2290936 - Способ получения средства для поддерживающей терапии, обладающего тканеспецифической активностью

Способ получения средства для поддерживающей терапии, обладающего тканеспецифической активностью

Изобретение относится к медицине и касается получения из животного сырья пептидного комплекса, обладающего тканеспецифической активностью, который может найти применение в медицинской практике в качестве средства для поддерживающей терапии. Способ получения средства для поддерживающей терапии, обладающего тканеспецифической активностью, состоит в том, что органы телят не старше 12-месячного возраста или свиней измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты при 20°±5°С, экстракцию проводят при постоянном помешивании, через 30 минут добавляют 1% раствор хлористого цинка, охлаждают при постоянном помешивании до 7-16°С. затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 часа отстаивания в течение 48 часов, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при 3-5°С в течение 4 ч, образовавшийся осадок промывают двукратным объемом охлажденного до 7-16°С ацетона, промытый осадок протирают через металлическое сито, полученный целевой продукт, высушивают при 18±2°С. При этом в качестве целевого продукта получают пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной пептидной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 1000 до 12000 Да, содержащий аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме, проявляющий выраженную тканеспецифическую активность, что достигается предлагаемой последовательностью технологических операций и условиями их осуществления, включая температурные, временные и иные характеристики, а также использованием веществ, включая исходное сырье определенного экстрагента и др. Пептидный компонент полученного комплекса не денатурирует и сохраняет свои регуляторные свойства, что позволяет считать показанным его использование в качестве средства для поддерживающей терапии. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 42 табл.

Реферат

Известен способ получения пептидов из животного сырья, а именно из эпифиза крупного рогатого скота (патент РФ №2136296, 1997), который измельчают, экстрагируют в растворе уксусной кислоты, замораживают при температуре минус 5-20°С и оттаивают, после чего предварительно осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом пропускания 10 кД. Выход целевого продукта с единицы сырья составляет 12 г на 1 кг исходного сырья. Получаемый пептидный комплекс согласно способу, описанному в патент РФ №2136296, не содержит белковых контаминации (отрицательная реакция на белок с трихлоруксусной кислотой, а также данные высокоэффективной жидкостной хроматографии), отвечает критериям подлинности (максимум поглощения в УФ спектре составляет 270±5 нм) и обладает специфической активностью.

Известен способ получения пептидного комплекса из шишковидной железы крупного рогатого скота (патент РФ №944191, 1994), включающий экстракцию измельченного сырья 3-5% уксусной кислотой с добавлением хлористого цинка, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкости шестью объемами ацетона и эфира, его ренатурацию в 1%-ной уксусной кислоте с последующим осветлением и приготовлением лекарственной формы.

Однако получаемый таким способом пептидный комплекс содержит белковые контаминации, а выход целевого продукта с единицы сырья мал и составляет 7 г/кг.

Наиболее близким техническим решением является способ получения из животного сырья обладающего тканеспецифическим действием нуклеопротеинового комплекса (патент РФ №2075944, 1996) с молекулярной масой входящих в него нуклеопротеиновых компонентов от 10000 до 90000 Да.

Способ, описанный в патенте РФ №2075944, предусматривает экстракцию предварительно подготовленного (измельченного и замороженного) животного сырья с использованием в качестве экстрагента 1-2,5% раствора углекислого натрия (соды) при рН 10,4-10,8 в течение 2-4 ч с добавлением 0,1-0,5%-ного хлористого магния при соотношении объемов экстрагируемой ткани и раствора соды в диапазоне 1:8-1:20, отделение осадка фильтрацией или на центрифуге, подкисление экстракта до рН 3,8-5,5, охлаждение суспензии при температуре не выше 4°С в течение 40 ч для удаления нерастворимых веществ, промывание осадка органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном, серным эфиром), высушивание осадка в вакууме при температуре не выше 55°С.

Выход целевого продукта (порошка нуклепротеинового комплекса) составляет 2,5-3,0% от количества исходного сырья.

Следует отметить, что хотя целевой продукт, получаемый способом, описанным в патенте РФ №2075944, содержит нуклеопротеиновые комплексы, обладающие специфичностью действия и тропностью по отношению к органам и тканям, являющимся источником их получения, однако известный способ имеет ряд недостатков, среди которых необходимо отметить следующие.

Порошок нуклепротеинового комплекса из органов и тканей, полученный описанным способом, относится к группе малорастворимых веществ, что требует определенных технологических приемов для применения в медицинской практике.

Получаемый продукт состоит из двух групп молекулярных ассоциатов: достаточно большого количества высокомолекулярных компонентов, среди которых присутствуют белки класса амилоидов, в состав которых входят прионы (мол. мас. от 27000 до 31000 Да), а также нуклеинового компонента, наличие которого несет в себе опасность присутствия в целевом продукте протоонкогенов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в разработке технологии выделения очищенного от белковых, нуклеиновых и липидных примесей низкомолекулярного комплекса, пептидный компонент которого не денатурирует и сохраняет свои регуляторные свойства.

Технический результат заключается в том, что предлагаемым способом получают пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 1000 до 12000 Да, содержащий аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме, проявляющий выраженную тканеспецифическую активность, вследствие чего пептидный компонент полученного комплекса не денатурирует и сохраняет свои регуляторные свойства, что позволяет считать показанным его использование в качестве средства для поддерживающей терапии.

Способ получения средства для поддерживающий терапии, обладающего тканеспецифической активностью, включает измельчение сырья животного происхождения, экстракцию, которую проводят 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, охлаждение до температуры плюс 7-16°С при постоянном перемешивании в течение 48 ч, отделение экстракта от балластных веществ сепарированием, осаждение, которое проводят ацетоном в объемном соотношении 1:5 при температуре плюс 3-5°С в течение 4 ч, отстаивание до образования сформировавшегося осадка, который затем промывают двукратными объемами ацетона, промытый осадок протирают через металлическое сито, полученный целевой продукт высушивают при температуре 18±2°С до полного удаления следов ацетона.

При этом в качестве целевого продукта получают пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 1000 до 12000 Да.

При этом в качестве животного сырья используют печень, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию печени, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	65,0-75,0
минеральные вещества	3,0-5,0
микроэлементы	0,003-0,008
витамины	0,01-0,03

При этом в качестве животного сырья используют поджелудочную железу, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию поджелудочной железы, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	45,0-55,0
минеральные вещества	10,0-15,0
микроэлементы	0,001-0,003
витамины	0,005-0,010

При этом в качестве животного сырья используют щитовидную железу, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию щитовидной железы, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	70,0-80,0
минеральные вещества	3,0-5,0
микроэлементы	0,002-0,004
витамины	0,001-0,003

При этом в качестве животного сырья используют сосуды, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию сосудов, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	80,0-90,0
минеральные вещества	3,0-5,0
микроэлементы	0,005-0,010
витамины	0,001-0,003

При этом в качестве животного сырья используют хрящи, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию хрящевой ткани, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	50,0-60,0
минеральные вещества	7,0-9,0
микроэлементы	0,002-0,008
витамины	0,001-0,003

При этом в качестве животного сырья используют головной мозг, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию головного мозга, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	50,0-60,0
минеральные вещества	4,0-6,0
микроэлементы	0,002-0,004
витамины	0,001-0,003

При этом в качестве животного сырья используют тимус, а пептидный комплекс, поддерживающий функцию иммунной системы, содержит аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминокислоты	55,0-65,0
минеральные вещества	3,0-5,0
микроэлементы	0,001-0,003
витамины	0,010-0,030

При этом максимум поглощения целевого продукта в ультрафиолетовом спектре составляет (270±5) нм.

Предлагаемая технология в отличие от известных позволяет получить очищенный от нуклеиновых, белковых и липидных примесей пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 1000 до 12000 Да, содержащий в биологически связанной форме микроэлементы, минеральные вещества и витамины, обладающий выраженной тканеспецифической активностью, что достигается предлагаемой последовательностью технологических операций и условиями их осуществления, включая температурные, временные и иные характеристики, а также использованием веществ, включая исходное сырье, определенного экстрагента и др.

Сущность изобретения поясняется таблицами.

В Таблице 1 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из печени.

В Таблице 2 представлено содержание минеральных веществ в пептидном комплексе, выделенном из печени.

В Таблице 3 представлен микроэлементный состав пептидного комплекса, выделенного из печени.

В Таблице 4 представлены результаты содержания витаминов в пептидном комплексе, выделенном из печени.

В Таблице 5 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из печени.

В Таблице 6 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из печени, на развитие эксплантатов печени.

В Таблице 7 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы.

В Таблице 8 представлено содержание минеральных веществ в пептидном комплексе, выделенном из поджелудочной железы.

В Таблице 9 представлен микроэлементный состав пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы.

В Таблице 10 представлено содержание витаминов в пептидном комплексе, выделенном из поджелудочной железы.

В Таблице 11 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы.

В Таблице 12 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы, на развитие эксплантатов поджелудочной железы.

В Таблице 13 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из щитовидной железы.

В Таблице 14 представлено содержание минеральных веществ в пептидном комплексе, выделенным из щитовидной железы.

В Таблице 15 представлен микроэлементный состав пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы.

В Таблице 16 представлен витаминный состав пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы.

В Таблице 17 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы.

В Таблице 18 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы, на развитие эксплантатов щитовидной железы.

В Таблице 19 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из сосудов.

В Таблице 20 представлен минеральный состав пептидного комплекса, выделенного из сосудов.

В Таблице 21 представлено содержание микроэлементного состава пептидного комплекса, выделенного из сосудов.

В Таблице 22 представлен витаминный состав пептидного комплекса, выделенного из сосудов.

В Таблице 23 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из сосудов.

В Таблице 24 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из сосудов, на развитие эксплантатов сосудов.

В Таблице 25 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из хрящей.

В Таблице 26 представлен минеральный состав пептидного комплекса, выделенного из хрящей.

В Таблице 27 представлен микроэлементный состав пептидного комплекса, выделенного из хрящей.

В Таблице 28 представлен витаминный состав пептидного комплекса, выделенного из хрящей.

В Таблице 29 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из хрящей.

В Таблице 30 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из хрящей, на развитие эксплантатов хрящей.

В Таблице 31 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из головного мозга.

В Таблице 32 представлен минеральный состав пептидного комплекса, выделенного из головного мозга.

В Таблице 33 представлен микроэлементный состав пептидного комплекса, выделенного из головного мозга.

В Таблице 34 представлен витаминный состав пептидного комплекса, выделенного из головного мозга.

В Таблице 35 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из головного мозга.

В Таблице 36 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из головного мозга, на развитие эксплантатов головного мозга.

В Таблице 37 представлен аминокислотный состав и соотношение аминокислот, входящих в пептидный комплекс, выделенный из тимуса.

В Таблице 38 представлен минеральный состав пептидного комплекса, выделенного из тимуса.

В Таблице 39 представлен микроэлементный состав пептидного комплекса, выделенного из тимуса.

В Таблице 40 представлен витаминный состав пептидного комплекса, выделенного из тимуса.

В Таблице 41 представлен химический состав пептидного комплекса, выделенного из тимуса.

В Таблице 42 показано влияние пептидного комплекса, выделенного из тимуса, на развитие эксплантатов тимуса.

Ниже приведены примеры получения пептидного комплекса из животного сырья, в качестве которого используют различные органы и ткани животных (пример 1 - из печени, пример 3 - из поджелудочной железы, пример 5 - из щитовидной железы, пример 7 - из сосудов, пример 9 - из хрящей, пример 11 - из головного мозга, пример 13 - из тимуса), а также примеры, подтверждающие тканеспецифическое действие пептидного комплекса (пример 2 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из печени, пример 4 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы, пример 6 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы, пример 8 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из сосудов, пример 10 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из хрящей, пример 12 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из головного мозга, пример 14 - тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из тимуса).

Пример 1. Способ получения пептидного комплекса, выделенного из печени, обладающего тканеспецифической активностью

В качестве животного сырья используют печень телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней.

В реактор для экстракции перекачивают 250 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры (20±5)°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 50 кг измельченного сырья. Через 30 минут добавляют 1% раствор хлористого цинка в 3%-ном растворе уксусной кислоты (из расчета на 1 кг сырья - 10 г хлористого цинка), суспензию при постоянном перемешивании охлаждают до достижения температуры плюс (7-16)°С. Последующие перемешивания производят по 1 часу через каждые 4 часа отстаивания. Процесс проводят в течение не менее 48 часов при температуре плюс (7-16)°С.

Отделение экстракта от балластных веществ проводят на сепараторе при (5000±500) об/мин. В реактор для осаждения из мерника ацетона подают ацетон из расчета 5 объемов на 1 объем экстракта печени. В охлажденный ацетон тонкой струей при постоянном перемешивании подают осветленный экстракт печени, перемешивают и оставляют смесь до формирования осадка при температуре плюс (3-5)°С в течение не менее 4 часов. Надосадочный слой удаляют декантированием. Сформировавшийся осадок промывают на нутч-фильтре, на сетку которого кладут ткань хлопчатобумажную, двукратными объемами охлажденного до плюс (7-16)°С ацетона, подавая его из мерника. Промытый осадок протирают через металлическое сито с диаметром отверстий 1,5 мм и выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при температуре плюс (18±2)°С до полного удаления запаха ацетона. В процессе высушивания массу по мере подсыхания верхнего слоя перемешивают. Полученный порошок просеивают через металлическое сито с диаметром отверстий 0,36 мм. Сухой порошок взвешивают, отбирают пробу и направляют ее на анализ.

Выход целевого продукта (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из печени) составляет 70 г на 1 кг исходного сырья.

Целевой продукт (пептидный комплекс) представляет собой порошок от кремового до темно-коричневого цвета и содержит биологически активные пептидные компоненты. Целевой продукт умеренно растворим в воде.

Для более подробной характеристики биологически активного пептидного комплекса, полученного предлагаемым способом, проведено изучение его состава, основных физико-химических свойств, специфической биологической активности.

Молекулярную массу пептидных компонентов, входящих в пептидный комплекс, определяют методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 ("Pharmacia", Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют набор маркеров Peptide Molecuar Weight Kit MS III ("Serva", Германия). Установлено, что в состав пептидного комплекса входят вещества с молекулярной массой не более 12000 Да. С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент "Lichrosorb C₁₈", колонка 2×62 мм) установлено, что в состав пептидного комплекса входят; преимущественно низкомолекулярные пептидные фракции (от 70 до 90%), а высокомолекулярные компоненты в пептидном комплексе отсутствуют.

По данным электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле молекулярная масса пептидных компонентов пептидного комплекса составляет от 1000 до 12000 Да.

Для определения подлинности пептидного комплекса навеску целевого продукта 10 мг помещают в пробирку, растворяют при тщательном перемешивании в 5 мл воды. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Для приготовления биуретового реактива растворяют 90 г калия-натрия тартрата в 400 мл 0,2 н. раствора едкого натрия, прибавляют 10 г меди сернокислой 5-водной, после растворения добавляют 10 г йодида калия и доводят объем раствора 0,2 н. раствором едкого натра до 2 л. К исследуемому раствору добавляют 5 мл биуретового реактива. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в комплексе пептидных связях. В качестве вещества сравнения используют воду.

Идентификацию активного пептидного комплекса проводят с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Для этого 10 мг пептидного комплекса растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. На спектрофотометре измеряют ультрафиолетовый спектр пептидного комплекса в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм в области длин волн от 250 до 300 нм. В качестве раствора сравнения используют воду. Спектр должен иметь выраженный максимум при длине волны (270±5) нм. Соотношение оптических плотностей при длинах волн 275 нм (Д₂₇₅) и 260 нм (Д₂₆₀) Д₂₇₅/Д₂₆₀ должно быть не менее 1,0.

Для определения белка в пептидном комплексе 25 мг продукта (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, перемешивая с помощью магнитной мешалки, и доводят объем раствора водой до метки. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Проводят измерение оптической плотности полученных образцов в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм при длинах волн 280 нм (Д₂₈₀) и 260 нм (Д₂₆₀). В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание белка (X) в продукте в мг/мг вычисляют по формуле:

Содержание белка в продукте должно составлять 0,2-0,5 мг/мг.

Для определения содержания остаточных органических растворителей (ацетона) готовят раствор стандартного образца (РСО) ацетона. Около 10 мг (точная навеска) ацетона (ГОСТ 2603-79, ч.д.а.) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водным раствором аммиака до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Для определения содержания ацетона около 100 мг (точная навеска) продукта растворяют в 5 мл раствора аммиака, полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр. По 2 мкл полученного раствора и раствора РСО ацетона попеременно хроматографируют на газовом анализаторе ("Хром-5" или аналогичном) с пламенно-ионизационным детектором, получая не менее 5 хроматограмм.

Содержание ацетона (X) в конечном продукте в процентах вычисляют по формуле:

где S₁ - среднее значение площадей пиков ацетона из хроматограмм испытуемого раствора;

S₀ - среднее значение площадей пиков ацетона из хроматограмм раствора РСО ацетона;

m₁ - маса навески продукта, в мг;

m₀ - маса навески РСО ацетона, в мг;

V₁ - объем испытуемого раствора, в мл;

V₀ - объем раствора РСО ацетона, в мл.

Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста "Проверка пригодности хроматографической системы".

Допускается присутствие остаточного количества ацетона не более 1%.

Бактериологические показатели пептидного комплекса анализируют по ГОСТ 10444.2-94, ГОСТ 10444.15-94, ГОСТ Р 50474-93, ГОСТ Р 50480-93.

Содержание токсичных элементов в пептидном комплексе определяют по ГОСТ 26927-86, ГОСТ 26930-86, ГОСТ 26932-86, ГОСТ 26933-86.

Результаты изучения компонентного состава пептидного комплекса, выделенного из печени, представлены в нижеследующих таблицах.

Аминокислотный состав пептидного комплекса определяют на анализаторе "LKB-3201" (Швеция). Анализ показал, что в пептидном комплексе, выделенном из печени, присутствует основной спектр аминокислот, в том числе незаменимые (см. Таблицу 1).

Таблица 1
Наименование аминокислоты	Содержание аминокислоты, нмоль/мг
Asp	555
Thr	271
Ser	306
Glu	702
Pro	264
Gly	385
Ala	426
Val	312
Ile	211
Leu	456
Tyr	120
Phe	194
His	138
Lys	333
Arg	225

Содержание аминокислот, представленное в Таблице 1, соответствует суммарному количеству аминокислот в пептидном комплексе, равному 65-75 мас.%.

Определение содержания минеральных веществ в пептидном комплексе, выделенном из печени, осуществляют с помощью пламенного фотометра (натрий и калий), титрометрическими методами (кальций и магний), калориметрически (фосфор, железо). В процессе исследований установлено, что минеральный состав пептидного комплекса, выделенного из печени, представлен наиболее важными для нормального функционирования органов и систем человека минеральными веществами в оптимальном количестве - кальцием, магнием, железом, фосфором, а также калием и натрием (см. Таблицу 2).

Таблица 2
Наименование продукта	Содержание минеральных веществ, мкг/20 мг
Са	Mg	Fe	P	К	Na	S
Пептидный комплекс, выделенный из печени	18,01	1,77	2,44	14,35	22,11	490,45	222,87

Содержание минеральных веществ, представленное в Таблице 2, соответствует суммарному количеству минеральных веществ в пептидном комплексе, равному 3,0-5,0 мас.%.

Содержание микроэлементов в пептидном комплексе, выделенном из печени, определяют методом эмиссионной спектрометрии с помощью спектрохимической системы GBC, и отражено в Таблице 3.

Определение витаминов в пептидном комплексе, выделенном из печени, осуществляют общепринятыми методами, основанными на способности витаминов давать характерные цветные реакции с рядом химических соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации витамина и может быть определена фотоколометрически, и отражено в Таблице 4.

Таблица 3
Наименование продукта	Содержание микроэлементов, мкг/20 мг
Al	Mn	Cu	Со	Мо
Пептидный комплекс, выделенный из печени	0,2158	0,0192	0,4157	0,0027	0,0299

Содержание микроэлементов, представленное в Таблице 3, соответствует суммарному количеству микроэлементов в пептидном комплексе, равному 0,003-0,008 мас.%.

Таблица 4
Наименованиепродукта	Содержание витаминов, мкг/20 мг
В₁	В₂	РР	С	А	Е
Пептидный комплекс, выделенный из печени	0,08	0,059	3,012	следы	0,019	0,040

Содержание витаминов, представленное в Таблице 4, соответствует суммарному количеству витаминов в пептидном комплексе, равному 0,01-0,03 мас.%.

Анализ химического состава целевого продукта свидетельствует об отсутствии в нем углеводов и его низкой энергетической ценности, что позволяет применять его в диетическом питании (см. Таблицу 5).

Таблица 5
Наименованиепродукта	Энергетическаяценность кал/20 мг	Содержание компонентов, мг/20 мг
Белки	Жиры	Углеводы	Зола
Пептидный комплекс, выделенный из печени	42,15	8,12	0,92	следы	0,28

Приведенная информация по химическому составу продукта, полученного предлагаемым способом, свидетельствующая о наличии физиологических концентраций аминокислот, минеральных веществ, микроэлементов и витаминов, демонстрирует химический состав ткани, из которой была проведена экстракция, и подтверждает содержание в них перечисленных веществ в биологически связанной форме.

Пример 2. Тканеспецифическая активность пептидного комплекса, выделенного из печени

Для изучения тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного предлагаемым способом из печени, исследовали влияние целевого продукта на рост органотипической культуры печени половозрелых крыс линии "Wistar" с массой тела 150-200 г.

Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты печени крыс разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм³, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 5% куриного эмбрионального экстракта, 0,6% глюкозы, 0,5 ед/мл инсулина, 100 ед./мл гентамицина. Исследуемый пептидный комплекс, выделенный из печени, вводили в культуральную среду в концентрациях от 0,01 до 20 нг/мл для выявления его эффективных концентраций.

В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли по 3 мл питательной среды, содержащей пептидный комплекс, выделенный из печени, в исследуемой концентрации, а в чашки Петри с контрольными эксплантатами по 3 мл питательной среды; таким образом, экспериментальные и контрольные эксплантаты развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помещали в термостат при температуре (37±0,5)°С и через 3 сут просматривали под фазово-контрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как отношение площади всего эксплантата вместе с зоной выселяющихся клеток к площади центральной зоны эксплантата.

Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Для расчета индекса площади эксплантатов использовали программу Photo M 1.2. Достоверность различий в индексах площади контрольных и экспериментальных эксплантатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения индекса площади выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%.

При использовании пептидного комплекса, выделенного из печени в концентрациях 0,05, 0,1 и 10 нг/мл, наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 18-28% по сравнению с контрольными значениями ИП. Полученные данные представлены в Таблице 6.

Таблица 6
Показатель	Концентрация пептидного комплекса, выделенного из печени, нг/мл
0,01	0,05	0,1	0,5	1,0	2,0	10,0	20,0
ИП, % по отношению к контролю	5	18*	20*	22*	14	22*	28*	18*
* р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, в отношении ткани печени пептидный комплекс, выделенный из печени, оказывает тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов, что подтверждается в опытах на крысах, это позволяет считать показанным использование его в качестве средства, поддерживающего функцию печени.

Пример 3. Способ получения пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы, обладающего тканеспецифической активностью

В качестве животного сырья используют поджелудочную железу телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней.

Выделение пептидного комплекса из поджелудочной железы проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что выход целевого продукта (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы) составляет 60 г на 1 кг исходного сырья.

Основные характеристики пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы, определенные методами, описанными в примере 1, представлены в Таблицах 7-11.

Аминокислотный анализ показал, что в пептидном комплексе, выделенном из поджелудочной железы, присутствует основной спектр аминокислот, в том числе незаменимые (см. Таблицу 7).

Минеральный состав пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы, представлен наиболее важными для нормального функционирования органов и систем человека минеральными веществами в оптимальном количестве - кальцием, магнием, железом, фосфором, а также калием и натрием, что отражено в Таблице 8.

Результаты анализа микроэлементного состава пептидного комплекса, выделенного предлагаемым способом из поджелудочной железы, представлены в Таблице 9.

Витаминный состав пептидного комплекса, выделенного предлагаемым способом из поджелудочной железы, характеризуется значительным содержанием витамина РР, В₂, а также наличием витаминов B₁, А и Е, что отражено в Таблице 10.

Таблица 7
Наименование аминокислоты	Содержание аминокислоты, нмоль/мг
Asp	388
Thr	171
Ser	212
Glu	505
Pro	15)
Gly	401
Ala	314
Val	305
Ile	144
Leu	352
Tyr	81
Phe	111
His	129
Lys	306
Arg	187

Содержание аминокислот, представленное в Таблице 7, соответствует суммарному количеству аминокислот в пептидном комплексе, равному 45-55 мас.%.

Таблица 8
Наименованиепродукта	Содержание минеральных веществ, мкг/20 мг
Са	Mg	Fe	P	К	Na	S
Пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы	30,14	2,00	1,01	76,14	100,54	1921,41	306,17

Содержание минеральных веществ, представленное в Таблице 8, соответствует суммарному количеству минеральных веществ в пептидном комплексе, равному 10,0-15 мас.%.

Таблица 9
Наименование продукта	Содержание микроэлементов, мкг/20 мг
Al	Mn	Cu	Со	Мо
Пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы	0,3211	0,0512	0,0712	0	0,0190

Содержание микроэлементов, представленное в Таблице 9, соответствует суммарному количеству микроэлементов в пептидном комплексе, равному 0,001-0,003 мас.%.

Таблица 10
Наименованиепродукта	Содержание витаминов, мкг/20 мг
B₁	В₂	РР	С	А	Е
Пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы	0,09	0,212	1,255	следы	0,011	0,221

Содержание витаминов, представленное в Таблице 10, соответствует суммарному количеству витаминов в пептидном комплексе, равному 0,005-0,010 мас.%.

Таблица 11
Наименованиепродукта	Энергетическаяценность кал/20 мг	Содержание компонентов, мг/20 мг
Белки	Жиры	Углеводы	Зола
Пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы	41,12	6,05	1,47	следы	1,0

Пример 4. Тканеспецифическая активность пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы

Для изучения тканеспецифической активности пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы предложенным способом, исследовали его влияние на рост органотипической культуры поджелудочной железы половозрелых крыс. Подробно метод описан в примере 2.

Эксперименты проведены на 29 фрагментах поджелудочной железы крыс линии "Wistar" с массой тела 150-200 г. Фрагменты поджелудочной железы помещали в питательную среду и культивировали в чашках Петри в термостате при (37±0,5)°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы, в концентрациях от 0,01 до 20 нг/мл.

При использовании пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы в концентрациях 0,05, 0,1 и 10 нг/мл, наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 16-27% по сравнению с контрольными значениями ИП. Полученные данные представлены в Таблице 12.

Таблица 12
Показатель	Концентрация пептидного комплекса, выделенного из поджелудочной железы, нг/мл
0,01	0,05	0,1	0,5	1,0	2,0	10,0	20,0
ИП, % по отношению к контролю	8	20*	27*	20*	16*	22*	24*	16*
• р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, в отношении ткани поджелудочной железы пептидный комплекс, выделенный из поджелудочной железы, оказывает тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов, что подтверждается в опытах на крысах, это позволяет считать показанным использование его в качестве средства, поддерживающего функцию поджелудочной железы.

Пример 5. Способ получения пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы, обладающего тканеспецифической активностью

В качестве животного сырья используют щитовидную железу телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней.

Выделение пептидного комплекса из щитовидной железы проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что выход целевого продукта (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы) составляет 46 г на 1 кг исходного сырья.

Для более подробной характеристики биологически активного пептидного комплекса, выделенного из щитовидной железы, полученного предлагаемым

Способ получения средства для поддерживающей терапии, обладающего тканеспецифической активностью

Патент 2290936