Полипептид и композиция, обладающие активностью ксиланазы, применение полипептида, полинуклеотид, кодирующий полипептид, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, способ получения полинуклеотида, способ обработки растительного или ксилансодержащего материала

Полипептид и композиция, обладающие активностью ксиланазы, применение полипептида, полинуклеотид, кодирующий полипептид, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, способ получения полинуклеотида, способ обработки растительного или ксилансодержащего материала

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым ксиланазам, к таким как ксиланазы из Talaromyces, и их использованию в разложении ксилана в целлюлозе. Ксиланазы находят применение в хлебопечении, в кормах для животных (для улучшения переработки кормов) и в производстве бумаги.

Предпосылки к созданию изобретения

Состав клеточных стенок растений сложен и изменчив и содержит несколько углеводных биополимеров. Полисахариды главным образом находятся в форме длинных цепей целлюлозы (основной структурный компонент клеточной стенки растений), гемицеллюлозы (включающей в себя различные цепи β-ксилана, такие как ксилоглюканы), пектин и лигнин. Наиболее распространенными гемицеллюлозами являются ксиланы и их производные, такие как арабиноксилан и ксилогликан.

Растительные гемицеллюлозы включают в себя ксилан, арабиноксилан, глюкуроноарабиноксилан и ксилоглюкан. Ксилан (CAS Registry No. 9014-63-5) состоит из основной цепи β-1,4-связанных D-ксилопиранозильных звеньев, необязательно замещенных боковыми цепями, такими как арабиноза и/или остатки глюкуроновой кислоты. Эта структура представляет собой

→4)-β-D-Xylp-(1→4)-β-D-Xylp(2←1A)-(1→4)-β-D-Xylp-(1→4)-β-D-Xylp(3←1B)-(1→

(Xylp=ксилопиранозильное звено; A=α-(4-О)-метил-(D-глюкуронопиранозильное звено), иногда ацетил; и B=α-(L-арабинофуранозильное звено), иногда ацетил).

Ксиланы могут составлять более 30% сухого веса наземных растений. Следовательно, ксиланы представляют собой важный компонент материалов природных источников, которые используются в промышленном производстве, начиная от хлебопечения, улучшения кормов для животных до изготовления бумаги.

Существует основное различие между однодольными растениями (например, злаковые и травы) и двудольными растениями (например, клевер, рапсовые и соевые) и между семенными и вегетативными частями растений. Однодольные растения характеризуются присутствием арабиноксилановых комплексов как главного каркаса гемицеллюлозы, а основной структурой гемицеллюлозы в двудольных растениях является ксилоглюкановый комплекс. В двудольных растениях обнаружены более высокие концентрации пектина, чем в однодольных растениях. Семена обычно имеют высокое содержание пептических веществ, но относительно низкое содержание целлюлозной ткани.

Ферменты, разлагающие целлюлозу, используют для обработки растительного материала в пищевых продуктах, а также при применении кормов или в качестве пищевых или кормовых добавок благодаря их способности действовать на основные компоненты клеточной стенки.

Большинством ферментов, разлагающих целлюлозу, пригодных для промышленного применения, оказываются ксиланазы с относительно низкой молекулярной массой и умеренной стабильностью при высоких температурах. Однако для определенных применений желательно использовать ксиланазы с относительно высокой термостабильностью. В том случае, если ксиланазы применяются в качестве кормовых добавок для животных, тогда предпочтительна высокая термостабильность, поскольку в процессе гранулирования кормов для животных применяют высокие температуры.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новой ксиланазе, обладающей способностью расщеплять β-D-ксилан, который присутствует в растительном материале. Эта ксиланаза также может обладать способностью гидролизовать арабиноксилан (или иметь арабиноксиланазную активность) и арил-β-D-ксилопиранозид (или иметь ксилозидазную активность).

Соответственно настоящее изобретение относится к (изолированному) полипептиду β-ксиланазы, содержащему:

(i) аминокислотную последовательность SEQ ID No:2; или

(ii) вариант последовательности (i), обладающий способностью расщеплять β-D-ксилан; или

(iii) фрагмент последовательностей (i) или (ii), обладающий способностью расщеплять β-D-ксилан.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему:

(a) последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID No.1 или последовательность, кодирующую полипептид по данному изобретению;

(b) последовательность, комплементарную, или гибридизующуюся с последовательностью, определенной в (а);

(c) фрагмент последовательности (a) или (b);

(d) последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную последовательности, определенной в (a), (b) или (c);

или

(e) последовательность, которая является генетически вырожденной по отношению к любой из последовательностей, определенных в (а)-(d).

Изобретение также относится к:

- вектору (например, экспрессирующему), включающему в себя полинуклеотид по данному изобретению и который может обладать способностью экспрессировать полипептид по данному изобретению;

- клеточной линии, включающей в себя вектор по данному изобретению;

- способу получения полипептида по данному изобретению, который включает в себя поддержание клеточной линии по данному изобретению в условиях, пригодных для экспрессии полипептида, и, если необходимо, выделение полипептида;

- способу разложения β-D-ксилана, причем способ предусматривает взаимодействие материала, содержащего β-D-ксилан с полипептидом по данному изобретению; и

- способу идентификации вещества, модулирующего активность ксиланазы, заключающемуся во взаимодействии полипептида по данному изобретению с тестируемым веществом в присутствии β-D-ксилана и наблюдении за активностью или обнаружении какого-либо изменения активности.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID No.1 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую ксиланазу по настоящему изобретению из Talaromyces emersonii;

SEQ ID No.2 представляет собой аминокислотную последовательность ксиланазы; и

SEQ ID Nos.3 и 4 синтетические праймеры ПЦР, гибридизующиеся с SEQ ID No.1.

Подробное описание изобретения

A. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду (например, выделенному и/или очищенному), кодирующему полипептид по данному изобретению. Настоящее изобретение, таким образом, относится к полинуклеотиду, кодирующему ксиланазу, аминокислотная последовательность которой приведена в SEQ ID No.2 (как, например, зрелая последовательность из аминокислот 23-408). Далее, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, имеющий существенную гомологию аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No.2. Также включен полинуклеотид, выбранный из:

(a) полинуклеотида, включающего в себя нуклеотидную последовательность (например, полинуклеотиды 69-1224), приведенную в SEQ ID No.1, или комплементарную ей;

(b) полинуклеотида, включающего в себя нуклеотидную последовательность, обладающую способностью (например, селективно) гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID No.1, или с ее фрагментом;

(c) полинуклеотида, включающего в себя нуклеотидную последовательность, обладающую способностью (например, селективно) гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна приведенной в SEQ ID No.1, или ее фрагментом; и/или

(d) полинуклеотида, включающего в себя полинуклеотидную последовательность, которая является генетически вырожденной по отношению к полинуклеотиду, определенному в (a), (b) или (c).

Полинуклеотид по данному изобретению также включает в себя полинуклеотид, который:

(a) кодирует полипептид, обладающий ксиланазной активностью, причем полинуклеотид представляет собой:

(1) кодирующую последовательность SEQ ID No.1 (например, полинуклеотиды 69-1224);

(2) последовательность, селективно гибридизующуюся с последовательностью, которая комплементарна определенной в (1); или

(3) последовательность, которая является генетически вырожденной по отношению к последовательности, определенной в (1) или (2); или

(b) представляет собой последовательность, комплементарную полинуклеотиду, определенному в (a).

Ссылки на SEQ ID No.1 могут быть заменены зрелой кодирующей последовательностью (полинуклеотиды 69-1224), если иное не оговорено особо.

Гибридизующиеся последовательности

Термин «способный к гибридизации» означает, что полинуклеотид-мишень по данному изобретению может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, используемой в качестве зонда (например, нуклеотидная последовательность, приведенная в SEQ ID No.1, или ее фрагмент или последовательность, комплементарная ей) на уровне, значительно выше фонового. Данное изобретение также включает в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие ксиланазу или ее варианты, а также и нуклеотидные последовательности, комплементарные им. Нуклеотидная последовательность может быть РНК или ДНК и, таким образом, включает в себя геномную ДНК, синтетическую ДНК или кДНК. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность ДНК и более предпочтительно последовательность кДНК. Обычно полинуклеотид данного изобретения содержит непрерывную последовательность нуклеотидов, способную к гибридизации при селективных условиях с кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной (например, зрелой) кодирующей последовательностью SEQ ID No.1. Такие нуклеотиды могут быть синтезированы в соответствии с методами, хорошо известными в данной области¹.

Полинуклеотид данного изобретения может гибридизоваться с кодирующей последовательностью или с последовательностью, комплементарной (например, зрелой) кодирующей последовательности SEQ ID No.1 на уровне, значительно выше фонового. Фоновая гибридизация может происходить, например, из-за присутствия других кДНК в кДНК-библиотеке. Уровень сигнала (например, образуемый взаимодействием между полинуклеотидом данного изобретения и кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной кодирующей последовательности) обычно, по меньшей мере, в 10 раз, предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз, выше, чем при взаимодействии между другими полинуклеотидами и (например, зрелой) кодирующей последовательностью SEQ ID No.1. Сила взаимодействия может быть измерена, например, с помощью радиоактивно меченного зонда, например ³²P. Обычно селективная гибридизация может быть выполнена в условиях низкой жесткости (0,3 M хлорид натрия и 0,03 M цитрат натрия при приблизительно 40°C), средней жесткости (например, 0,3 M хлорида натрия и 0,03 M цитрата натрия при приблизительно 50°C) или высокой жесткости (например, 0,3 M хлорида натрия и 0,03 M цитрата натрия при приблизительно 60°C). Гибридизация может быть выполнена в любых подходящих условиях, известных в этой области¹, и в качестве инструкции низкая жесткость может быть 2×SSC при 55°C, средняя жесткость может быть 0,5-1,0×SSC при 60°C и высокая жесткость может быть от 0,1 или 0,2×SSC при 60°C или выше (например, при 68°C), все при 0,5% SDS.

Модификации

Полинуклеотиды данного изобретения могут состоять из ДНК или РНК. Они могут быть одно- или двухцепочечными. Они также могут быть полинуклеотидами, которые содержат в себе один или несколько синтетических или модифицированных нуклеотидов. В существующем уровне техники известен ряд различных видов модификаций полинуклеотидов. Они включают в себя метилфосфонатные и фосфоротиоатные каркасы и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей на 3'- и/или 5'-концах молекулы. Для целей настоящего изобретения следует понимать, что полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть модифицированы любыми способами, известными в данной области.

Следует понимать, что специалисты в данной области могут, используя обычные методики, произвести нуклеотидные замены, не влияющие на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами данного изобретения, основываясь на частоте использования кодонов любого конкретного организма-хозяина, например, в котором экспрессируются полипептиды данного изобретения.

Кодирующая последовательность (например, зрелая) SEQ ID No.1 может быть модифицирована нуклеотидными заменами, например, от или до 1, 2 или 3 до 10, 25, 50 или 100 замен. Альтернативно или дополнительно полинуклеотид может быть модифицирован одной или несколькими вставками, и/или делециями, и/или удлинением с одного или с обоих концов. Модифицированный полинуклеотид обычно кодирует полипептид, имеющий ксиланазную активность. Могут быть получены вырожденные замены и/или могут быть получены замены, приводящие в результате к консервативным заменам аминокислот, при которых транслируется модифицированная последовательность, например, как рассмотрено далее в отношении полипептидов.

Гомологи

Нуклеотидная последовательность, обладающая способностью к селективной гибридизации с (например, последовательностью, комплементарной) кодирующей последовательностью ДНК SEQ ID No.1 (или нуклеотидами 69-1224) может иметь, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности (или гомологию) к кодирующей последовательности SEQ ID No.1. Это может быть в области, по меньшей мере, из 20, предпочтительно, по меньшей мере, из 30 или 60, например, по меньшей мере, из 100, по меньшей мере, из 200, более предпочтительно, по меньшей мере, из 300 смежных нуклеотидов, или, оптимально, по всей длине SEQ ID No.1.

Любое сочетание вышеупомянутых степеней гомологии и минимального размера может быть использовано для определения полинуклеотидов данного изобретения, причем более жесткие сочетания (т.е. с большей гомологией на большей протяженности) предпочтительны. Так, например, один аспект данного изобретения образует полинуклеотид, представляющий собой, по меньшей мере, 80% или 90% гомолог по 25, предпочтительно по 30 нуклеотидам, как и полинуклеотид, представляющий собой, по меньшей мере, 90% гомолог по 40 нуклеотидам.

Гомологи полинуклеотидной (или белковой) последовательности обычно имеют, по меньшей мере, 70% гомологию, предпочтительно, по меньшей мере, 80, 90%, 95%, 97% или 99% гомологию, например по области, по меньшей мере, 20, 25, 30, 100 более близких нуклеотидов (или аминокислот). Гомология может быть подсчитана на основании аминокислотной идентичности (иногда упоминаемой как «жесткая гомология»).

Например, UWGCG Package предлагает программу BESTFIT, которая может быть использована для подсчета гомологии (например, использованы ее настройки по умолчанию⁵). Алгоритмы PILEUP и BLAST могут быть использованы для подсчета гомологии или выравнивания последовательности (как, например, определение эквивалентных или аналогичных последовательностей, например, по настройке по умолчанию^6,7).

Программное обеспечение для выполнения BLAST анализов доступно через Национальный Центр Биотехнологической Информации (http://www.ncbi.nhn.nih.gov/). Этот алгоритм заключается в первом определении пары последовательности высокой отметки (HSPs) путем определения коротких слов длины W в искомой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой позитивно оцениваемой пороговой отметке T при выравнивании со словом той же длины в последовательности базы данных. T называется пороговой отметкой соседнего слова^6,7. Эти исходные совпадения соседних слов действуют как затравка для инициации поиска для нахождения HSP, содержащих их. Совпадения слов распространены в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличена кумулятивная отметка выравнивания. Удлинения при совпадениях слов в каждом направлении останавливаются когда: кумулятивная отметка выравнивания выпадает количеством Х из ее максимально достигаемого значения; кумулятивная отметка принимает значение нуля или ниже вследствие аккумуляции одного или нескольких остаточных выравниваний; или при достижении конца любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует в качестве настроек по умолчанию длину слова (W) 11, оценку по матрице⁸ выравнивания BLOSUM62 (B) 50, математическое ожидание (E) 10, M=5, N=4, и сравнение обеих цепей.

Алгоритм BLAST проводит статистический анализ сходства между двумя последовательностями⁹. Одно измерение сходства, предлагаемое алгоритмом BLAST, представляет собой вероятность наименьшей суммы (P(N)), предусматривающее указание вероятности, при которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями произошло бы случайно. Например, последовательность, предположительно сходная с другой последовательностью, если вероятность наименьшей суммы в сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше, чем примерно 1, предпочтительно меньше чем примерно 0,1, более предпочтительно менее чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем 0,001.

Праймеры и зонды

Полинуклеотиды по данному изобретению содержат и могут быть использованы в качестве праймера, например ПЦР праймера, праймера для реакции альтернативной амплификации, зонда, или эти полинуклеотиды могут быть клонированы в векторы. Такие праймеры, зонды и другие фрагменты составляют в длину, по меньшей мере, или вплоть до 20, 25, 30 или 40, например, по меньшей мере, 25, 30 или 40 нуклеотидов. Обычно они бывают до 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 или 300 нуклеотидов в длину, или это число (даже вплоть до нескольких нуклеотидов как 5 или 10 нуклеотидов) короткой (например, зрелой) кодирующей последовательности SEQ ID No.1.

В общем, праймеры будут получены синтетическими способами, включающими в себя пошаговое получение требуемой нуклеотидной последовательности по одному нуклеотиду за один цикл. Методики выполнения этого с использованием автоматизированных технологий легко доступны в данной области. Примеры праймеров по данному изобретению приведены в SEQ ID Nos. 3 и 4.

Более длинные полинуклеотиды обычно получают рекомбинантными способами, например с использованием ПЦР (полимеразно-цепной реакции) методик клонирования. Это включает в себя получение пары праймеров (например, приблизительно 15-30 нуклеотидов) к области ксиланазы, которую требуется клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученных из клетки-мишени (например, дрожжевой, бактериальной, растительной, прокариотической или грибковой), предпочтительно штамм Talaromyces, проведения полимеразно-цепной реакции в условиях, которые обеспечивают амплификацию требуемой области, выделение амплифицированного фрагмента (например, очисткой реакционной смеси на агарозном геле) и восстановление амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы с включением в них сайтов распознавания соответствующего фермента рестрикции, так что амплифицированная ДНК может быть клонирована в соответствующий вектор клонирования.

Такие методики могут быть использованы для получения целой или части описанной здесь ксиланазной последовательности. Геномные клоны, соответствующие кДНК SEQ ID No. 1, или ген ксиланазы, содержащий, например, интронные и промоторные области также входят в данное изобретение и также могут быть получены аналогичным образом (например, рекомбинантные способы, ПЦР, методики клонирования), исходя из геномной ДНК из клеток грибов, дрожжей, бактерий, растений или прокариотов.

Полинуклеотиды или праймеры могут содержать распознаваемую метку, например радиоактивную или нерадиоактивную метку. Подходящие метки включают в себя радиоизотопы, такие как ³²Р или ³⁵S, ферментные метки, или другие белковые метки, такие как биотин. Такие метки могут быть добавлены к полинуклеотидам или праймерам по данному изобретению и могут быть обнаружены с использованием известных методик.

Полинуклеотиды, меченые или немеченые, могут быть использованы в исследованиях, основанных на нуклеиновых кислотах, для обнаружения или секвенирования ксиланазы или ее вариантов в образце (например, в грибах). Такие исследования для обнаружения в основном включают в себя приведение образца (например, грибкового), (предположительно) содержащего ДНК, в контакт с зондом или праймером по данному изобретению в условиях гибридизации и обнаружение каких-либо дуплексов, образованных между зондом и нуклеиновой кислотой в образце. Такое обнаружение может быть осуществлено с использованием методик, таких как ПЦР, или иммобилизацией зонда на твердой подложке, удаление нуклеиновой кислоты, которая не гибридизовалась с зондом в образце, и затем выявление нуклеиновой кислоты, которая гибридизовалась с зондом. Альтернативно, нуклеиновая кислота образца может быть иммобилизована на твердой подложке, и может быть определено количество связавшегося зонда.

Зонды по настоящему изобретению могут быть удобно упакованы в форме набора для исследования в подходящий контейнер. В этих наборах зонды могут быть связаны с твердой подложкой, если формат исследования, для которого сконструирован данный набор, требует такого связывания. Набор также может содержать реактивы для обработки исследуемых образцов, гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой в образце, контрольные реактивы, инструкции и подобное.

Предпочтительно полинуклеотид по данному изобретению получен из того же организма, что и полипептид, такого как гриб, в частности гриба рода Talaromyces.

Полинуклеотиды по данному изобретению также включают в себя варианты последовательности SEQ ID No.1, которые обладают ксиланазной активностью. Варианты могут быть образованы удлинениями, заменами и/или делециями и могут обладать способностью расщеплять β-D-ксилановый полимер.

Получение полинуклеотидов

Полинуклеотиды, не имеющие 100% идентичности с (например, зрелой кодирующей последовательностью) SEQ ID No.1, но подпадающие под объем притязаний данного изобретения, могут быть получены в соответствии с рядом способов. Так, варианты описанной здесь последовательности ксиланазы могут быть получены, например, зондированием библиотек геномной ДНК, полученных из ряда организмов, например тех, которые указаны в качестве источников полипептидов по данному изобретению. Кроме того, могут быть получены другие грибковые, растительные или прокариотические гомологи ксиланазы и такие гомологи, и их фрагменты в общем будут обладать способностью к гибридизации с SEQ ID No.1. Такая последовательность может быть получена зондированием библиотек кДНК или библиотек геномной ДНК из других видов, и зондирование таких библиотек зондами, содержащими всю последовательность или часть SEQ ID No.1 в условиях средней или высокой жесткости (как описано ранее). Зонды нуклеиновой кислоты, содержащие целую последовательность или часть SEQ ID No.1, могут быть использованы для зондирования библиотек кДНК из других видов, таких, которые описаны как источники для полипептидов по данному изобретению.

Межвидовые гомологи также могут быть получены с использованием вырожденной ПЦР, которая использует праймеры, сконструированные для последовательностей-мишеней в пределах вариантов и гомологов, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности. Праймеры могут содержать одно или несколько вырожденных положений и будут использованы в условиях меньшей жесткости, чем та, которая используется для клонирования последовательностей с единой последовательностью праймеров против известных последовательностей.

Альтернативно, такие полинуклеотиды могут быть получены сайт-направленным мутагенезом последовательностей ксиланазы или их вариантов. Это может быть применимо в тех случаях, когда, например, для последовательностей требуются молчащие замены кодонов в последовательностях для оптимизации преимущественности кодонов для конкретной клетки-хозяина, в которой экспрессируются полинуклеотидные последовательности. Другие изменения последовательностей могут требоваться для введения сайтов распознавания ферментов рестрикции или для изменения свойств или функций полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.

Данное изобретение относится к двухцепочечным полинуклеотидам, включающим в себя полинуклеотид по данному изобретению и комплементарный ему.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды данного изобретения, описанные ниже. Поскольку такие полинуклеотиды будут использованы в качестве последовательностей для рекомбинантного получения полипептидов по данному изобретению, то им необязательно обладать способностью к гибридизации с последовательностью SEQ ID No.1, хотя обычно это желательно. Иначе, такие полинуклеотиды могут быть помечены, использованы и изготовлены, как описано выше, если требуется. Фрагменты ДНК могут быть приготовлены с использованием ПЦР методики со специфическими праймерами.^33,34

B. Полипептиды

Настоящее изобретение относится к (например, существенно очищенной и/или выделенной) ксиланазе и ее вариантам. Полипептиды по данному изобретению могут, по существу, состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID No.2, или ее части (такой, как зрелая последовательность с положения 23 до 408), или ее варианта. Полипептиды также могут кодироваться полинуклеотидами по данному изобретению, как описано выше. Ссылки на SEQ ID No.2 могут быть заменены только зрелой последовательностью (остатки Ala²³ до Leu⁴⁰⁸), если в контексте не требуется другого.

Полипептиды по данному изобретению могут быть активными в отношении как арабиноксилана, так и арил-β-D-ксилозидов (таких, которые имеют арабиноксиланазную и ксилозидазную активность).

Полипептид по данному изобретению может быть в изолированной или существенно очищенной форме. Понятно, что полипептид может быть смешан с носителями или разбавителями, которые не будут мешать намеченным целям и/или функции полипептида, и все же будет считаться по существу выделенным. Обычно полипептид включают в препарат, в котором более чем 20%, например более чем 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% или 99% от веса полипептида в препарате составляет полипептид по данному изобретению. Эти препараты представляют собой относительно чистые соединения: для каких-то применений полипептид может составлять до 10%, 5%, 2%, 1% или даже не более чем 0,5% от композиции. Могут быть использованы обычные способы очистки и/или синтеза белков согласно данному изобретению¹. Для некоторых составов (например, для нефармацевтического применения) количество присутствующего полипептида может быть небольшим, например от 0,01 до 10%, так например от 0,1 до 5%, или 2% или даже от 0,2 до 1%.

Предпочтительно полипептид по данному изобретению может быть получен из микроорганизма, который обладает геном, кодирующим фермент с ксиланазной активностью. Более предпочтительным микроорганизмом является гриб и оптимально нитчатый гриб. Предпочтительными организмами являются, таким образом, организмы рода Talaromyces, такие виды как Talaromyces emersonii (например CBS 393.64 или 814.70).

Активность

Полипептид по данному изобретению может иметь один или несколько из следующих признаков, а именно;

(1) обладает β-D-ксиланазной активностью;

(2) имеет оптимум pH в диапазоне от 2 до 6, так например от 3 до 5, оптимально от 3,5 до 5,0;

(3) имеет оптимальную активность при температуре от 50 до 95°C, так например от 70 до 90°C, оптимально от 75 до 85°C;

(4) имеет молекулярную массу (дегликозилированный) от 30 до 50 кДа, предпочтительно от 35 до 45 кДа, оптимально от 40 до 44 кДа или (гликозилированный) от 50 до 75 кДа, предпочтительно от 55 до 70 кДа, оптимально от 60 до 66 кДа; и/или

(5) имеет изоэлектрическую точку от 3,0 до 3,6.

Полипептид может иметь активность EC.3.2.1.8. Предпочтительно полипептид из Семейства 10 (прежде F-тип).

«Ксиланазная активность» определена как способность расщеплять целлюлозу или β-D-ксилановый полимер (например, обнаруженный в растениях, например овес или ячмень). Следовательно, такая активность позволяет расщеплять β-D-ксилан, как например между соседними ксилопиранозильными конечными или неконечными звеньями. Предпочтительно расщепление происходит по [ксилопиранозил (1→4) ксилопиранозильной] связи. Полипептид может предпочтительно расщеплять между двумя соседними (например, незамещенными) звеньями. Следовательно, может иметь эндоактивность (т.е. быть эндоксиланазой). Полимер-субстрат может быть или не быть замещенным. Он также может иметь экзоактивность (т.е. быть экзоксиланазой), такой как отщепление концевых ксилопиранозильных звеньев. Предпочтительно полипептид не обладает глюканазной активностью.

Полипептиды по данному изобретению также могут быть активными (или проявлять активность) в отношении арабиноксилана. Арабиноксилан представляет собой подгруппу ксилана с L-арабино-фуранозильными боковыми цепями, связанными с C-2 или C-3, или и тем и другим вместе, ксилозных остатков главной цепи. Арабиноксилан имеет CAS Регистрационный №98513-12-3. Он может иметь структуру (1→4)-β-D-ксилана с 3-связанными α-L-арабинозными ветвями. Этот тип ксилана обычно встречается в ксилане овсяной шелухи.

Эта активность представляет собой способность гидролизовать необработанный арабиноксилан. Это означает, что арабиноксилан не был обработан или модифицирован, например, не был обработан арабинофуранозидазой. Этот фермент может удалять арабинозные боковые цепи. Полипептиды по данному изобретению способны гидролизовать (расщеплять) арабиноксилан, который не был предварительно обработан арабинофуранозидазой.

Арабиноксилан встречается в овсяной шелухе, и в этом подробном описании активность полипептида (EXU, также как и PAHBAH активность) определена по арабиноксилану из пшеничной муки (с соотношением арабиноза:ксилоза 41:59). Исследование арабиноксилана (как субстрата) описано далее в примерах.

Полипептиды по данному изобретению могут также иметь ксилозидазную активность, например обладать способностью гидролизовать замещенные (например, арил)-β-D-ксилозиды (также известные как ксилопиранозиды). Например, они могут быть способны к гидролизу 4-метилумбеллиферил-β-D-ксилопиранозида (CAS Регистрационный №6734-33-4, полученный из Sigma Chemical Co). Эта активность представляет собой способность высвобождать флуоресцентную метку из субстрата. Она также может гидролизовать (быть активной в отношении) 5-бромо-4-хлоро-3-индоксил-β-D-ксилопиранозида (CAS Регистрационный №207606-55-1). Это сочетание активности в отношении как арабиноксилана, так и арил-β-D-ксиланозида является необычным^36,37 и является новым сочетанием активностей для полипептида, обладающего ксиланазной активностью.

Варианты и гомологи

Полипептид по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No. 2, или существенно гомологичную последовательность, или фрагмент одной из двух последовательностей и может обладать ксиланазной активностью. Вообще, предпочтительна природная аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID No.2.

В частности, полипептид по данному изобретению может содержать:

a. (зрелую) полипептидную последовательность SEQ ID No.2 (остатки с 23 по 408) или целую последовательность SEQ ID No.2;

b. природный вариант или его межвидовой гомолог; или

c. белок, по меньшей мере, с 70%, по меньшей мере, с 75%, по меньшей мере, с 80%, по меньшей мере, с 90%, по меньшей мере, с 95%, по меньшей мере, с 98% или, по меньшей мере, с 99% идентичностью последовательности к (a) или (b).

Вариант может быть одним из встречающихся в природе, например в грибковых, бактериальных, дрожжевых или растительных клетках и который может функционировать в значительной мере сходным образом с белком SEQ ID No.2, например иметь ксиланазную активность. Подобным образом межвидовой гомолог белка будет представлять собой эквивалентный белок, который встречается в природе в другом виде и который может функционировать как ксиланаза. Варианты включают в себя аллельные варианты или из того же штамма, что и полипептид по данному изобретению, или из другого штамма, но того же рода, или того же вида.

Варианты и разновидности гомологов могут быть получены следующими способами, описанными здесь для получения полипептида SEQ ID No.2, выполнение таких способов на соответствующем источнике клеток, например бактериальной, дрожжевой, грибковой или растительной клетке. Также возможно использовать зонд, определенный выше, для зондирования библиотек, составленных из дрожжевых, бактериальных, грибковых или растительных клеток для получения клонов, включающих в себя варианты или межвидовые гомологи. На клоны можно воздействовать общепринятыми методиками для получения полипептида по данному изобретению, которые затем будут получены рекомбинатным или синтетическим известным способом.

Полипептид по данному изобретению предпочтительно имеет к ней, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к белку SEQ ID No.2, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательности, например по области, протяженностью, по меньшей мере, 40, 60, 100, 150, 200, 300 или 400 аминокислот или по всей длине SEQ ID No.2.

Последовательность полипептида SEQ ID No.2 и вариантов и межвидовых гомологов может быть, следовательно, модифицирована для обеспечения полипептидов по данному изобретению. Может быть сделано, например от 1, 2 или 3 или до 10, 20, 30, 50 или 100 аминокислотных замен. Может быть произведено такое же число делеций или вставок. Эти изменения могут быть произведены за пределом областей, необходимых для функционирования полипептида, и также могут по-прежнему давать в результате активный фермент. Модифицированный полипептид в основном сохраняет активность ксиланазы.

Полипептиды по данному изобретению включают в себя фрагменты вышеупомянутых полноразмерных полипептидов и их вариантов, включая в себя фрагменты последовательности, представленной в SEQ ID No.2. Такие фрагменты обычно сохраняют активность ксиланазы. Фрагменты могут составлять в длину, по меньшей мере, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200 или 250 аминокислот, или быть на это количество аминокислот короче полной длины последовательности (показанной в SEQ ID No.2). Фрагменты или варианты включают в себя или представляют связывающую β-D-ксилан область или расщепляющую β-D-ксилан область.

Полипептиды по данному изобретению при необходимости могут быть получены синтетическими способами, хотя обычно их получают рекомбинантно, как описано ниже. Они могут быть модифицированы, например, путем добавления остатков гистидина или метки T7 для того, чтобы способствовать их идентификации или очистке, или путем добавления сигнальной последовательности, способствующей их секреции из клетки.

Термин «варианты» относится к полипептидам, которые могут иметь такое же основное свойство или основную биологическую функцию, что и ксиланаза, и включают в себя аллельные варианты. Основным свойством ксиланазы является то, что она является ферментом, который может расщеплять 1→4 связи в β-D-ксилане. Полипептид, обладающий тем же основным свойством, что и ксиланаза, может быть идентифицирован исследованием разложения целлюлозы, как описано далее.

Варианты SEQ ID No.2 также включают в себя последовательности, которые отличаются от SEQ ID No.2, но которые не обязательно происходят из природной ксиланазы. Эти варианты могут быть описаны как имеющие % гомологии к SEQ ID No.2 или имеющие ряд замен этой последовательности. Альтернативно, вариант может кодироваться полинуклеотидом, который гибридизуется с SEQ ID No.1.

Варианты могут быть определены сходным образом для вариантов SEQ ID No.1. Следовательно, варианты могут содержать иную последовательность, происходящую из других штаммов Talaromyces. Другие варианты могут быть установлены из других штаммов Talaromyces путем поиска ксиланазной активности и клонирования и установления последовательности как раньше. Варианты могут содержать делеции, модификации или дополнения единичных аминокислот или групп аминокислот в пределах белковой последовательности, пока пептид сохраняет основную биологическую функцию ксиланазы.

Могут быть произведены консервативные замены, например, согласно следующей таблице 10. Аминокислоты одного и того же блока во второй колонке и предпочтительно в одной и той же строке в третьей колонке могут быть заменены друг другом. Предпочтительно замены не влияют на укладку или активность полипептида.

Таблица 10
АЛИФАТИЧЕСКИЕ	Неп