшивающими агентами, согласно изобретению, могут быть любые линкеры, применяемые обычно для сшивания пептидов. В число таких линкеров входят N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS³), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликольбис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES), бис[2-(сульфосукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES) и т.п. Все они являются коммерчески доступными. Предпочтительно, чтобы химически синтезированные линкеры имели длину, равную длине пептидных линкеров.

Для получения димера одноцепочечного Fv предпочтительно выбирать линкер, подходящий для димеризации в таком растворе, как культурная среда, более 20% одноцепочечных Fv, продуцируемых в клетках-хозяевах, предпочтительно более 50%, более предпочтительно более 80%, наиболее предпочтительно более 90%. Особенно предпочтительным является линкер, включающий от 2 до 12 аминокислот, предпочтительно от 3 до 10 аминокислот, или же другие линкеры, соответствующие им.

Получение модифицированных антител

Модифицированные антитела можно получать присоединением, через вышеуказанный линкер, V-области Н-цепи и V-области L-цепи, происходящих из известных или новых антител, специфически связывающихся с ТРО-рецептором. В качестве примеров одноцепочечных Fv приводятся те, что содержат V-область Н-цепи и V-область L-цепи антитела 12В5 и антитела 12Е10, раскрытых в WO 99/10494. В качестве примеров модифицированных антител по изобретению, содержащих две или более V-области Н-цепи и две или более V-области L-цепи, приводятся димер sc12B5 (линкер: 15 аминокислот), димер sc12E10 (линкер: 15 аминокислот), димер db12B5 (линкер: 5 аминокислот), димер db12E10 (линкер: 5 аминокислот), sc12B5sc(FV)₂ и sc12E10sc(FV)₂, которые содержат V-области Н-цепи и V-области L-цепи, происходящие из вышеуказанных моноклональных антител.

При получении модифицированных антител сигнальный пептид можно присоединять к его N-концу, если нужно, чтобы полученный полипептид был секреторным пептидом. Для эффективной очистки полипептида можно применить такую широко используемую для очистки полипептидов аминокислотную последовательность, как FLAG-последовательность. В этом случае димер можно получить с использованием анти-FLAG антитела.

Для получения модифицированного антитела по изобретению необходимо получить ДНК, то есть ДНК, кодирующую одноцепочечный Fv, или ДНК, кодирующую реконструированный одноцепочечный полипептид. Эти ДНК могут быть получены, особенно для sc12B5, db12B5, sc12E10 и/или db12E10, из ДНК, кодирующих V-области Н-цепи и V-области L-цепи, происходящие из указанных Fv. Их можно также получить методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя эти ДНК в качестве матрицы и амплифицируя фрагменты ДНК, содержащиеся в них, которые кодируют требуемую аминокислотную последовательность, с помощью двух праймеров, соответствующих обоим концам последовательности.

Если нужно, чтобы каждая V-область содержала частично модифицированную аминокислотную последовательность, то такие V-области, в которых модифицированы, то есть утрачены, замещены или добавлены одна или несколько аминокислот, можно получить с помощью хорошо известного из уровня техники метода ПЦР. Для того чтобы получить модифицированное антитело, которое было бы достаточно активным в отношении специфического антигена, предпочтительно модифицировать часть аминокислотной последовательности V-области методом ПЦР, хорошо известным из уровня техники.

Для выбора праймеров для аплификации методом ПЦР, если в качестве исходного материала используется моноклональное антитело, определяют типы Н-и L-цепей методом типирования, известным из уровня техники.

Для амплификации V-областей L-цепи антитела 12В5 и антитела 12Е10 методом ПЦР 5'-концевой и 3'-концевой олигонуклеотидные праймеры выбирают, как упомянуто выше. Таким же образом выбирают 5'-концевой и 3'-концевой олигонуклеотидные праймеры для амплификации V-областей Н-цепи антитела 12В5 и антитела 12Е10.

В воплощениях изобретения используются 5'-концевые праймеры, которые содержат последовательность "GANTC", обеспечивающую сайт узнавания рестриктазы Hinf I, вблизи от их S'-конца, и 3''-концевые, которые содержат нуклеотидную последовательность "CCCGGG", обеспечивающую сайт узнавания XmaI, вблизи от их 5'-конца. Вместо этих сайтов можно использовать сайты узнавания других рестриктаз до тех пор, пока их применяют для субклонирования требуемых фрагментов ДНК в клонирующий вектор.

Специально сконструированные ПЦР-праймеры применяют для того, чтобы обеспечить соответствующие нуклеотидные последовательности на 5'-конце и 3'-конце кДНК, кодирующей V-области антител 12В5 и 12Е10, так, чтобы кДНК легко встраивалась в экспрессионный вектор и функционировала бы в эекспрессионном векторе соответствующим образом (т.е. изобретение предусматривает увеличение эффективности транскрипции за счет встраивания последовательности Козака). V-области антител 12В5 и 12Е10, полученные амплификацией методом ПЦР с использованием таких праймеров, встраивают в экспрессионный вектор HEF, содержащий желаемую С-область человека (см. WO 92/19759). Клонированные ДНК можно секвенировать любым общепринятым способом, например, с помощью автоматического секвенатора ДНК (Applied Biosystems).

Линкер, такой как, например, пептидный линкер, можно ввести в модифицированное антитело изобретения следующим образом. Конструируют праймеры, которые имеют последовательности, частично комплементарные праймерам для V-областей Н-цепей и V-областей L-цепей, описанным выше, и которые кодируют N-конец и С-конец линкера. Затем можно провести ПЦР с использованием этих праймеров для получения ДНК, кодирующей пептидный линкер, имеющий желаемые аминокислотную последовательность и длину. ДНК, кодирующие V-область Н-цепи и V-область L-цепи, можно состыковать с помощью полученной ДНК, чтобы получить ДНК, кодирующую модифицированное антитело изобретения, содержащее требуемый пептидный линкер. Как только получена ДНК, кодирующая одно из модифицированных антител, легко можно получить ДНК, кодирующие модифицированные антитела с требуемым пептидным линкером или без него, путем конструирования различных праймеров для линкера, а затем проведения ПЦР с использованием праймеров и вышеуказанной ДНК в качестве матрицы.

Каждую V-область модифицированного антитела настоящего изобретения можно гуманизировать по общепринятой методике (Sato К. et al., Cancer Res., 53, 1-6 (1993)). Как только получена ДНК, кодирующая каждый из гуманизированных Fv, легко можно получить гуманизированный одноцепочечный Fv, фрагмент гуманизированного одноцепочечного Fv, гуманизированное моноклональное антитело и фрагмент гуманизованного моноклонального антитела в соответствии с общепринятой методикой. Предпочтительно, чтобы аминокислотные последовательности их V-областей могли быть при необходимости частично модифицированы.

Далее, можно получить ДНК, происходящую от другого млекопитающего, например, ДНК, кодирующую каждую из V-областей антитела человека, таким же способом, каким была получена ДНК, кодирующая V-область Н-цепи и V-область L-цепи, происходящие из мыши, в соответствии с общепринятыми методами, упомянутыми выше. Результирующую ДНК можно использовать для получения V-области Н-цепи и V-области L-цепи других млекопитающих, в частности, происходящих из антитела человека, одноцепочечный Fv, происходящий из человека, и его фрагмент, и моноклональное антитело человеческого происхождения и его фрагмент.

В случаях, когда модифицированные антитела, соответствующие изобретению, являются биспецифическими модифицированными антителами, их получают одним из известных из уровня техники способов (например, способ, описанный в WO 9413804).

Как было указано выше, когда получены требуемые ДНК, кодирующие V-области модифицированных антител и V-области гуманизированных модифицированных антител, то можно получить содержащие их экспрессионные векторы и хозяев, трансформированных этими векторами, стандартными способами. Кроме того, стандартными методами можно культвировать хозяев, для того чтобы получить реконструированный одноцепочечный Fv, реконструированный гуманизированный одноцепочечный Fv, гуманизированн