Инфекционные клоны полномерной кднк клещевого флавивируса

Инфекционные клоны полномерной кднк клещевого флавивируса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области вирусологии. Описанные здесь варианты выполнения включают в себя клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата.

Существующий уровень техники

В роде флавивирусов семейства Flaviviridae существует более 60 переносимых членистоногими антигенно родственных вирусов с положительной спиралью РНК, многие из которых являются важными патогенами человека. Антигенно-родственный вирусный комплекс клещевого энцефалита семейства флавивирусов включает в себя вирус клещевого энцефалита (ВКЭ, ранее называвшийся вирусом русского весенне-летнего энцефалита), вирус болезни Кьясанурского леса, вирус Лангата, вирус болезни Лупинга, вирус Негиши, вирус омской геморрагической лихорадки и вирус Повассана (Calisher С.Н., Karabatsos N., Dalrymple J.M., Shope R.E., Porterfield J., Westaway E.G. and Brant W.E. (1989) Antigenic relationships between flaviviruses are determined by cross-neutralization test with polyclonal antisera. J. Gen. Virol., 70, 27-43; Monath Т.P. and Heinz F.X. (1996) Flaviviruses. In "Fields Virology." (B.N.Fields, D.M.Knipe & P.M.Howley, Eds.), 3^rd ed., pp.961-1035. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia & New York). Эти вирусы распространены по большей части Северного полушария и за исключением вируса Лангата вызывают у человека заболевания различной тяжести, смертность от которых может достигать от 20 до 30%. Клещевой энцефалит остается актуальной проблемой общественного здравоохранения в Восточной Европе и России, где ежегодно диагностируется 9000-12000 случаев заболевания. Значительное увеличение смертности отмечалось в 1956 и 1964 годах, когда было поражено от 4500 до 4600 человек на каждые 100000 жителей (Gaidamovich S.Y. (1995) Tick-borne flavivirus infections. In "Exotic Viral Infections". (J.S. Porterfield, Ed.) pp.203-221. Chapman & Hall, London).

Флавивирусы клещевого энцефалита имеют общие гликопротеиновые эпитопы, которые часто вызывают перекрестную сопротивляемость вирусов группы. Приблизительно три десятилетия назад эти свойства антигенной перекрестной реакционности и последующее обнаружение вирулентного полиморфизма привели к предположению, что успешная иммунизация возможна с помощью живого, природно ослабленного клещевого флавивируса (Il'enko V.I., Smorodincev A.A., Prozorova I.N. and Platonov V.G. (1968) Experience in the study of a live vaccine made from the TP21 strain of Malayan Langat virus. Bull. W.H.O. 39, 425-431; Price W.H., Thind I.S., Teasdall R.D. and O'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. W.H.O. 42, 89-94; Mayer V., Orolin D., Pogady J., Starek M., Kubistova K., Gajdo-Sova E. and Buran I. (1976) Experimental live tick-borne encephalitis vaccine (Langat E5"14" virus clone): volunteers 1 and 2 years after single-dose immunization. Acta virol., 20, 215-225). Стимулом к такому подходу стало выделение из клещей вируса в Малайзии, а именно вируса Лангата (LGT), штамм TP21, который, как казалось, не ассоциировался с заболеванием человека в естественных условиях (Gordon Smith С.E. (1956) A virus resembling Russian spring-summer encephalitis virus from an Ixodid in Malaya. Nature (London) 178, 581-582). Иммунизация животных и людей-добровольцев с помощью LGT вызывала высокий уровень нейтрализующих вирус антител к различным членам комплекса ВКЭ, таким как вирус Повассана, вирус болезни Кьясанурского леса и ВКЭ (Price W.Н., Thind I.S., Teasdall R.D. and o'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. W.H.O. 42, 89-94; Price H.W. and Thind I.S. (1973) Immunization of mice against Russian spring-summer virus complex and monkeys against Powas-san virus with attenuated Langat E5 vims. Am. J. Trop.Med. Hyg. 22, 100-108). Тем не менее, ТР21 проявлял нейровирулентность и нейроинвазивность ("периферийную вирулентность") при тестировании на мышах, и потому считался слишком опасным для использования в качестве вакцины-кандидата (Gordon Smith С.Е. (1956) A virus resembling Russian spring-summer encephalitis virus from an Ixodid in Malaya. Nature (London) 178, 581-582; Thind I.S. and Price W.H. (1966a) A chick embryo attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. I. Virulence of the virus for mice and monkeys. Am. J. Epidemiol., 84, 193-213; Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-bome flavivirus dengue-type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1746-1751). Несмотря на прямую нейровирулентность, измеренную посредством внутрицеребральной инокуляции, наблюдавшуюся для вируса Лангата TP21, его периферийная вирулентность (нейроинвазивность) была значительно меньше, чем у очень вирулентных дальневосточных штаммов ВКЭ, который приводит к заболеваемости у людей со смертностью от 20% до 30%. Несколько штаммов LGT, частично ослабленных для мышей и обезьян, были изолированы и изучались в США, России и Чехословакии (Nathanson N., Thind I.S., О'Leary W. and Price W.H. (1968) Histological studies of the monkey neurovirulence of group В arboviruses. IV. Evaluation of an attenuated strain (E5) of Langat virus. Am. J. Epidemiol. 88,103-112; Price W.H., Thind I.S., Teasdall R.D. and o'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) vims complex with attenuated Langat E5 vims. Bull. W.H.O. 42, 89-94; Mayer V., Orolin D., Pogady J., Starek M, Kubistova K., Gajdo-Sova E. and Buran I. (1976) Experimental live tick-borne encephalitis vaccine (Langat E5"14" virus clone): volunteers 1 and 2 years after single-dose immunization. Acta virol, 20, 215-225; Smorodincev A.A. arid Dubov A.V. (1986) Live vaccines against tick-borne encephalitis. In "Tick-Borne Encephalitis and Its Vaccine Prophylaxis", (A.A.Smorodincev, ed.), pp.190-211. Meditsina, Leningrad). Один из таких штаммов, называемый штаммом Еланцева, активно изучался на более чем 600 000 вакцин в России в качестве экспериментальной живой вакцины против ВКЭ в начале 1970-х годов (Smorodincev A.A. and Dubov A.V. (1986) Live vaccines against tick-borne encephalitis. In "Tick-Borne Encephalitis and Its Vaccine Prophylaxis", (A.A.Smorodincev, ed.), pp.190-211. Meditsina, Leningrad). Исследования были прекращены, когда стало понятно, что вакцинация была связана с очень низкой частотностью энцефалита, приблизительно один случай на 20000 иммунизации. Тем не менее этот опыт подтвердил первоначальную точку зрения, что LGT является сильно ослабленным и явно наиболее неопасным членом клещевого флавивирусного комплекса.

Вскоре после этого более ослабленный мутант LGT, названный штаммом E5, был отобран путем 42 переносов в эмбрионных куриных яйцах. LGT E5 проявляет меньшую вирулентность для мышей и обезьян, чем его ТР21-родитель. Позже исследование продемонстрировало, что E5 проявляет меньшую нейровирулентность у мышей, чем его ТР21-родитель (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue-type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1746-1751). Также в отличие от своего ТР21-родителя Е5 проявлял очень малую нейроинвазивность, и она обнаруживалась только у малой части мышей, инокулированных периферийно с помощью наибольшего возможного количества вируса. Перед тем как рассматривать этот более ослабленный Е5-мутант LGT в качестве потенциального кандидата на использование при профилактике тяжелого заболевания человека, вызываемого определенными членами группы клещевых флавивирусов, в интересах безопасности ученые должны снизить или устранить последние следы вирулентности LGT TP21 и Е5 для мышей посредством стратегии, которая успешно использовалась в прошлом для ослабления вируса Денге, а именно внесения сайто-специфических мутаций в инфекционную полномерную кДНК вируса. Таким образом, существует потребность в клонах полномерной кДНК вируса Лангата.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Конструирование полномерной кДНК генома LGT TP21. (А). Сборка полномерной кДНК TP21 в плазмиде выполнялась с помощью сегментов кДНК, которые клонировались, а их последовательности определялись, как описано ранее (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue-type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1746-1751) или выделялись длинной ПЦР. (Б). Конструирование полномерной кДНК единственной длинной ПЦР. (В). Сборка полномерной кДНК из двух сегментов кДНК генома, которые выделялись из низкотитрированного вирусного препарата (3,8х10³ БОЕ/мл). Положения сайтов расщепления NotI, Kpnl, Apal, Nsil, и EcoRV в кДНК показаны на А и В пунктирными линиями. Сплошные линии показывают фрагменты кДНК ПЦР или клонированные фрагменты генома TP21. Короткие горизонтальные стрелки указывают положение промотера SP6 или положение праймера; вертикальная сплошная стрелка указывает последующие шаги в стратегии клонирования. Числа на концах фрагментов кДНК LGT представляют положения первого и последнего нуклеотидов генома соответственно. НТ-нумерация выделена из результатов ОТ-ПЦР-последовательности генома ТР21 (Таблица 1). Замечание: Соединение фрагментов BgIII и BamHI в плазмиде р51 или р624-3 устранило сайты расщепления BgIII и BamHI.

Фиг.2. Анализ ПЦР-усиленной кДНК из генома ТР21 с помощью гелевого электрофореза с 0,7% агарозы. ОТ-ПЦР-продукты синтезировались с помощью РНК вируса ТР231, который изолировался из низкотитрированного вируса (дорожка 1; титр 3,8×10³ БОЕ/мл на клетках Веро) или высокотитрированного вируса (дорожка 2, титр 2,4×10⁹ БОЕ/мл на той же клеточной линии). ПЦР выполнялась с помощью олиго 1444 и 1445 в качестве праймеров при условиях, описанных в Примерах, и 10 л реакционной смеси загружались на гель. Фрагменты длиной приблизительно 11 кб (полоса А) представляют завершенную или почти завершенную полномерную геномную кДНК. Она изолировалась из геля и использовалась для транскрипции РНК, которые затем использовались для трансфецирования клеток Веро в культуре. Последовательность более коротких фрагментов длиной приблизительно 4 кб (полоса Б) определялась после извлечения из геля. Маркеры молекулярного веса показаны на дорожке М. Ближайший к вершине маркер соответствует 11 кб.

Фиг.3. Тест на нейроинвазивность двух инфекционных производных от кДНК клонов LGT TP21 на мышах SCID. Сравнение смертности после внутрибрюшинной (ВБ) инокуляции 10² БОЕ клона 636 или 656 со смертностью от неклонированного родительского вируса TP21 и его более ослабленного производного Е5. Ранее описанные химеры TP21/DEN4 и E5/DEN4, инфекционные для нормальных мышей, служили в качестве контроля, который был полностью ослаблен для мышей SCID. С этой целью химеры инокулировались ВБ с большей дозой (то есть 10⁵ БОЕ).

Фиг.4. Конструирование полномерной кДНК генома LGT E5. (А). Сборка полномерной кДНК E5 в плазмиде выполнялась с помощью рТР21-636, который клонировался, а последовательность определялась, как описано ранее, и SfiI(133)-AgeI(9737)-фрагмента, который выделялся путем длинной ПЦР. (Б). Конструкция и положение делеций в 3'-NCR генома E5. Положение сайта расщепления NotI, SfiI, AgeI, AfIII, Kpnl и EcoRV в кДНК показано на (А) и (Б) пунктирными линиями. Сплошные линии показывают фрагменты кДНК ПЦР, производные от генома E5. Короткие горизонтальные стрелки указывают положение промотера SP6 или положение праймера; сплошные вертикальные стрелки указывают последующие шаги в стратегии клонирования. Числа на концах фрагментов кДНК LGT представляют положения первого и последнего нуклеотидов генома соответственно. Нумерация нуклеотидов (нт) ведется по результатам ОТ-ПЦР-последовательности генома E5 (номер доступа GenBank AF253420). Показано положение введенной делеций в 3'-NCR, простирающейся от нт 10379 до положения, указанного над заштрихованными прямоугольниками.

Фиг.5. Последовательность 3'-NCR-соединений делеционных мутантных геномов кДНК. Жирными буквами отмечена нуклеотидная последовательность LGT E5. Сайт расщепления AflII, который использовался для вырабатывания делеций, и кодон ТАА-стоп указаны подчеркиванием. Показаны размер делеций, ее положение и соответствующий плазмидный конструкт.

Фиг.6. Анализ роста родительского E5 и его рекомбинантых производных вирусов в клетках LLCMK₂ (а) обезьяны и в клетках Веро (б). Клетки были инфицированы указанным вирусом при MOI 0,01 с последующей адсорбцией вируса в течение 1 часа, инокулят удалялся и добавлялась свежая среда. Вирус в культурной среде собирался в указанные моменты времени, и его титр определялся путем фокус-формирующего теста на соответствующих клетках, как описано в Примерах.

Краткое описание таблиц

Таблица 1. Различия между геномными последовательностями штаммов LGT ТР21 и Е5, определенные путем анализа последовательности фрагментов вирусного генома, изначально клонированного в Е. coli или тестированного непосредственно после выделения посредством ОТ-ПЦР.

Таблица 2. Вариация последовательности, появившаяся в ходе извлечения инфекционного LGT TP21 из кДНК плазмида.

Таблица 3. Нейроинвазивность родительских штаммов LGT и производных из кДНК вирусных клонов LGT TP21 для взрослых швейцарских мышей.

Таблица А. Мутации, полученные при адаптировании восстановленных в клетках москита химер TP21/DEN4 и E5/DEN4 к эффективному росту в обезьяньих клетках Веро.

Таблица Б. Нейроинвазивность выросших в клетках Веро химер LGT/DEN4, использовавшихся для иммунизации.

Таблица В. Внутрибрюшинная (ВБ) иммунизация разведенных родственным спариванием мышей с помощью низкой дозы химеры Лангата TP21/DEN4(vac) защищает от последующего проверочного ВБ заражения с помощью сильно вирулентного штамма Абсеттарова ВКЭ.

Таблица Г. Внутрибрюшинная (ВБ) иммунизация швейцарских мышей с помощью химер Лангата (LGT)/DEN4 защищает от последующего проверочного ВБ заражения с помощью сильно вирулентного штамма Софьина ВКЭ.

Таблица I. Изменения в согласованной последовательности Е5, появившиеся в ходе клонирования, изъятия Е5 из полномерной кДНК и переноса в обезьяньи клетки Веро или в клеточную культуру фибробластов эмбриона цыпленка (ФЭЦ).

Таблица II. Родословная и снижение нейроинвазивности вируса Лангата (LGT) в ходе переноса в яйца и последующего восстановления из полномерной кДНК и делеции нт320 из ее 3'-некодирующего участка.

Таблица III. Некодирующие или кодирующие изменения в вирусе, восстановленном из мозга умирающих мышей через 14 или 28 дней после ВБ инокуляции с помощью Е5 или рекомбинантного производного из кДНК Е5 (клон Е5-651 или клон Е5-3'-320).

Таблица IV. Реакция на антитела и защитная эффективность штаммов вируса LGT для швейцарских мышей.

Сущность изобретения

Инфекционные клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата, отличные от их родителя в плане периферической нейровирулентности.

Штамм клещевого флавивируса Лангата ТР21 (LGT TP21), полученный из клещей, является естественным образом ослабленным для людей, но сохраняет показательную нейровирулентность и периферическую вирулентность ("нейроинвазивность") для мышей. Ранее из LGT TP21 был выделен менее вирулентный для мышей мутантный штамм Е5. Многочисленные попытки приготовить инфекционную полномерную кДНК ТР21 из фрагментов кДНК, клонированных в Е. coli, были одинаково безуспешными. Более информативная последовательность, чем последовательность, полученная из этих клонированных фрагментов кДНК и подобных фрагментов кДНК Е5, была выделена из фрагментов ОТ-ПЦР, которые не были клонированы в Е. coli. Сравнение ОТ-ПЦР-согласованной последовательности ТР21 и Е5 выявило только 7 аминокислотных различий, которые могут отвечать за наблюдаемое различие в вирулентности данных штаммов для мышей. Одиннадцать независимых инфекционных клонов кДНК ТР21 восстанавливались с помощью двух перекрывающихся длинных ОТ-ПЦР-фрагментов. Важно, что низкотитрированный вирус, используемый для приготовления кДНК в качестве шаблона для ПЦР, был собран на ранней стадии цикла роста для минимизации частоты делеционных мутантов, которые накапливаются на поздних стадиях инфекции. 4 проанализированных изъятых клона проявили клон-специфическое минимальное расхождение от согласованной последовательности, но это ограниченное варьирование было связано с уменьшенной периферической вирулентностью для иммунокомпетентных мышей: Генетическое манипулирование этими клонами упростит ослабление вирулентности LGT и ускорит разработку безопасной и эффективной вакцины против клещевого флавивируса, которая защитит от вирусов сильно вирулентного вирусного комплекса клещевого энцефалита.

Химерические вирусы Лангата/Денге защищают мышей от гетерологического контрольного заражения сильно вирулентными штаммами вируса клещевого энцефалита.

Вирус Лангата (LGT), клещевой флавивирус, является естественным образом ослабленным для людей, но он очень вирулентен для мышей SCID.

Напротив, жизнеспособные рекомбинантные химеры LGT (гены preM и Е) и вирус Денге типа 4 (все остальные последовательности), восстановленные в клеточной культуре москита, были полностью ослаблены для мышей SCID, но все равно способны обеспечивать защиту от LGT. Для преобразования этих химер в кандидаты в вакцины мы адаптировали их для эффективной репликации в обезьяньих клетках Веро, удовлетворительном субстрате для человеческих вакцин. Адаптированные химеры оставались полностью ослабленными для мышей SCID и, что важно, обеспечивали защиту иммунокомпетентных мышей от вируса клещевого энцефалита, наиболее вирулентного из клещевых флавивирусов.

Инфекционный клон кДНК ослабленного клещевого флавивируса Лангата (штамм Е5) и сконструированный из него 3'-делеционный мутант проявляют уменьшенную нейроинвазивность для иммунодефицитных мышей (SCID).

Сорок пять лет назад естественным образом ослабленный клещевой флавивирус Лангата (LGT), штамм ТР21, восстанавливался из клещей в Малайзии. После этого он тестировался в качестве живой ослабленной вакцины для вирулентных вирусов клещевого энцефалита. В масштабном клиническом исследовании его ослабленность была подтверждена, но были свидетельства низкого уровня остаточной вирулентности. Тридцать пять лет назад было достигнуто дополнительное ослабление LGT TP21 путем множественных переносов в яйца для получения мутантного Е5. Для изучения генетических детерминантов дополнительного ослабления, проявленного Е5, и для получения возможности манипулировать геномом данного вируса в целях разработки удовлетворительной живой ослабленной клещевой флавивирусной вакцины мы восстановили инфекционный вирус Е5 из клона полномерной кДНК. Рекомбинантный вирус Е5 (клон 651), восстановленный из инфекционного клона полномерной кДНК, был более ослабленным для иммунодефицитных мышей, чем его биологически полученный родитель Е5. Увеличение ослабленности было связано с тремя аминокислотными замещениями, два из которых расположены в структурном белке Е, а одно - в неструктурном белке NS4B. После этого еще большая степень ослабленности была достигнута путем создания жизнеспособной делеции нуклеотида 320 в 3'-некодирующем участке инфекционной полномерной кДНК Е5. Этот делеционный мутант не был цитопатическим в обезьяньих клетках Веро и реплицировался в более низкий титр, чем его родитель Е5-651. Вдобавок, 3'-делеционный мутант Е5 был менее нейроинвазионным для мышей SCID, чем его родитель Е5-651. Важно, что было доказано, что делеционный мутант в 119750 раз менее нейроинвазионен для мышей SCID, чем его предок, LGT штамм TP21. Несмотря на сильный уровень ослабленности, 3'-делеционный мутант Е5 оставался сильно иммуногенным, и ВБ инокуляция 10 БОЕ вызывала полную защиту швейцарских мышей при последующем контрольном заражении с помощью 2000 ВБ LD₅₀ естественного LGT TP21.

Подробное описание изобретения

Инфекционные клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата, отличные от своего родителя по периферической нейровирулентности.

Согласованные последовательности генома TP21 и Е5. Полная нуклеотидная последовательность генома некультивированного вируса LGT (штамм TP21) и его более ослабленного производного, штамма Е5, восстановленных после множественных переносов в ткань эмбриона цыпленка, определялась ранее из фрагментов кДНК, клонированных в Е. coli (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Первоначальные попытки приготовить инфекционные клоны полномерной кДНК LGT TP21 из этих фрагментов кДНК, производных из РНК высокотитрированной вирусной суспензии TP21, были одинаково безуспешными (Фиг.1, часть А). Двенадцать стабильных отдельных полномерных кДНК были собраны в плазмидах, но РНК, транскрибированные из этих клонов кДНК, не являлись инфекционными для культуры обезьяньих клеток Веро или клеточной культуры LLCMK₂ по неизвестным в то время причинам. Возможно, это являлось результатом спонтанных мутаций в геноме LGT, которые происходили в ходе амплификации вируса в клетках Веро или в ходе амплификации клонов полномерной кДНК в бактериальном векторе.

По этой причине было решено заново исследовать последовательность генома LGT путем прямого определения последовательности ОТ-ПЦР-фрагментов кДНК без предварительного клонирования в бактериях. Четыре перекрывающихся фрагмента кДНК, представляющие полномерный геном вируса TP21 или Е5, были получены с помощью высокоточной ПЦР, и определялась последовательность этих перерывающихся фрагментов. Последовательность каждого вируса была определена дважды, один раз с помощью фрагментов, которые были выделены из вирусной суспензии с титром 3,8×10³ БОЕ/мл (TP21) или 1,2×10⁴ БОЕ/мл (Е5), и один раз с помощью фрагментов, которые были выделены из вирусной суспензии, которая была собрана на один день позже с титром 2,2×10⁶ БОЕ/мл (TP21) или 4,0×10⁶ БОЕ/мл (Е5). Было обнаружено, что согласованные последовательности геномов обоих штаммов LGT отличаются от ранее опубликованных последовательностей, определенных по фрагментам кДНК, клонированным в Е. coli (Таблица 1). И геном ТР21, и геном Е5 имели длину 10943 нуклеотида (нт) и содержали 5'-некодирующий участок в 130 нт и 3'-некодирующий участок в 568 нт.Последовательность 5'-терминалов обоих штаммов LGT была идентичной. То же самое относится к 3'-терминалам. Предполагалось, что согласованные последовательности ТР21 и Е5, выделенные путем ОТ-ПЦР, являются более информативными для идентификации штамм-специфических мутаций, которые могут отвечать за различия биологических характеристик, чем последовательности, выделенные из фрагментов ДНК, клонированных в Е. coli.

Существует 12 нуклеотидных отличий в согласованной последовательности двух штаммов LGT (TP21 и Е5), из которых 7 дают аминокислотное замещение в оболочечном структурном белке Е или неструктурном белке NS3 или NS5 (Таблица 1). Среди семи аминокислотных изменений в согласованной последовательности ОТ-ПЦР ТР21 и Е5 четыре аминокислотных отличия (Asn₃₈₉ - Asp в Е, Asn₂₂ - Ser, Phe₂₄₈ - Туr и Phe₃₁₇ - Leu в NS3) также наблюдались ранее, когда фрагменты кДНК TP21 и Е5 были клонированы в Е. coli (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavi virus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Три дополнительных аминокислотных замещения (Phe₁₁₉ - Val в белке Е и Ser₄₂₂ - Thr и Arg₅₄₂ - Lys в белке NS5) были идентифицированы в согласованной последовательности, определенной по ОТ-ПЦР-фрагментам TP21 и Е5. Шесть других аминокислотных различий, которые ранее были обнаружены в последовательности клонированных фрагментов TP21 и Е5 (Pletnev, A. G. and Men, R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751), не были найдены в согласованных последовательностях ОТ-ПЦР. Несколько большая вариативность, наблюдавшаяся для клонированной кДНК, вероятно, отражает бактериальный отбор в процессе клонирования и/или гетерогенность последовательности в вирусных РНК, которые использовались для клонирования кДНК в Е. coli.

Инфекционная полномерная кДНК ТР21. Не придя к успеху в сборке инфекционных кДНК генома ТР21 в бактериях (фиг.1, часть А), мы попытались обойти трудности, связанные с клонированным кДНК в бактериальном векторе, посредством приготовления инфекционной полномерной кДНК с помощью длинной ПЦР. Мы также исследовали возможность того, что спонтанные мутации в геноме LGT могут быть большими для вируса, достигшего высокого титра в ходе расширенного роста в клеточной культуре. Полномерная кДНК вируса ТР21 была получена (фиг.1, часть Б и фиг.2), когда была выполнена высокоточная ПЦР с помощью положительно-чувствительного праймера, содержащего промотер SР6-полимеразы непосредственно над первыми 22 нуклеотидами последовательности LGT, и отрицательно-чувствительного праймера, который был комплементарен для нуклеотидов 10921-10943 3'-терминала LGT. Последний праймер содержал сайт расщепления EcoRV непосредственно после последовательности 3'-конца. Как показано на фиг.2, доминантный продукт ПЦР 1А (дорожка 1, полоса А), выделенный из низкотитрированного вируса (3,8×10³ БОЕ/мл), имел длину приблизительно 11 кб. Напротив, продукт ПЦР 2А (дорожка 2, полоса А), выделенный из высокотитрированного вируса (2,4×10⁹ БОЕ/мл), содержал очень мало полномерной кДНК, в то время как главный продукт был значительно короче, приблизительно 4 кб (дорожка 2, полоса Б). Анализ последовательности показал, что этот фрагмент (дорожка 1 или 2, полоса Б) представлял усеченный геном LGT на протяжении от нт 1 до нт 3779, который был присоединен к последним 23 нуклеотидам 3'-конца генома, присутствующего в отрицательно-чувствительном праймере (олиго 1445), который использовался для ОТ и ПЦР. Следует отметить, что последние семь нуклеотидов на 3'-конце олиго 1445 также были комплементарны для последовательности генома LGT в нуклеотидных позициях 3780-3786. Возможно, более короткие продукты (дорожка 1 или 2, полоса Б) были получены путем связывания праймера с данным альтернативным сайтом на вирусном геноме во время амплификации посредством ОТ-ПЦР, а не с измененной последовательностью 3'-терминала, с выбором по высокой множественности переноса.

Фрагменты кДНК ОТ-ПЦР приблизительно полной длины (полоса А, дорожка 1 или 2; фиг.2) расщеплялись с помощью EcoRV, и транскрипты РНК из этих шаблонов тестировались на инфекционность в клетках Веро. Свидетельства инфекции в клетках Веро были обнаружены с помощью иммунофлюоресцентного теста (ИФТ) на 12 день с помощью специфических для LGT антител. В этот момент 80-90% клеток, трансфецированных РНК из ПЦР-продукта 1А, были положительными, в то время как только несколько ИФТ-положительных клеток наблюдалось при использовании транскриптов РНК из ПЦР-продукта 2А. Это показывает, что инфекционная кДНК восстанавливалась наиболее эффективно, если в качестве источника полномерной кДНК генома использовалась низкотитрированная вирусная суспензия. Это, вероятно, отражает изменение в геноме вирусной РНК, которое появляется с большей частотой во время более длительного периода вирусной репликации, требуемой для достижения высокого титра. По этой причине вирусная РНК из низкотитрированной вирусной суспензии ТР21, собранная через два дня после инфицирования, использовалась для конструирования полномерной кДНК ТР21.

Восстановление вирусов LGT из клонированной кДНК и их характеризация. Два перекрывающихся фрагмента кДНК (фиг.1, часть В) были приготовлены посредством длинной ПЦР с помощью ОТ-продукта, выделенного из РНК низкотитрированного вирусного материала ТР21 (3,8×10³ БОЕ/мл). ПЦР-продукт (приблизительно 6,1 кб), представляющий 3'-участок генома, был клонирован в бактериальном векторе р5'-2 (NotI, XhoI, AHindIII) в два шага, как описано в Примерах и проиллюстрировано на фиг.1 (часть В). Результирующий клон р624-3, содержавший нуклеотиды LGT от 4539 до конца генома, был выбран на основе ограниченного ферментного анализа. После этого оставшаяся 5'-последовательность генома ТР21 (приблизительно 4,8 кб) вместе с промотером SP6, присутствующим на 5'-конце непосредственно над последовательностью LGT, была выработана путем длинной ПЦР и лигирована в NotI и ApaI-расщепленный плазмид р624-3. Клонирование данного конструкта в Е.coli дало двадцать восемь стабильных клонов полномерной кДНК LGT TP21. Однако наблюдался некоторый полиморфизм среди стабильных полномерных кДНК LGT по отношению к схеме расщепления рестриктного фермента. Последовательность из четырех плазмидов (рТР21-636, рТР21-649, рТР21-656 и рТР21-689) была проанализирована, и было обнаружено, что она очень близко соответствует согласованной последовательности ТР21.

Перед получением избыточных транскриптов шаблон плазмидной ДНК был линеаризован в сайте расщепления EcoRV, который представлен тремя нуклеотидами ниже 3'-конца последовательности LGT TP21. Вследствие этого РНК-транскрипты содержали три дополнительных нуклеотида GAU на 3'-терминале, а также дополнительный остаток G на 5'-терминале. Полномерная РНК, выработанная SР6-полимеразой из 28 различных плазмидов, была протестирована на инфекционность путем трансфецирования в клетки ВНК хомяка или в обезьяньи клетки Веро или в клетки LLCMK₂. Одиннадцать отдельных клонов кДНК LGT TP21 были инфекционными. Свидетельства вирусной инфекции были обнаружены путем ИФТ с помощью LGT-специфической гипериммунной мышиной асцитической жидкости (ГМАЖ) в 80-100% трансфецированных клеток в день 5. Дополнительные свидетельства того, что восстановленные вирусы являлись LGT, были получены путем сравнения LGT-специфических белков, которые вырабатывались родительским кДНК-вирусом TP21 или его кДНК-вирусом-предком в инфицированных клетках ВНК, Веро или LLCMK₂, что было продемонстрировано тестом иммунопреципитации с помощью LGT-специфической ГМАЖ или моноклональных антител. Специфические инфекционности РНК-транскриптов, которые были выделены из трех различных клонов кДНК, находились в диапазоне от 8×10³ до 2×10⁵ БОЕ/мкг.Это было значительно ниже, чем инфекционность РНК вириона TP21, которая составляла 4×10⁶ БОЕ/мкг при измерении на клетках Веро при таких же экспериментальных условиях. Штамм-препараты изъятых клонов TP21 были получены путем переноса вируса в клетках Веро и сбора всплывшей среды инфицированных культур. Вирусный титр четырех изъятых клонов TP21: ТР21-636, ТР21-649, ТР21-656 и ТР21-689 (обозначаемых 636, 649, 656 и 689), измеренный посредством бляшкового теста на клетках LLCMK₂, варьировался от 1,2×10⁷ до 2,4×10⁸ БОЕ/мл через 7 дней после инфицирования.

Изъятые производные от кДНК клоны LGT давали характеристические бляшки LGT TP21 диаметром 3,5 мм на клетках LLCMK₂ через 7 дней после инфицирования, кроме вируса 649, который давал маленькие бляшки со средним диаметром 0,8 мм. Репликация вируса была дополнительно проанализирована путем отслеживания вирусного титра на 0,1, 2, 3, 4 и 5 день после инфицирования клеток Веро. Не наблюдалось значительных различий между ростом восстановленных клонов LGT и их родительского вируса.

Анализ нуклеотидной последовательности восстановленных вирусов. Четыре вируса, восстановленные из трансфекции клеток Веро (то есть клоны 636, 649, 656 и 689) были амплифицированы путем дополнительного переноса в клетках Веро, и РНК вириона использовалась для ОТ-ПЦР. Последующее определение последовательности полного генома изъятого вируса выполнялось с помощью четырех перекрывающихся ПЦР-фрагментов без предварительного клонирования в Е. coli. Мутации в таких РНК-вирусах, как LGT, могут аккумулироваться в процессе ОТ-ПЦР, бактериального клонирования генома кДНК и/или в процессе адаптации и распространения вируса в клеточной культуре. Чтобы лучше понять источник генетической вариативности вновь восстановленных вирусов LGT: (i) анализ последовательности 5'-половины генома (нуклеотиды 1-5300) для каждого изъятого вируса выполнялся дважды в независимых экспериментах, в которых был выращен вирус, вирусная РНК изолировалась и подвергалась ОТ-ПЦР; последовательность 3'-половины вирусного генома определялась подобным же образом, но только один раз; и (ii) также определялась нуклеотидная последовательность вирусной вставки в каждый из четырех плазмидов, из которых были выделены инфекционные РНК-транскрипты.

Анализ четырех выбранных инфекционных клонов ТР21 выявил шесть отличий аминокислотной последовательности от согласованной последовательности Е5, ранее определенной путем ОТ-ПЦР ее геномных фрагментов (Таблица 1). Эти отличия наблюдались в позициях: 119 и 389 в Е; 22, 248 и 317 в NS3 и 542 в NS5. Таким образом, четыре изъятых клона содержали согласованную последовательность ТР21 в 6 из 7 позиций, в которых ТР21 отличается от своего производного Е5. Каждый инфекционный клон содержал Thr в позиции 422 в NS5 подобно Е5, вместо остатка Ser в NS5 ТР21 (Таблица I).

Существовали три сохраненные нуклеотидные изменения, идентифицированные в 3'-половине генома каждого из данных четырех восстановленных вирусов, не показанные в Таблице 1. Во-первых, изменение А₁₀₄₃₆→G появлялось в 3'-некодирующем участке, а два остальных изменения были обнаружены в генах неструктурного белка NS3 (A₅₂₅₇→G) и NS5 (G₉₇₃₄→A), которые вызывали замещение Thr₂₅₄→Ala в белке NS3 и замещение Asp₆₉₁→Asn в белке NS5. Нуклеотидные остатки G₅₃₅₇, А₉₇₃₄ и G₁₀₄₃₆, присутствующие в геноме восстановленных вирусов, были найдены также в плазмидной ДНК, из которой был выделен каждый из этих вирусов, и в промежуточном конструкте, плазмиде р624-3. Это предполагает, что данные изменения появились в процессе клонирования в Е. coli и являлись преимущественными для амплификации плазмидов, содержащих LGT-последовательности, либо эти отличия могут отражать "квазивиды" вируса с положительной спиралью РНК. В поддержку последнего объяснения следует заметить, что нуклеотидная вариативность G/A в позиции 9734 или позиции 10436 наблюдалась в согласованной последовательности генома ОТ-ПЦР ТР21, выделенном из высокотитрированного вирусного материала.

Анализ последовательности показал также наличие нескольких дополнительных уникальных отличий от согласованной последовательности ТР21 в 5'-половине генома каждого из 4 изъятых клонов (Таблица 2). Четырнадцать из восемнадцати нуклеотидных отличий от согласованной последовательности ТР21 присутствовали также в плазмидной ДНК, из которой были выделены эти 4 клона. Это является свидетельством того, что клоны являются производными кДНК. Из всех наблюдавшихся 18 нуклеотидных отличий между согласованной последовательностью ТР21 и последовательностями четырех изъятых вирусных геномов 10 давали аминокислотное замещение в структурном белке preM или Е или в неструктурном белке NS2A или NS2B. По меньшей мере три нуклеотидных изменения (C₄₂₉₉→U в клонах 636 и 689; A₅₉₀→G и C₄₄₂₉→U в клоне 656, подчеркнуты в Таблице 2) появлялись в процессе РНК-транскрипции и трансфецирования клеток Веро или распространения вируса в клеточной культуре, поскольку эти мутации не были представлены в шаблонах плазмидной ДНК, из которых были выделены эти вирусы.

Клон 636 содержал три нуклеотидных отличия от согласованной последовательности ТР21, только два из которых приводили к аминокислотным замещениям. Замещение His₄₃₈ на Туr, расположенное около трансмембранного участка оболочечного белка Е, появлялось в позиции, которая является сильно защищенной среди москитных и клещевых флавивирусов (Pletnev A.G., Yamshchikov V.F. and Blinov V.М. (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virology 174, 250-263; Gritsun Т.S., Holmes E.C. and Gould E.A. (1995) Analysis of flavivirus envelope proteins reveals variable domains that reflect their antigenicity and may determine their pathogenesis. Virus Research 35, 307-321). Еще одно аминокислотное изменение Ala₃₂→Val в неструктурном белке NS2B было также представлено в значительной пропорции вирионов клона 689.

Клон 649 отличался от родительского вируса ТР21 в большей степени, нежели прочие вирусы, поскольку его вирусный геном содержал 7 нуклеотидных отличий (Таблица 2). Три из этих мутаций были скрытыми, в то время как остальные четыре вызывали аминокислотное замещение в белке NS2A или NS2B. Возможно, эти уникальные мутации отвечали за 4-кратное уменьшение размера бляшки клона 649 на клетках LLCMK₂ по сравнению с родительским ТР21 и другими изъятыми вирусами. Интересно, что клоны 649 и 689 имели три общих нуклеотидных изменения в позициях 2230, 3001 и 3599. Одна из этих мутаций вызывала замену Рго29 в N-терминальном участке белка NS2A на остаток Ser, который сохраняется среди вирусов комплекса ВКЭ (Pletnev A.G., Yamshchikov V.F. and Blinov V.М. (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis vims. Virology 174, 250-263).

Аминокислотное замещение в структурном белке preM (Met₃₈→Val) и Е (Asp₃₀₈→Ala), а также две скрытые мутации были выявлены в клоне 656. Поскольку трехмерная структура и функция N-терминальной части белка preM неизвестны, роль изменения Met₃₈→Val в белке preM трудно оценить. Замещение Asp→Ala в позиции 308 появлялось в домене III белка Е, который предположительно играет роль в нейровирулентности клещевых и москитных флавивирусов для мышей (78, 2711-2722). Ранее также отмечалось, что вирус болезни Лупинга, флавивирус комплекса ВКЭ, проявляет уменьшенную нейроинвазивность для мышей после одного аминокислотного замещения Asp→Asn в белке Е в позиции 308 (Jiang W.R., Lowe A., Higgs S., Reid H. and Gould E.A. (1993) Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence. J. Gen. Virol., 74, 931-935). Таким образом, клон 656 LGT может предлагать еще одну возможность исследования воздействия мутации (Asp→Ala) в позиции 308 в Е на нейроинвазивность для мышей.

Оценка кДНК-производных вирусов на мышах. Мыши использовались в качестве экспериментальной модели для сравнения восстановленных клонов LGT и их родительского вируса в отношении уровня нейроинвазивности, то есть способности вируса распространяться из периферийного сайта в центральную нервную систему и вызывать энцефалит. Сначала взрослые аутбридинговые швейцарские мыши инъецировались внутрибрюшинно (ВБ) с помощью 10⁴ или 10⁶ БОЕ каждого вируса, и записывалась смертность в течение 28 дней (Таблица 3). Ранее было показано, что некультивированный LGT штамм Т