Способ создания изогенной линии по доминантному признаку семени у растений

Способ создания изогенной линии по доминантному признаку семени у растений

Реферат

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к селекции и генетике возделываемых растений, в частности подсолнечника.

Известен способ получения изогенных линий по доминантным признакам путем беккроссов, согласно которому перед каждым скрещиванием проводят выделение гетерозиготных генотипов беккроссных растений и чередуют после трех беккроссов два самоопыления, чтобы отобрать особи с передаваемым признаком в полевых условиях, используемых в дальнейшем насыщении (Бороевич С. Принципы и методы селекции растений. - М.: Колос, 1984, с.138-140).

Недостатком известного способа является длительный срок создания изогенных линий.

Известен способ получения изогенных линий по доминантным признакам на основе непрерывной схемы беккроссов, согласно которому беккроссируют без чередования с самоопылением, но с отбором гетерозиготных генотипов на каждом этапе беккроссирования (Система генетического изучения материала для селекции растений. - Методические указания. Л.: издательство ВНИИР, 1984, с.60-62). Этот способ позволяет сократить срок создания изогенных линий по отношению к вышеописанному способу на два поколения.

Недостатком известного способа также является длительный срок создания изогенных линий.

Известен также способ получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений на основе непрерывной схемы беккроссов и установления генотипа беккроссных растений (патент РФ № 2151494 от 27.06.2000 г.), согласно которому в каждом поколении беккросса берут недозрелые (12-14-дневные после оплодотворения) семянки, отделив их от соцветия, удаляют с каждой плодовую и семенную оболочки, разрезают на две части, по одной из них (части семядолей без зародыша) проводят биохимический анализ для установления генотипа беккроссных семянок, в частности по жирно-кислотному составу масла части семядолей, а другую часть семянки (семядоли с зародышем) помещают на питательную среду и держат их на этой среде 5-7 дней, т.е. до образования первой пары настоящих листьев и хорошо развитой корневой системы проростков. По результатам биохимического анализа выделяют гетерозиготные проростки и высаживают их в торфяные стаканчики с почвенной смесью, предварительно отмыв корни проростков от питательной среды. Стаканчики с проростками помещают в камеру искусственного климата для укоренения. После образования первой-второй пары настоящих листьев растения пересаживают в грунт (тепличный или поле) и выращивают до репродуктивного возраста, собирают с них пыльцу и в качестве отцовской формы скрещивают с реципиентом для получения следующего поколения беккросса. Непрерывная схема беккроссов предусматривает проведение 5-7 циклов беккроссирования, после чего растения самоопыляют в течение двух поколений, во втором поколении F₂ отбирают 9-12 зародышей с генотипом АА или Аа, а в третьем поколении F₃ из них получают 3-4 самоопыленных растения изогенных линий гомозиготных по генотипу АА, т.е. по доминантному признаку семени.

Недостатком известного способа, взятого в качестве прототипа, является большая трудоемкость создания изогенных линий.

Настоящим изобретением решается задача снижения трудоемкости создания изогенных линий за счет устранения рассадного метода выращивания растений, предусмотренного в прототипе.

Цель изобретения - отбор гетерозиготных генотипов беккроссных растений на ранней стадии появления всходов в полевых условиях с сохранением жизнеспособности проростков.

Технический результат достигается тем, что в известном способе создания изогенной линии по доминантному признаку семени у растений на основе непрерывной схемы беккроссов и установления генотипа беккроссных растений, согласно которому у каждого поколения беккросса генотип растения устанавливают по результатам биохимического анализа, в частности по жирнокислотному составу масла части семядоли, выделяют гетерозиготные проростки, выращивают их в поле до репродуктивных растений, которые в качестве отцовской формы скрещивают с реципиентом для получения следующего поколения беккросса, согласно изобретению биохимическому анализу подвергают апикальную часть семядоли проростка, которую отделяют от последнего в течение первых двух дней после появления всходов в полевых условиях. Причем установление генотипа беккроссных растений осуществляют непосредственно после отрезания апикальной части семядоли у проростка.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного условиями осуществления действий: используемым материалом (в прототипе для установления генотипа беккроссных растений биохимическому анализу подвергают часть семядолей семянки, извлеченной из созревающей корзинки подсолнечника спустя 12-14 дней после оплодотворения, а в заявленном изобретении анализу подвергают апикальную часть семядоли проростка, которую отделяют в течение первых двух дней после появления всходов в полевых условиях).

Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию патентоспособности "новизна".

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не обнаружили решений, имеющих признаки, совпадающие с отличительными. Эти отличительные от прототипа признаки, содержащиеся в независимом пункте формулы изобретения, для специалиста в области селекции явным образом не следуют из известного на сегодня существующего уровня техники.

Нашими исследованиями была выявлена возможность выделения гетерозиготных беккроссных растений в период, когда растение (в возрасте проростка) имеет орган, содержащий достаточное для анализа количество запасных веществ (семядоли вынесены на поверхность почвы, освобождены от околоплодника и еще не превратились в семядольные листья проростка, в которых доминантный признак семян не идентифицируется).

Поэтому можно сделать вывод о соответствии заявленного изобретения критерию патентоспособности "изобретательский уровень".

Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности "промышленная применимость", так как оно может быть использовано в сельском хозяйстве и, кроме того, в описании изобретения показаны средства и методы, с помощью которых возможно осуществление технического решения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят непрерывную схему беккроссов по общеизвестной методике. Для чего реципиент скрещивают с донором доминантного признака (ген А), а затем - с гибридами первого поколения (F₁), что приводит к образованию фенотипически неоднородных семян первого поколения беккросса (BC₁), 50% которых имеют генотип aa и 50% - генотип Аа, гетерозиготный по передаваемому признаку.

Семена первого поколения беккросса (BC₁) высевают в поле. В течение первых двух дней после появления всходов отрезают от семядоли проростка ее апикальную часть и по ней устанавливают генотип растения с помощью биохимического анализа, в частности по жирно-кислотному составу масла этой части семядоли проростка.

По результатам анализа выделяют гетерозиготные проростки (соответствующие генотипу Аа) и выращивают их до репродуктивных растений, которые в качестве отцовской формы скрещивают с реципиентом для получения следующего поколения беккросса. Оплодотворенные семянки второго поколения беккросса, сформировавшиеся на растениях реципиента P₁ в комбинации скрещивания с отцовской формой генотипа Аа, отбирают для дальнейшего насыщения.

После проведения необходимого (для создания изогенной линии) числа беккроссов, обычно 5-7, выделенные гетерозиготные растения самоопыляют (согласно требованиям непрерывной схемы беккроссов) в течение двух поколений, во втором поколении F₂ отбирают 3-5 растений с генотипом АА или Аа. А в третьем поколении F₃ из них получают 2-3 самоопыленных растения изогенных линий, гомозиготных по доминантному признаку (АА).

Схема получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений

Два поколения самоопыления и отбор АА изогенной линии

Условные обозначения к схеме:

А - передаваемый аллель;	F1 - гибрид первого поколения;
P1 - реципиент;	ВС - беккросс;
P2 - донор;	n - нужное число беккроссов.

Пример 1. Скрещивали линии подсолнечника, созданные во ВНИИМК:

линию-реципиент ВК678 с линией ВК464 - донором доминантной аллели Ol, контролирующей высокое содержание олеиновой кислоты в масле семян подсолнечника.

На каждом этапе беккроссирования семена высевали в поле. В течение первых двух дней после появления всходов отрезали апикальную часть одной из семядолей у 20-ти проростков, переносили в пронумерованные пробирки, а проростки с остатками одной семядоли и целой другой маркировали.

В лабораторных условиях проводили биохимический анализ состава жирных кислот масла отрезанной части семядоли. По результатам анализа на содержание олеиновой кислоты в масле семядолей выделяли те проростки, у которых количество олеиновой кислоты превышало 72% от суммы кислот, т.е. проростки генотипа Olol (таблица 1).

Таблица 1
Линия, гибрид	Генотип	Содержание олеиновой кислоты, % от суммы
семянки	1-2-дневные семядоли
ВК678	olol	28-38	32-42
ВК464	OlOl	86-89	75-85
F1 BK678×BK464	Olol	85-88	72-84

Выделенные по результатам анализа гетерозиготные проростки выращивали до репродуктивных растений, собирали с них пыльцу и скрещивали с двумя растениями реципиента P₁ для получения следующего поколения беккросса. Аналогично вышеописанному провели по непрерывной схеме беккроссов шесть последовательных скрещиваний, и на каждом этапе устанавливали генотип беккроссных растений по составу жирных кислот масла части семядоли одно-, двухдневных проростков. По результатам анализа выделяли гетерозиготные проростки - с содержанием олеиновой кислоты более 75% и выращивали их до репродуктивных растений. Из выделенных гетерозигот отбирали два наиболее похожих на реципиента растения, с них собирали пыльцу и проводили скрещивание с реципиентом для получения следующего поколения беккросса. Получили изогенную линию F₃ВС₆ ВК678 Ol с содержанием олеиновой кислоты в масле семян в пределах 86-88%.

Пример 2. Скрещивали линии подсолнечника, созданные во ВНИИМК: линию-реципиент ВК580 с линией ЛГ30-донором неполно доминантной аллели Р, контролирующей повышенное содержание пальмитиновой кислоты в масле семян подсолнечника.

На каждом этапе беккроссирования с семенами, проростками и растениями поступали так же, как в примере 1: семена высевали в поле, на 1-2 день после появления всходов отрезали апикальную часть одной из семядолей у 20 проростков и переносили в пронумерованные пробирки, а проростки с остатками одной семядоли и целой другой маркировали.

В лабораторных условиях проводили биохимический анализ состава жирных кислот масла отрезанной части семядоли. По результатам анализа на содержание пальмитиновой кислоты в масле семядолей выделяли те проростки, у которых количество пальмитиновой кислоты превышало 9% от суммы кислот, т.е. проростки генотипа Рр (таблица 2).

Таблица 2
Линия, гибрид	Генотип	Содержание пальмитиновой кислоты, % от суммы
семянки	1-2-дневные семядоли
ВК580	РР	4-6	4-7
ЛГ30	pp	22-26	20-25
F1 ВК580×ЛГ30	Рр	9-13	9-13

Выделенные растения доводили до цветения, собирали пыльцу и скрещивали с двумя растениями реципиента P₁ для получения следующего поколения беккроссных семян. Провели по непрерывной схеме беккроссов пять последовательных скрещиваний и на каждом этапе устанавливали генотип беккроссных растений по составу жирных кислот масла семядолей одно-, двухдневных проростков, выделяли гетерозиготные проростки. Из выделенных гетерозигот отбирали два наиболее похожих на реципиента растения, с них собирали пыльцу и проводили скрещивание с реципиентом для получения следующего поколения беккросса. Получили пятое поколение беккроссных семян линии BC₅ BK580 по признаку повышенного содержания пальмитиновой кислоты в масле семян. Наличие передаваемого признака контролировали по расщеплению в отдельных семянках двух самоопыленных корзинок беккроссных растений F₂BC₄ BK580, пределы варьирования содержания пальмитиновой кислоты в масле которых составили от 5 до 25%.

Установление генотипа беккроссных растений по результатам биохимического анализа, в частности по жирно-кислотному составу масла части семядоли проростка, обеспечивает отбор гетерозигот на ранней стадии появления всходов в полевых условиях с сохранением жизнеспособности проростков.

Отделение апикальной части семядоли проростка в первые два дня после появления всходов обеспечивает возможность четкой оценки генотипа проростка, т.к. выделение гетерозиготных беккроссных растений возможно только в период нескольких дней при надземном типе прорастания семян. В этом случае семядоли, еще содержащие достаточное для анализа количество запасных веществ, вынесены на поверхность почвы, освобождены от околоплодника и не превратились в семядольные листья проростка, в которых доминантный признак семян не идентифицируется.

Кроме того, в семядолях проростка во время его роста появляется характерная для зеленого листа линоленовая кислота. Ее содержание коррелируется с возрастом проростка - на 4-5 день от начала появления всходов ее содержание в семядоли колеблется от 35 до 55% от суммы кислот семядолей, а в первые два дня концентрация линолевой кислоты не превышает 7%, что не влияет на соотношение олеиновой и линолевой жирных кислот.

Использование для анализа части семядоли проростка, выращенного после посева семян в поле, исключает применение трудоемкого рассадного метода выращивания гетерозиготных растений, с которых необходимо собрать пыльцу для скрещивания с реципиентом для получения следующих поколений при непрерывной схеме беккроссов.

Следовательно, указанная совокупность заявленных признаков является необходимой и достаточной для достижения поставленной цели (отбор гетерозиготных генотипов беккроссных растений на ранней стадии появления всходов в полевых условиях с сохранением жизнеспособности проростков) и решение поставленной задачи (снижение трудоемкости создания изогенных линий по доминантному признаку семени у растений).

1. Способ создания изогенной линии по доминантному признаку семени у растений на основе непрерывной схемы беккроссов и установления генотипа беккроссных растений, согласно которому у каждого поколения беккросса генотип растения устанавливают по результатам биохимического анализа, в частности по жирно-кислотному составу масла части семядоли, выделяют гетерозиготные проростки, выращивают их в поле до репродуктивных растений, которые в качестве отцовской формы скрещивают с реципиентом для получения следующего поколения беккросса, отличающийся тем, что биохимическому анализу подвергают апикальную часть семядоли проростка, которую отделяют от последнего в течение первых двух дней после появления всходов в полевых условиях.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что установление генотипа беккроссных растений осуществляют непосредственно после отрезания апикальной части семядоли проростка.