Изолированная последовательность днк, кодирующая белок ehrlichia canis в 30-килодальтон, вектор, рекомбинантный белок и способ его получения, клетка-хозяин, антитело и способ ингибирования инфекции ehrlichia canis у субъекта

Изолированная последовательность днк, кодирующая белок ehrlichia canis в 30-килодальтон, вектор, рекомбинантный белок и способ его получения, клетка-хозяин, антитело и способ ингибирования инфекции ehrlichia canis у субъекта

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники изобретения

Данное изобретение относится главным образом к области молекулярной биологии. Точнее, данное изобретение имеет отношение к молекулярному клонированию и характеристике генов гомологичных белков Ehrlichia canis в 28-кДа, мультигенному локусу, кодирующему гомологичные белки Ehrlichia canis в 28-кДа, и их применению.

Описание родственной области

Эрлихиоз собак, также известный как тропическая пангемоцитопения собак, представляет собой переносящееся клещами риккетсионное заболевание собак, впервые описанное в Африке в 1935 году и Соединенных Штатах в 1963 году (Donatien and Lestoquard, 1935; Ewing, 1963). Заболевание стало лучше распознаваться после его эпизоотической вспышки, имевшей место среди американских военных собак во время войны во Вьетнаме (Walker et al., 1970).

Этиологическим агентом эрлихиоза собак является Ehrlichia canis, небольшая грамотрицательная, облигатная внутриклеточная бактерия, которая проявляет тропизм в отношении мононуклеарных фагоцитов (Nyindo et al., 1971) и переносится клещом коричневых собак, Rhipicephalus sanguineus (Groves et al., 1975). При развитии эрлихиоза собак возможно проявление трех форм - острой, бессимптомной и хронической. Острая форма характеризуется лихорадкой, анорексией, депрессией, лимфаденопатией и небольшой тромбоцитопенией (Troy and Forrester, 1990). Обычно после острой формы собаки выздоравливают, но остаются персистентно инфицированными носителями возбудителя без клинических признаков заболевания в течение месяцев и даже лет (Harrus et al., 1998). В некоторых случаях развивается хроническая форма, которая проявляется тромбоцитопенией, гиперглобулинемией, анорексией, истощением и кровотечением, в частности носовым кровотечением, с последующей смертью (Troy and Forrester, 1990).

Регуляция поверхностной антигенности может быть важным фактором механизма установления таких персистентных инфекций у хозяина. Хотя патогенез заболевания недостаточно выяснен, мультигенные семейства, описанные у представителей родственных родов Ehrlichia, Anasplasma и Cowadria, могут быть вовлечены в изменчивость экспрессии главного поверхностного антигена, что помогает, таким образом, избежать иммунного контроля. Anaplasma marginale, микроорганизм, близко родственный Е. canis, проявляет изменчивость генов основного поверхностного белка-3 (msp-3), что приводит к антигенному полиморфизму среди штаммов (Alleman et al., 1997).

Молекулярный таксономический анализ на основании гена рРНК 16S показал, что Е. canis и E.chaffeensis, этиологические возбудители моноцитарного эрлихиоза человека (НМЕ), являются близкородственными (Anderson et al., 1991; Anderson et al., 1992; Dawson et al., 1991; Chen et al., 1994). Описана значительная перекрестная реактивность антигенов 64, 47, 40, 30, 29 и 23-кДА между Е. canis и E.chaffeensis (Chen et al., 1994; Chen et al., 1997; Rikihisa et al., 1994; Rikihisa et al., 1992). Анализ иммунореактивных антигенов посредством иммуноблота с использованием сыворотки человека и собаки, взятой в период выздоровления, позволил идентифицировать многочисленные иммунодоминантные белки Е. canis, включая белок в 30-кДа (Chen et al., 1997). Кроме того, белок Е. canis в 30-кДа был описан как главный иммунодоминантный антиген, рано распознаваемый в иммунном ответе, который отличается по антигенным свойствам от белка Е. chaffeensis в 30-кДа (Rikihisa et al., 1992; Rikihisa et al., 1994). Также были идентифицированы другие иммунодоминантные белки Е. canis с молекулярными массами, колеблющимися от 20 до 30-кДа (Brouqui et al., 1992; Nyindo et al., 1991; Chen et al., 1994; Chen et al., 1997).

Гомологичные иммунодоминантные белки 28-32-кДа, кодируемые мультигенными семействами, были описаны у родственных микроорганизмов, включая Е. chaffeensis и Cowdria ruminantium (Sulsona et al., 1999; Ohashi et al., 1998a; Reddy et al., 1998). Недавно были описаны свойства 21-членного мультигенного семейства, кодирующего белки Е. chaffeensis в 23-28-кДа (Yu et al., 2000). Белки внешней мембраны E.chaffeensis в 28-кДа экспонированы на поверхности и содержат три основные гипервариабельные области (Ohashi et al., 1998a). Оказалось, что рекомбинантный Р28 E.chaffeensis обеспечивает защиту против введенной соответствующей инфекции у мышей, а антисыворотка, полученная против рекомбинантного белка, перекрестно реагирует с белком E.canis в 30-кДа (Ohashi et al., 1998a). Описано многообразие гена р28 среди изолятов E.chaffeensis (Yu et al., 1999a), а исследования с использованием моноклональных антител, кроме того, выявили многообразие в экспрессированных белках Р28 (Yu et al., 1993). Наоборот, описана полная консервативность генов р28 у географически различных изолятов E.canis, и высказано предположение, что в Северной Америке E.canis могут быть консервативными (McBride et al., 1999, 2000).

Предыдущий уровень исследований оказался несовершенным из-за отсутствия данных по клонированию и характеристике новых генов гомологичных иммунореактивных белков Ehrlichia canis в 28-кДа и единого мультигенного локуса, содержащего гены гомологичных белков 28-кДа. Кроме того, предыдущий уровень исследований является несовершенным из-за отсутствия рекомбинантных белков таких иммунореактивных генов Ehrlichia canis. Данное изобретение восполняет эту давнишнюю потребность в данной области.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Некоторые аспекты согласно изобретению связаны с описанием молекулярного клонирования, секвенирования, свойств и экспрессии генов гомологичных зрелых иммунореактивных белков Ehrlichia canis в 28-кДа (обозначеных р28-1, -2, -3, -5, -6, -7, -9) и идентификацией единого локуса (10677-пар оснований), содержащего девять генов белков Ehrlichia canis в 28-кДа (р28-1 - р28-9). Восемь генов р28 локализованы на одной цепи ДНК, а один ген р28 обнаружен на комплементарной цепи. Гомология нуклеиновых кислот среди девяти представителей генов р28 составляла 37-75%, а гомология аминокислотных последовательностей колебалась от 28 до 72%.

Один из аспектов согласно изобретению связан с последовательностями ДНК, кодирующими иммунореактивный белок Ehrlichia canis в 30-кДа. Предпочтительно, белок имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 2, 4, 6, 40, 42, 44, 46, а ген имеет последовательность нуклеиновых кислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43, 45, и является представителем полиморфного, многочисленного семейства генов. Обычно белок имеет N-концевую сигнальную последовательность, которая может отщепляться в результате посттрансляционного процессинга, что приводит к образованию зрелого белка 28-кДа. Кроме того, гены, кодирующие белки 28-кДа, предпочтительно находятся в одном мультигенном локусе, который имеет размер 10677 пар оснований и кодирует девять гомологичных белков Ehrlichia canis в 28-кДа.

В другом аспекте данное изобретение связано с экспрессирующим вектором, содержащим ген, кодирующий иммунореактивный белок Ehrlichia canis в 28-кДа, и способным экспрессировать ген, когда вектор вводят в клетку.

Еще в одном аспекте согласно изобретению представлен рекомбинантный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 2, 4, 6, 40, 42, 44 и 46. Предпочтительно, если аминокислотная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновых кислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43, 45. Предпочтительно, чтобы рекомбинантный белок содержал четыре вариабельные области, которые могли бы быть гидрофильными, антигенными и экспонированными на поверхности. Рекомбинантный белок может быть использован как антиген.

В другом аспекте согласно изобретению представлен способ получения рекомбинантного белка, включающий в себя стадии получения вектора, который содержит экспрессирующую область, содержащую последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 2, 4, 6, 40, 42, 44 и 46, прочно связанную с промотором; трансфекции вектора в клетку; и культивирования клетки в условиях, эффективных для экспрессии экспрессирующей области.

Изобретение также может быть описано в отдельных аспектах как способ ингибирования инфекции Ehrlichia canis у субъекта, включающий в себя стадии идентификации субъекта до воздействия Ehrlichia canis или субъекта, подозреваемого в том, что он подвергся воздействию Ehrlichia canis или инфицирован Ehrlichia canis; и введения композиции, содержащей антиген Ehrlichia canis в 28-кДа в количестве, эффективном для ингибирования инфекции Ehrlichia canis. Ингибирование можно осуществлять любыми способами, такими, например, как стимуляция гуморального или клеточного иммунных ответов субъекта, или посредством других способов, таких как ингибирование нормальной функции антигена 28-кДа или даже конкурирования с антигеном за взаимодействие с каким-либо агентом в организме субъекта.

Другие и дальнейшие аспекты, особенности и преимущества согласно изобретению станут очевидными из следующего описания предпочтительных аспектов изобретения, представленных с целью объяснения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для того чтобы основной предмет обсуждения, в котором проясняются вышеизложенные особенности, преимущества и цели изобретения, а также другие вопросы, был бы установлен и понят в деталях, более подробные описания изобретения, кратко суммированные выше, могут быть представлены посредством упоминаний определенных его аспектов, которые проиллюстрированы прилагаемыми чертежами. Эти чертежи составляют часть описания. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные аспекты изобретения и поэтому не предназначены для его ограничения.

На фиг.1 представлена последовательность нуклеиновых кислот (SEQ ID No. 1) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No. 2) гена р28-7, включая смежные 5' и 3' некодирующие последовательности. Инициирующий кодон ATG и терминирующий кодон ТАА отмечены жирным шрифтом, а 23-членная аминокислотная лидерная сигнальная последовательность подчеркнута.

На фиг.2 показан ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС экспрессированного рекомбинантного слитого с р28-7-тиоредоксином белка в 50 кДа (дорожка 1, стрелка) и контроля тиоредоксина 16-кДа (дорожка 2, стрелка) и соответствующий иммуноблот рекомбинантного слитого с р28-7-тиоредоксином белка, распознаваемого анти-Е. canis сывороткой собаки, полученной в период выздоровления (дорожка 3). Тиоредоксиновый контроль не детектировался антисывороткой Е. canis (не показано).

На фиг.3 представлен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка р28-7 (ЕCа28-1, SEQ ID No. 2), белка р28-5 (ЕCа28SA2, частичная последовательность, SEQ ID No. 7), белка р28-4 (ЕCа28SA1, SEQ ID No. 8), E.chaffeensis P28 (SEQ ID No.9), OMP-1 семейства E.chaffeensis (SEQ ID Nos: 10-14) и белка MAP-1 C.ruminantium (SEQ ID No. 15). Аминокислотная последовательность р28-7 представлена как консенсусная последовательность. Не представленные аминокислоты идентичны р28-7 и изображены точками. Дивергентные аминокислоты отмечены посредством соответствующей однобуквенной аббревиатуры. Промежутки, введенные для максимального выравнивания аминокислотных последовательностей, указаны в виде тире. Вариабельные области подчеркнуты и обозначены (VR1, VR2, VR3 и VR4). Стрелки указывают на предсказанный участок расщепления сигнальной пептидазой на сигнальном пептиде.

На фиг.4 схематически изображено филогенетическое родство р28-7 (ЕСа28-1), р28-5 (ЕСа28SA2, частичная последовательность), р28-4 (ЕСа28SA1) E.canis, представителей многочисленного семейства генов omp-1 E.chaffeensis, и белка map-1 C.rumanintium с помощью несбалансированной конструкции древа. Длина каждой пары ветвей отражает расстояние между аминокислотной последовательностью пар. Линейка дает возможность оценить расстояние между последовательностями.

На фиг.5 представлены данные блоттинг-анализа по Саузерну геномной ДНК E.canis, полностью расщепленной шестью индивидуальными рестрицирующими ферментами и гибридизованной с DIG-меченным зондом р28-7 (дорожки 2-7); DIG-меченные метчики молекулярных масс (дорожки 1 и 8).

На фиг.6 представлены данные сравнения предсказанных свойств белков р28-7 (ЕCа28-1, штамм Jake) E.canis и Р28 E.chaffeensis (штамм Arkansas). Поверхностная вероятность предсказывает поверхностные остатки посредством использования окна гексапептида. Поверхностным остатком является любой остаток с >2,0 нм² водной, доступной области поверхности. Гексапептид со значением больше 1 рассматривали как поверхностную область. Антигенный индекс предсказывает антигенные детерминанты. Области со значением выше нуля являются возможными антигенными детерминантами. Т-клеточный мотив определяет местоположение возможных Т-клеточных антигенных детерминант по мотиву из 5 аминокислот с 1 - глициновым или полярным остатком, 2 -гидрофобным остатком, 3 - гидрофобным остатком, 4 - гидрофобным или пролиновым остатком и 5 - полярным или глициновым остатком. Линейка указывает положение аминокислот.

На фиг.7-1 и 7-2 представлены последовательности нуклеиновых кислот и выведенные аминокислотные последовательности генов белков E.canis в 28-кДа: р28-5 (нуклеотид 1-849: SEQ ID No. 3; аминокислотная последовательность: SEQ ID No. 4) и р28-6 (нуклеотид 1195-2031: SEQ ID No. 5; аминокислотная последовательность: SEQ ID No. 6), включая межгенные некодирующие последовательности (NC2, нуклеотид 850-1194: SEQ ID No. 31). Инициирующий кодон ATG и терминирующие кодоны обозначены жирным шрифтом.

На фиг.8 представлено схематическое изображение локуса генов (5,592 Kb, содержащего пять генов) белков E.canis в 28-кДа, демонстрирующее генную ориентацию и межгенные некодирующие области (28NC1-4). Описаны гены белков 28-кДа, показанные в локусе 1 и 2 (затененные) (McBride et al., 1999; Reddy et al., 1998; Ohashi et al., 1998). Секвенирована полная последовательность р28-5 и последовательность нового гена белка 28-кДа, обозначенного р28-6. Некодирующими межгенными областями (28NC2-3) между р28-5, р28-6 и р28-7 завершено соединение ранее не связанных локусов 1 и 2.

На фиг.9 схематически изображено филогенетическое родство гена р28-4 (EСa28SA1), p28-5 (EСa28SA2), p28-6 (EСa28SA3), p28-7 (EСa28-1) и p28-8 (EСa28-2) белков E.canis в 28-кДа на основании аминокислотных последовательностей с использованием неуравновешенной конструкции древа. Длина каждой пары ветвей изображает расстояние между аминокислотными парами. Линейка измеряет расстояние между последовательностями.

На фиг.10 представлены данные сравнительного анализа межгенных некодирующих последовательностей нуклеиновых кислот (SEQ ID Nos 30-33) генов белков E.canis в 28-кДа. Не представленные нуклеиновые кислоты, обозначенные точками (.), идентичны некодирующей области 1 (28NC1). Дивергенция обозначена с помощью соответствующей однобуквенной аббревиатуры. Введенные для максимального выравнивания аминокислотных последовательностей промежутки указаны в виде тире (-). Выделены предполагаемые транскрипционные промоторные области (-10 и -35) и рибосомный связывающий участок (RBS).

На фиг.11 представлено схематическое изображение локуса (10677-пар оснований) девяти генов р28 E.canis, демонстрирующее геномную ориентацию и межгенные некодирующие области. Гены р28 (р28-1, 2, 3, 9) (незатененные) идентифицированы в примере 8. Затененные гены р28 были идентифицированы ранее и обозначены следующим образом: р28-4. р30а (Ohashi et al., 1998b) и ORF1 (Reddy et al., 1998); р28-5 и р28-6 (McBride, et al., 2000); p28-7, p28 (McBride et al., 1999) и р30 (Ohashi et al., 1998b); и р28-8, р30-1 (Ohashi et al., 1998b).

На фиг.12схематически изображено филогенетическое родство р28-1 - р28-9 E.canis на основании аминокислотных последовательностей. Длина каждой пары ветвей отражает расстояние между аминокислотными парами. Линейка измеряет процент расхождения между последовательностями.

На фиг.13представлены последовательность нуклеиновых кислот (SEQ ID No. 39) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No. 40) гена р28-1 E.canis.

На фиг.14представлены последовательность нуклеиновых кислот (SEQ ID No. 41) и выведенная (на ее основании) аминокислотная последовательность (SEQ ID No. 42) гена р28-2 E.canis.

На фиг.15представлены последовательность нуклеиновых кислот (SEQ ID No. 43) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No. 44) гена р28-3 E.canis.

На фиг.16представлены последовательность нуклеиновых кислот (SEQ ID No. 45) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No. 46) гена р28-9 E.canis.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении описаны клонирование, секвенирование и экспрессия гомологичных генов, кодирующих белок в 30-килодальтон (кДа) Ehrlichia canis. Также проведен сравнительный молекулярный анализ гомологичных генов семи изолятов Е. canis и мультигенного семейства omp-1 E.chaffeensis. Некоторые новые гены белка 28-кДа идентифицированы следующим образом:

Р28-7 (ЕСа28-1) имеет открытую рамку считывания из 834-пар оснований, кодирующую белок из 278 аминокислот (SEQ ID No. 2) с предсказанной молекулярной массой в 30,5-кДа. Идентифицирована N-концевая сигнальная последовательность, указывающая, что белок подвергается посттрансляционной модификации в зрелый белок в 27,7-кДа.

Р28-6 (ЕСа28SA3) имеет открытую рамку считывания из 840-пар оснований, кодирующую белок из 280 аминокислот (SEQ ID No. 6).

Используя PCR (ПЦР) для амплификации генов белков E.canis в 28-кДа, завершили определение последовательности ранее несеквенированной области р28-5 (ЕСа28SA2). При анализе последовательности р28-5 обнаружена открытая рамка считывания, 849 пар оснований, кодирующая белок из 283 аминокислот (SEQ ID No. 4).

ПЦР-амплификация с использованием праймеров, специфичных для межгенных некодирующих областей генов белков 28-кДа, приводила к определению первичной структуры областей, соединяющих два ранее отдельных локуса, и тем самым идентифицировали единый локус (5592-kb), содержащий пять генов (р28-4, -5, -6, -7 и -8) белков 28-кДа. Было предсказано, что пять белков 28-кДа имеют сигнальные пептиды, удаление которых приводит к образованию зрелых белков, и имеют аминокислотную гомологию, колеблющуюся от 51 до 72%. Анализ межгенных областей выявил гипотетические промоторные области для каждого гена, что позволяет предположить, что эти гены могут независимо и дифференциально экспрессироваться. Величина межгенных некодирующих областей (28NC1-4) колеблется от 299 до 355 пар оснований, а гомология составляет 48-71%.

Кроме того, были секвенированы ранее неизвестные области ДНК в обратном и прямом направлении вышеупомянутого локуса, из пяти последовательно расположенных генов р28, и идентифицированы р28-1, -2, -3 и -9. Следовательно, в данном изобретении идентифицирован локус из девяти генов р28 E.canis, охватывающий 10677 пар оснований.

Данное изобретение, среди прочего, нацелено на изучение генов гомологичных белков р28 у Ehrlichia canis, р28-1, -2, -3, -6, -7 и р28-9 и определение полной последовательности частично секвенированного ранее р28-5. Также открытием является мультигенный локус, кодирующий девять гомологичных белков 28-кДа внешней мембраны Ehrlichia canis. Восемь из генов р28 локализованы на одной цепи ДНК, а один ген р28 обнаружен на комплементарной цепи. Гомология нуклеиновых кислот среди представителей девяти генов р28 составляет от 37 до 75%, а аминокислотная гомология колеблется от 28 до 72%.

Согласно данному изобретению специалисты в данной области могут применять общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии и методы рекомбинантных ДНК. Такие методы описаны в литературе в полном объеме. См., например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide to Molecural Cloning" (1984).

В изобретении предусмотрено получение по существу чистой ДНК, кодирующей иммунореактивный белок 28-кДа Ehrlichia canis. Белок, кодированный ДНК согласно изобретению, может иметь по меньшей мере 80% идентичности последовательности (предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95%) с аминокислотами, приведенными в SEQ ID No. 2, 4, 6, 40, 42, 44 или 46. Более предпочтительно, когда ДНК содержит кодирующую последовательность нуклеотидов SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43, 45 или вырожденный вариант такой последовательности.

В данной области хорошо известно, что аминокислотная последовательность белка определяется нуклеотидной последовательностью ДНК, которая кодирует белок. Вследствие вырожденности генетического кода (то есть большинство аминокислот кодируется более чем одним триплетом (кодоном) отдельные аминокислоты или полипептид могут кодироваться различными нуклеотидными последовательностями. Таким образом, полинуклеотидные последовательности рассматриваемого изобретения также содержат упомянутые вырожденные последовательности, которые кодируют полипептид согласно изобретению или его фрагмент или вариант.

Данное изобретение также включает в себя по существу чистую ДНК, содержащую последовательность по меньшей мере из 15 последовательных нуклеотидов (предпочтительно из 20, более предпочтительно из 30, еще более предпочтительно из 50 и наиболее предпочтительно из всех) из области нуклеотидов, приведенных в SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43 или 45.

Под выражением «по существу чистая ДНК» подразумевают ДНК, которая не является частью среды, в которой ДНК естественно встречается, благодаря отделению (частичная или полная очистка) от некоторых или всех молекул такой среды или благодаря перестройке последовательностей, которые фланкируют названную ДНК. Поэтому термин включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которую вводят в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота; или ДНК, которая существует как отдельная молекула (например, кДНК или фрагмент геномной или кДНК, полученный в результате полимеразно-цепной реакции (PCR; ПЦР) или расщепляется рестриктирующими эндонуклеазами), не зависящая от других последовательностей. Термин также включает в себя рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность, например слитый белок. Также включенной в данное изобретение является рекомбинантная ДНК, которая заключает в себе часть нуклеотидов, приведенных в SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43 или 45, которая кодирует иммунореактивный белок Ehrlichia canis в 28-кДа.

ДНК должна иметь по меньшей мере 70% идентичности последовательности с кодирующей последовательностью нуклеотидов, представленных в SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43 или 45, предпочтительно по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%); и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности. Идентичность между двумя последовательностями является прямой функцией числа соответствующих или идентичных положений. Если положение субъединицы в обеих из двух последовательностей занято такой же мономерной субъединицей, например, если данное положение занято аденином в каждой из двух молекул ДНК, тогда они идентичны по данному положению. Например, если 7 положений в последовательности из 10 нуклеотидов по длине оказываются идентичными соответствующим положениям во второй 10-нуклеотидной последовательности, тогда две последовательности имеют 70% идентичности последовательности. Обычно длина сравниваемых последовательностей составляет по меньшей мере 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 60 нуклеотидов, более предпочтительно 75 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 100 нуклеотидов. Обычно идентичность последовательностей определяют, используя программное обеспечение - анализ последовательности (например, пакет программного обеспечения - анализ последовательности, Генетической компьютерной группы Биотехнологического центра Университета Висконсина, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705).

В данном изобретении также рассматривается вектор, содержащий кодирующую последовательность ДНК, которая содержит ген, кодирующий иммунореактивный белок 28-кДа Ehrlichia canis, и названный вектор способен реплицироваться у хозяина, который содержит в оперативном сцеплении: а) ориджин репликации; b) промотор; и с) последовательность ДНК, кодирующую названный белок. Предпочтительно, вектор согласно изобретению содержит часть последовательности ДНК, представленной в SEQ ID No. 1, 3, 5, 39, 41, 43 или 45.

«Вектор» может быть определен как реплицируемая конструкция нуклеиновых кислот, например плазмидная или вирусная нуклеиновая кислота. Можно использовать векторы, чтобы амплифицировать и/или экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую иммунореактивный белок 28-кДа Ehrlichia canis. Экспрессирующий вектор является реплицируемой конструкцией, в которой последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая полипептид, является прочно связанной с соответствующими контрольными последовательностями, способными эффективно экспрессировать полипептид в клетке. Потребность в таких контрольных последовательностях изменяется в зависимости от избранной клетки и выбранного способа трансформации. Обычно контрольные последовательности включают в себя транскрипционный промотор и/или энхансер, соответствующие рибосомные связывающие участки мРНК и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно применять для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих соответствующие транскрипционный и трансляционный контрольные сигналы. См., например, способы, описанные Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. Ген и его транскрипционные контрольные последовательности определены как прочно связанные, если транскрипционные контрольные последовательности эффективно контролируют транскрипцию гена. Не ограничиваясь этим, векторы согласно изобретению включают в себя плазмидные векторы и вирусные векторы. Предпочтительными вирусными векторами в данном изобретении являются векторы, происходящие из ретровирусов, аденовируса, адено-ассоциированного вируса, вируса SV40 или вирусов герпеса.

Вообще экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, которые способствуют эффективной транскрипции инсерционного фрагмента ДНК, используют в связи с хозяином. Используемый в описании термин «хозяин» предназначен для того, чтобы охватить не только прокариот, но также и эукариот, таких как дрожжи, растения и животные клетки. Рекомбинантную молекулу ДНК или ген, который кодирует иммунореактивный белок Ehrlichia canis в 28-кДа согласно изобретению, можно использовать, чтобы трансформировать хозяина, применяя любой из способов, обычно известных специалистам в данной области. Особо предпочтительным является применение вектора, содержащего кодирующую последовательность гена, кодирующего иммунореактивный белок 28-кДА Ehrlichia canis согласно изобретению для целей прокариотической трансформации.

Прокариотические хозяева могут включать в себя E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Эукариотические хозяева включают в себя дрожжи, такие как Pichia pastoris, клетки млекопитающих и клетки насекомых. Для достижения оптимального клеточного роста трансформированных хозяев можно ферментировать и культивировать способами, известными в данной области.

Используемый в описании термин «инженерная», или «рекомбинантная», клетка относится к клетке, в которую введен рекомбинантный ген, такой как ген, кодирующий антиген Ehrlichia canis. Поэтому инженерные клетки отличаются от естественно встречающихся клеток, которые не содержат рекомбинантно введенного гена. Таким образом, инженерными клетками являются клетки, содержащие ген или гены, введенные рукой человека. Рекомбинантно введенные гены или будут находиться в виде кДНК-гена, копии геномного гена, или будут включать гены, позиционно смежные с промотором, по природе не ассоциированным с особым введенным геном. Кроме того, рекомбинантный ген может быть интегрирован в геном хозяина или может быть помещен в вектор или в бактериальный геном, трансфицированный в клетку хозяина.

В данном изобретении также получены по существу чистые иммунореактивные белки 28-30 кДа E.canis, которые содержат аминокислотные последовательности, приведенные, например, в SEQ ID No. 2, 4, 6, 40, 42, 44 или 46.

Выражение «по существу чистый белок» означает белок, который был отделен по меньшей мере от нескольких из тех компонентов, которые сопутствуют ему по природе. Обычно белок считают по существу чистым, когда он оказывается по меньшей мере на 60% по массе свободным от белков и других природно встречающихся органических молекул, с которыми он естественно связан in vivo. Предпочтительно чистота препарата составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно 99% по массе. По существу чистый иммунореактивный белок 28-кДа Ehrlichia canis может быть получен, например, путем экстракции из природного источника; экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунореактивный белок 28-кДа Ehrlichia canis; или посредством химического синтеза белка. Чистоту можно определять любым подходящим способом, например методом колоночной хроматографии, такой как иммуноаффинная хроматография с использованием антител, специфичных в отношении иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis, электрофореза в полиакриламидном геле или анализа посредством ВЭЖХ. Белок является по существу свободным от естественно ассоциированных компонентов, если он отделен по меньшей мере от некоторых из тех примесей, которые сопутствуют ему в исходном состоянии. Таким образом, белок, который химически синтезирован или получен в клеточной системе, отличающейся от клетки, из которой он происходит по природе, будет, по определению, по существу свободным от его естественно ассоциированных компонентов. Соответственно, по существу чистые белки включают в себя эукариотические белки, синтезированные в E.coli, других прокариотах или любом другом организме, в котором они естественно не встречаются.

Кроме полноразмерных белков, в изобретении также рассматриваются фрагменты (например, антигенные фрагменты) иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis (SEQ ID No. 2, 4, 6, 40, 42, 44 или 46). Термин «фрагмент» относится к полипептиду, который обычно составляет по меньшей мере 10 остатков, чаще по меньшей мере 20 остатков и более предпочтительно 30 (например, 50) остатков по длине, но меньше полной интактной последовательности. Фрагменты иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis можно получать способами, известными специалистам в данной области, например, в результате ферментативного переваривания природно встречающегося или рекомбинантного иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis, с помощью методов рекомбинантной ДНК, используя экспрессирующий вектор, который кодирует определенный фрагмент иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis, или посредством химического синтеза. Способность предполагаемого фрагмента проявлять свойства иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis (например, связывание с антителом, специфическим в отношении иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis) можно оценивать способам, представленными в описании.

Очищенный иммунореактивный белок 28-кДа Ehrlichia canis или антигенный фрагмент иммунореактивного белка 28-кДа Ehrlichia canis может быть использован для образования новых антител или для тестирования существующих антител (например, как позитивные контроли в диагностическом исследовании), применяя стандартные протоколы, известные специалистам в данной области.

Как хорошо известно в данной области, данный полипептид может изменяться по его иммуногенности. Поэтому часто оказывается необходимым связать иммуноген (например, полипептид согласно изобретению) с носителем. Типичными и предпочтительными носителями являются гемоцианин моллюска (KLH) и сывороточный альбумин человека. Средства для соединения полипептида с белком-носителем хорошо известны в данной области и включают в себя глутаральдегид, сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида, карбодиимид и бис-биазотизированный бензидин. Также понятно, что пептид может быть соединен с белком генно-инженерными способами, которые хорошо известны в данной области.

Также в данной области хорошо известно, что иммуногенность в отношении определенного иммуногена может быть повышена путем применения неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Типичные и предпочтительные адъюванты включают в себя полный BCG, Detox, (RIBI, Immunochem Research Inc.) ISCOMS и адъювант - гидроокись алюминия (Superphos, Biosector).

В данное изобретение включены поликлональные антисыворотки, полученные, например, у кроликов при использовании иммунореактивного белка 28-кДА Ehrlichia canis или фрагмента иммунореактивного белка 28-кДА Ehrlichia canis в качестве иммуногена. Применяют стандартные протоколы для получения моноклональных и поликлональных антител, известные специалистам в данной области. Моноклональные антитела, полученные согласно упомянутому способу, следует проверить на их способность идентифицировать рекомбинантные клоны кДНК Ehrlichia canis и отличать их от известных клонов кДНК.

В изобретении рассматриваются не только интактные моноклональные антитела, но также и иммунологически активный фрагмент антител, например фрагмент Fab или (Fab)₂; инженерную молекулу одиночной цепи Fv; или химерную молекулу, например антитело, которое содержит связывающую специфичность одного антитела, например мышиной природы, и оставшиеся части другого антитела, например, человека.

В одном аспекте, антитело или его фрагмент может быть связано с токсином или с детектируемой меткой, например радиоактивной меткой, нерадиоактивной изотопной меткой, флуоресцентной меткой, хемилюминисцентной меткой, парамагнитной меткой, ферментной меткой или колориметрической меткой. Специалистам в данной области хорошо известны перечисленные метки и другие подходящие метки, которые можно применять в соответствии с данным изобретением. Связывание упомянутых меток с антителами или их фрагментами может быть осуществлено при использовании стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области.

Также предполагают, что фармацевтические композиции можно получать, используя новые белки согласно изобретению. В таком случае фармацевтическая композиция включает в себя новый активный препарат(ы) согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Субъект, являющийся обычным специалистом в данной области, сможет легко определить, без чрезмерных исследований, соответствующие дозировки и способы введения активного компонента согласно изобретению.

Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным частицам или композициям, которые не вызывают аллергическую или подобную неблагоприятную реакцию при введении субъекту. Препарат водной композиции, который содержит белок в качестве активного ингредиента, полностью изучен в данной области. Обычно, такие композиции получают в виде инъецируемой формы, или в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгированным.

Для композиции белок можно готовить в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя аддитивные соли кислот (образованные свободными аминогруппами белка) и соли, образованные неорганическими кислотами, например, такими как хлористоводородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и тому подобные. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, также можно получать с неорганическими основаниями, например, такими как гидроокиси натрия, калия, аммония, кальция или железа, и такими органическими основаниями, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и тому подобные.

При приготовлении композиции растворы следует вводить способом, совместимым с дозированным препаратом и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Препараты легко вводят в целый ряд дозированных форм, таких как инъецируемые растворы.

Например, для парентерального введения в водном растворе раствор должен быть соответственно забуферен, если необходимо, а жидкий разбавитель, прежде всего, сделан изотоническим с достаточным количеством соли и глюкозы. Такие специальные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи в свете согласно изобретению стерильные водные среды, которые можно применять, станут известными специалистам в данной области. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для подкожного введения либо ввести с помощью инфузии в предполагаемый участок (смотри, например, «Remington's Pharmaceutical Sciences» 15^th Edition, pages 1035-1038 и 1570-1580). Некоторые изменения доз неизбежно будут требоваться в зависимости от состояния субъекта, которого лечат.

В одном из аспектов данного изобретения пре