Средство для лечения повреждений спинного и головного мозга

Средство для лечения повреждений спинного и головного мозга

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в нейрохирургии, неврологии, трансплантологии.

Известны средства для лечения повреждений мозга, представляющие собой либо фрагменты биологических тканей, либо полимерные протезирующие материалы.

К первой группе относятся трансплантаты донорских кусочков ткани, или аутотрансплантаты, или аллотрансплантаты, или ксенотрансплантаты, используемые для соединения поврежденных участков спинного мозга (Houle and Reier, J. Comp. Neurol., 269, P.535, 1988). Они представляют собой или трансплантаты-суспензии, состоящие из клеток нервной ткани (Goldberg and Bernstein, J. Neuroscience Res., 19, P.34, 1988; Hoovler and Wrathall, Acta NeuropathoL, 81, P.303, 1991); или клетки Швана, рекомбинированные с культуральными сенсорными нейронами (Kuhlengel et al., J. Comp. Neurol., 293, P. 74, 1990); или периферические нервные сегменты (Н.Н.Бурденко, Русский врач, №2, 1910, стр.762-766; Wrathall et al., Acta NeuropathoL, 57, P.59, 1982). Эти и подобные им трансплантаты позволяют заполнить дефект спинного мозга. Однако данные трансплантаты не выполняют функцию восстановления спинного мозга. Помещенные в дефект мозговой ткани, они, лишенные питания, погибают, превращаясь в рубец.

Ко второй категории трансплантатов относятся различные модификации полимерных нейрогелей. Авторы Woerli S, Plant G.W, Harvey A.R. в работе "Cultured Rat Neuronal and Glial Cells Entrapped within Hydrogel Polymer Matrices: A Potential Tool for Neural Tissue Replacement" (Neurosci. Lett., 1996, 205, P.197-201) описывают технологию улавливания клеток нервной ткани гомогенными прозрачными полимерными гелями из поли N-(2-гидроксипропил)-метакрил амида, которые могут содержать коллаген в качестве дополнительного субстрата. Эта процедура включает дополнительное введение клеточной суспензии к смеси полимера и процесс полимеризации клеточно-полимерной смеси. Полученный гель оптически прозрачен, а клетки беспорядочно рассеяны в геле.

Известен патент США №5863551 (1996, автор - Woerli S.) «Implantable polymer hydrogel for therapeutic uses», где описан имплантируемый полимерный гидрогель для терапевтических целей. Изобретение касается полимерного гидрогеля, который может использоваться для замены частей поврежденных мягких органов, в том числе нервной ткани. В него могут быть введены живые клетки.

Все предлагаемые разновидности геля основаны на различных комбинациях химических субстанций, не являющихся питательной средой для помещенных в них клеток. По этой причине сразу после трансплантации, когда еще не успевает развиться сосудистая сеть, стволовые клетки, помещенные в гелиевый трансплантат, погибают. Кроме того, в большинстве случаев гель, не обладая биосовместимостью, превращается в рубец, что препятствует росту аксонов.

Известен «Способ лечения травматических повреждений спинного мозга» (патент РФ №2195941). В этом изобретении используется трансплантат спинного мозга фетуса, обогащенный клетками выстилки луковиц обонятельного нерва. Трансплантат вводится в область дефекта спинного мозга после удаления кисты. Клетки выстилки луковиц обонятельных нервов могут вводиться также в периферический и проксимальный концы спинного мозга. В субарахноидальное пространство спинного мозга вводят суспензию фетальных клеток нервной и кроветворной ткани. Суспензия клеток вводится без какой-либо матрицы. Отсутствие матрицы не позволяет сконцентрировать всю клеточную массу в зоне повреждения, она растекается по всему субарахноидальному пространству, что снижает эффективность лечения. По этой же причине способ не создает условий для развития сосудистой сети в области повреждения.

Сущность изобретения

Предлагается средство (биологический плазматический трансплантат) для лечения повреждений спинного и головного мозга, представляющее плазматический сгусток (сгусток плазмы крови человека), содержащий фетальные клетки нервной и кроветворной ткани.

Остальные клетки нервной и кроветворной ткани находятся в трансплантате в соотношении 1: (5-30). Их получают из фетуса 16-22-недельной гестации.

Предлагаемое средство (трансплантат) получают следующим образом (приведен расчет для получения трансплантата объемом 2-2,5 мл).

Модифицированный раствор Олсвера (0,8 г цитрата натрия, 0,42 г хлористого натрия, 2,05 г глюкозы, 0,8 мл 10%-ной лимонной кислоты доводят до 100 мл бидистиллированной водой), стерилизуют фильтрованием через фильтр 0,22 мкм и наливают в пробирку в количестве 3,5-4 мл. Затем в эту же пробирку добавляют 5-6 мл свежей донорской крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и центрифугируют для отделения плазмы от клеток (например, в течение 10 мин при скорости 1500 об/мин). Плазму отсасывают, переносят в новую пробирку и вновь центрифугируют в тех же условиях. Полученную после повторного центрифугирования плазму вновь отсасывают и стерилизуют фильтрованием. Готовят суспензию в физиологическом растворе стволовых клеток нервной (головной мозг) и кроветворной печеночной ткани фетуса человека 16-22-недельной гестации (абортный материал). Клетки нервной и кроветворной печеночной ткани находятся в суспензии в соотношении 1:(5-30). К 1 мл данной суспензии, содержащей (1,5-2)×10⁸ клеток, добавляют 1-1,5 мл дважды центрифугированной стерильной плазмы.

Смесь клеток в плазме хорошо перемешивают на мешалке. Инициирование сгустка осуществляют добавлением к смеси раствора хлористого кальция из расчета 50 мкл раствора хлористого кальция на 1 мл смеси клеток в плазме (раствор хлористого кальция готовят добавлением 100 мг CaCl₂ к 5 мл деионизированной воды). После добавления CaCl₂ пробирку убирают из мешалки. После инициации сгусток образуется в среднем за 10 сек. Пробирку оставляют на 5-15 минут для лучшего "созревания". Затем, держа пробирку "у горлышка", а пальцем другой руки слегка поколачивая по нижнему концу пробирки, добиваются ретракции сгустка и отделения его от стенок пробирки. Далее простым "переливанием" сгустка его переносят во флакон, пробку которого закатывают. Получают трансплантат объемом 2-2,5 мл, содержащий (1,5-2)×10⁸ клеток. Сгусток может быть уплотнен за счет ретракции и отделения части жидкости (20-30% от объема сгустка).

До операции больному проводят МР-томографию и определяют локализацию и размер повреждения. На основании полученных данных заготавливают трансплантат заданного размера. Если после введения его во время операции в область повреждения трансплантат окажется большего размера, чем необходимо для заполнения дефекта, лишнюю часть его отсекают.

Проводят типичную ламинэктомию в проекции поврежденного участка спинного мозга. Вскрывают твердую мозговую оболочку. Проводят иссечение рубцовой ткани и внутриспинальных кист. Иссекают выстилку кист до обнажения ткани спинного мозга в области проксимальной и дистальной культи его. В образовавшийся дефект спинного мозга вводят вышеописанный трансплантат - плазматический сгусток со стволовыми клетками. Сгусток полностью замещает дефект спинного мозга, прилипая к обнаженным поверхностям его. В проксимальную культю спинного мозга вводят суспензию клеток выстилки луковиц обонятельных нервов фетуса (RU 2195941) в физиологическом растворе (1-20 тысяч клеток в 0,5-1 мл суспензии) в объеме 1,5 мл и 3-5 мл суспензии вышеуказанных клеток нервной и кроветворной печеночной ткани, содержащих (0,4-0,8)×10⁸ клеток в 1 мл. Накладывают шов на твердую мозговую оболочку и ушивают рану.

Преимущества предлагаемого биологического плазматического трансплантата:

- получена матрица, биологически совместимая с вводимыми в нее клетками, являющаяся для них питательной средой;

- матрица, полученная из плазмы крови, стимулирует пролиферацию введенных в нее клеток;

- сильная биоадгезивная способность трансплантата, обеспечивающая его плотное присоединение к ткани пациента;

- высокая эластичность и влагосодержание, что обеспечивает возможность приобретения трансплантатом формы, соответствующей форме дефекта нервной ткани;

- возможность использования стандартных хирургических процедур для помещения трансплантата в спинной и головной мозг

- способность выдерживать длительную имплантацию в нервную ткань пациента без лизиса сгустка и с сохранением жизнеспособности клеток, содержащихся в трансплантате;

- способность заместить дефект спинного и головного мозга и восстановить их функцию.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с реализацией назначения

Тест 1. Возможность сохранения трансплантационных качеств биологического плазматического трансплантата изучалось in vitro. Известно, что спинно-мозговая жидкость обладает выраженными литическими свойствами. Возможно было предположить, что она растворит сгусток и/или введенные в него клетки.

Плазматический сгусток создавался по описанной выше методике. В него были введены фетальные стволовые клетки нервной ткани плода человека. Затем путем спинно-мозговой пункции у пациента получали 8-10 мл спинно-мозговой жидкости. Готовый трансплантат помещали в пробирку со спинно-мозговой жидкостью так, чтобы он свободно плавал в ней. Пробирку инкубировали в термостате при 37C° в течение 7 дней. Через 7 суток проведено морфологическое исследование (окраска гематоксилин-эозином и по Ван Гизону). Обнаружено, что среди волокон фибрина имеется большое количество незрелых нервных клеток, располагающихся группами и одиночно. Некоторые клетки находятся в апоптозе, но в основном контуры клеток сохранены. Таким образом, спинно-мозговая жидкость не только не разрушала плазменный сгусток, но и способствовала выживанию клеток.

Тест 2. Возможность использования предлагаемого биологического плазматического трансплантата по указанному назначению изучалась в эксперименте на примере имплантации в участки поврежденного мозга крыс. Использовался плазматический сгусток, полученный вышеописанным способом и содержащий фетальные стволовые клетки нервной и кроветворной печеночной ткани человека. Крысам проводили трепанацию черепа, удаляли кусочек мозга из коры объемом около 0,5 см³. В этот дефект вводили плазматический сгусток со стволовыми клетками согласно изобретению. Крыс забивали через 14 и 30 дней, извлекали головной мозг и по стандартной методике изготавливали препараты со срезов мозга в области трансплантации. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином.

Через 14 дней в мозговой ткани видна полость, ограниченная пролифератами глии с большим количеством сосудов капиллярного типа. Внутри зоны повреждения видна рыхлая соединительная ткань, «ретикулярная строма» (тонкие ретикулярные волоконца). Среди волокнистых структур наблюдаются группы нейробластов, местами по 3-4, иногда одиночные. Это крупные клетки с центрально расположенным ядром и ядрышком. В цитоплазме этих клеток выявляется субстанция Ниссля (окраска по Нисслю), что является подтверждением сохранения жизнеспособности пересаженных фетальных нейробластов.

Через 30 дней после пересадки нейробластов в зону повреждения выявляется полость, выполненная пролифератами глии и рыхлой соединительной ткани с большим количеством сосудов капиллярного типа. Среди массива клеток глии, клеток рыхлой соединительной ткани видны нейроны группами по 3-4 и одиночные. Это крупные клетки, цитоплазма которых дает положительную реакцию Ниссля. Вокруг этих клеток сформирован довольно гомогенный матрикс - нейропиль. Эти клетки располагаются во всех полях зрения в зоне «пересадки».

Таким образом, получены следующие данные:

1. Гладкое сопряжение плазматического сгустка с тканями реципиента по всей поверхности.

2. Новообразование капилляров и врастание капилляров в плазматический сгусток.

3. Сохранение жизнеспособности и способности к пролиферации введенных в плазматический сгусток клеток нервной ткани

4. Врастание глиальных клеток в плазматический сгусток, создающих трофическое микроокружение для введенных стволовых нейрональных клеток.

Клинические наблюдения:

1) Больной А-нц А., 08.06.2002 г. при падении с высоты получил компрессионный переломовывих Th11 позвонка с контузией спинного мозга. Сразу развился синдром полного поперечного перерыва спинного мозга (нижняя вялая параплегия; нарушение всех видов чувствительности; острая задержка мочеиспускания, сменившаяся через 3 недели недержанием). В экстренном порядке произведена задняя стабилизация металлоконструкцией. Комплекс реабилитационных мероприятий не дал эффекта восстановления. По магнитно-резонансной томографии (МРТ) определяется миэломаляция с кистообразованием на уровне повреждения. 13.11.2003 произведена ламинэктомия. Осуществлено опорожнение кисты объемом 2 мл и введение в полость плазматического биологического трансплантата соответствующего объема, содержащего нервные и кроветворные клетки фетуса (17 недель гестации) в соотношении 1:10. В проксимальную культю спинного мозга ввели 1,5 мл суспензии клеток выстилки обонятельных нервов (10 тыс.клеток в 1 мл) и 4 мл суспензии фетальных клеток нервной ткани и кроветворных клеток печени (0,5×10⁸ клеток в 1 мл).

Через 6 месяцев у больного появились сокращение приводящих и отводящих мышц бедер, опустился уровень нарушений чувствительности на 4 сегмента. Полностью контролирует акт мочеиспускания и дефекации.

2) Больная А-ва Т. (1981 г. р.). При нырянии в бассейн 10.01.2003 г. получила переломовывих С5 позвонка с синдромом полного поперечного перерыва спинного мозга. В порядке неотложной помощи произведен передний расклинивающий корпоредез с замещение тела С5 аутокостью и имплантатом из никелида титана. Несмотря на проводимую интенсивную реабилитацию, восстановления функции спинного мозга не наступило. 11 ноября 2004 года произведена операция: ламинэктомия С5, трансплантация плазматического биологического трансплантата, импрегнированного фетальными (21-недельной гестации) стволовыми клетками нервной и кроветворной ткани в соотношении 1:25. В проксимальную культю спинного мозга ввели 1,5 мл суспензии клеток выстилки обонятельных нервов (20 тыс. клеток в 1 мл) и 3 мл суспензии фетальных клеток нервной ткани и кроветворных клеток печени (0,8×10⁸ клеток в 1 мл).

Через 5 месяцев отмечено существенное восстановление функции спинного мозга: 1) восстановилось сокращение грудных и межреберных мышц и восстановился грудной тип дыхания (до операции была затруднена речь, а после операции не только говорит в полный голос, но и громко поет); 2) восстановился тонус мышц спины, что позволило больной сесть в коляске (до этого могла только лежать); 3) сила в пальцах рук восстановилась до 2 баллов (появилась возможность держать в руках стакан, ложку, ручку); 4) практически исчезла выраженная спастика в ногах при сохранении тонуса мышц; 5) уровень болевой чувствительности снизился до Th 7 сегмента, 6) началось восстановление функции мочеиспускания, может удержать мочу 4-5 часов, чувствует позыв (до трансплантации было истинное недержание). Данные нейромиографии: после трансплантации наблюдается восстановление проводимости справа на 30%, слева - на 42% (до операции - полное отсутствие проводимости электрического сигнала.

1. Средство для лечения повреждений спинного и головного мозга, характеризующееся тем, что оно представляет собой сгусток плазмы крови человека, содержащий фетальные клетки нервной и кроветворной ткани в соотношении 1:(5-30).

2. Средство по п.1, содержащее клетки фетуса 16-22-недельной гестации.