Способы и материалы для создания и применения трансгенных организмов, дикамба-разрушающих

Способы и материалы для создания и применения трансгенных организмов, дикамба-разрушающих

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к трансгенным организмам, которые способны разрушать гербицид - дикамбу, включая трансгенные растения, которые могут быть толерантными к дикамбе. Также изобретение касается дикамба-разрушающих ферментов и молекул ДНК и ДНК-конструкций, кодирующих дикамба-разрушающие ферменты. Также изобретение относится к способу борьбы с сорняками на плантациях толерантных к дикамбе трансгенных растений и к способу удаления дикамбы из загрязненного им материала (биологическая нейтрализация). Наконец, изобретение относится к способам отбора трансформантов, основанным на толерантности к дикамбе или на выявлении флуоресценции 3,6-дихлорсалициловой кислоты, образующейся в процессе разрушения дикамбы.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Гербициды широко применяются в сельскохозяйственном производстве. Их эффективность часто определяется способностью подавлять рост сорняков в посевах культурных растений и толерантностью культурных растений к такому гербициду. Если же культурное растение не толерантно к гербициду, то гербицид обусловливает либо снижение продуктивности данной культуры, либо вообще приводит к ее полному уничтожению. С другой стороны, если гербицид не является достаточно мощным, то он может сохранять такой уровень роста сорняков на плантации культурного растения, который, со своей стороны, обусловит снижение продуктивности культурного растения. Соответственно, с экономической точки зрения желательным является создание сельскохозяйственных культурных растений, которые бы были толерантными к гербицидам. С точки зрения защиты вод и параметров внешней среды в районах расположения сельскохозяйственных угодий также желательно развитие технологий, которые бы обеспечивали разрушение гербицидов в случае аварийных выбросов гербицидов или в случаях неприемлемо высокого уровня загрязнения почвы и вод.

Гены, кодирующие ферменты, которые инактивируют гербициды и другие соединения-ксенобиотики, ранее были выделены у различных прокариотических и эукариотических организмов. В некоторых случаях эти гены были успешно экспрессированы у растений с применением методов генетической инженерии. С использованием такого подхода были разработаны растения, которые являются толерантными к гербицидам: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте (Streber & Willmitzer, 1989, Bio/Technol., 7, 811-816: 2,4-D), бромоксинилу (Stalker et al., 1988, Science, 242, 419-423: торговая марка Buctril), глифозату (Comai et al., 1985, Nature, 317, 741-744: торговая марка Round-Up) и фосфинотрицину (De Block et al., 1987, EMBO J., 6, 2513-2518: торговая марка Basta).

Дикамба (торговая марка Banvel) используется в качестве предвсходового и послевсходового гербицида для борьбы с одно- и многолетними широколистными сорняками и некоторыми злаковыми сорняками в посевах кукурузы, сорго, зерновых культур, кормовых культур, сенокосных трав, пастбищных культур, сахарного тростника, спаржи, дерновых и семенных травяных культур: см. Crop Protect-on Ref., pp.1803-1821 (Chemical & Phamaceutical Press Inc., New York, NY, 11th ed., 1995). К сожалению, дикамба способна повреждать многие сельскохозяйственные культуры (включая бобы, сою, хлопчатник, горох, картофель, подсолнечник, помидор, табак и фруктовые деревья), декоративные растения и деревья, а также другие широколистные растения при контакте с данным гербицидом. Дикамба характеризуется химической стабильностью и в ряде случаев может сохраняться во внешней среде.

Дикамба относится к классу гербицидов на основе бензойной кислоты. Предполагается, что растения, толерантные к гербицидам, основанным на бензойной кислоте, включая дикамбу, могут быть созданы путем внесения в растения антисмыслового гена синтазы 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АСС), антисмыслового гена АСС-оксидазы, гена АСС-деаминазы или их сочетаний. См. заявку на патент под №2165036 (опубликована 16 июня 1996 г.). Однако в этой заявке не представлено никаких экспериментальных данных по анализу такой толерантности.

Известны бактерии, которые способны метаболизировать дикамбу. См. патент США №5445962; Krueger et al., 1989, J. Agricult. Food Chem., 37, 534-538; Cork & Krueger, 1991, Adv. Appl. Microbiol., 38, 1-66; Cork & Khalil, 1995, Adv. Appi. Microbiol., 40, 289-320. Было выдвинуто предположение, что конкретные гены, участвующие в метаболизме дикамбы, осуществляемом этими бактериями, могут быть выделены и использованы для создания резистентных к дикамбе растений и других организмов. См. цитированное выше и Yang et al., 1994, Anal. Biochem., 219, 37-42. Однако до настоящего изобретения такие гены не были идентифицированы и выделены.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет выделенную и по крайней мере частично очищенную дикамба-разрушающую О-деметилазу, выделенную и по крайней мере частично очищенную дикамба-разрушающую оксигеназу, выделенный и по крайней мере частично очищенный дикамба-разрушающий ферредоксин и выделенную и по крайней мере частично очищенную дикамба-разрушающую редуктазу, причем все они определены и описаны ниже.

Также настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу ДНК, включающую последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую оксигеназу, и выделенную молекулу ДНК, включающую последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин и выделенную молекулу ДНК, включающую последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу. Также настоящее изобретение предоставляет ДНК-конструкцию, включающую последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую оксигеназу, последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, или последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, причем каждая кодирующая последовательность ДНК функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию. В дополнение, изобретение предоставляет ДНК-конструкцию, включающую последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую оксигеназу, последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, или последовательность ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, причем каждая последовательность ДНК функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию.

Кроме того, изобретение относится к любой из указанных выше ДНК-конструкций, которые также включают последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, который направляет дикамба-разрушающий фермент(-ы), в органеллы клеток растения или микроорганизма (хлоропласт и/или митохондрию).

Также изобретение предоставляет трансгенную клетку-хозяин, содержащую ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую оксигеназу, ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, или ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, причем каждая ДНК функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию. Кроме того, изобретение предоставляет трансгенную клетку-хозяин, несущую ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую оксигеназу, и ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, или ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, и ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, причем каждая ДНК функционально сзязана с последовательностями, регулирующими экспрессию. ДНК в некоторых вариантах осуществления также может включать последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, который направляет дикамба-разрушающий(-е) фермент(-ы) в органеллы клеток растения или микроорганизма (хлоропласт и/или митохондрию). Трансгенная клетка-хозяин может быть растительной клеткой или прокариотическим или эукариотическим микроорганизмом.

Настоящее изобретение также предоставляет трансгенное растение или часть растения, включающую одну или более клеток, содержащих ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую окскгеназу, ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, или ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, причем каждая ДНК функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию. Кроме того, изобретение также предоставляет трансгенное растение или часть растения, включающую одну или более клеток, содержащих ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую оксигеназу, и ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, или ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий ферредоксин, и ДНК, кодирующую дикамба-разрушающую редуктазу, причем каждая ДНК функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию. В некоторых осуществлениях данная ДНК также включает последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, который направляет дикамба-разрушающий(-е) фермент(-ы) в органеллы клеток растения. Трансгенное растение или часть растения толерантно к дикамбе или характеризуется усилением имеющейся толерантности к дикамбе в результате экспрессии дикамба-разрушающих ферментов.

Также настоящее изобретение предоставляет способ борьбы с сорняками на плантации трансгенных растений, толерантных к дикамбе. Способ включает нанесение такого количества дикамбы на плантацию, которое будет эффективно с точки зрения борьбы с сорняками.

Также настоящее изобретение представляет способы очистки материала, содержащего дикамбу. В одном из вариантов такой способ включает нанесение эффективного количества трансгенного дикамба-разрушающего микроорганизма на материал. В другом осуществлении способ включает нанесение эффективного количества дикамба-разрушающей О-деметилазы или сочетания дикамба-разрушающей оксигеназы, дикамба-разрушающего ферредоксина и дикамба-разрушающей редуктазы на материал.

Также настоящее изобретение предоставляет способ отбора клеток трансформированного растения и трансформированных растений с использованием толерантности к дикамбе в качестве селективного маркера. В одном из осуществлений способ включает трансформацию по крайней мере нескольких растительных клеток в популяции растительных клеток, так что они становятся толерантными к дикамбе, и выращивание полученной в результате популяции растительных клеток в культуральной среде, содержащей дикамбу в концентрации, выбранной таким образом, чтобы трансформированные растительные клетки росли в ней, а нетрансформированные растительные клетки не росли. В другом варианте осуществления способ включает нанесение дикамбы на популяцию растений, предположительно включающей растение, трансформированное таким образом, что они становятся толерантными к дикамбе, причем дикамбу наносят в таком количестве, чтобы трансформированные растения росли, а рост нетрансформированных растений подавлялся.

Наконец, настоящее изобретение предоставляет способ отбора или скрининга трансформированных клеток-хозяев, целых организмов и частей организмов. Способ включает получение популяции клеток-хозяев, целых организмов или частей организмов, которая предположительно включает клетки-хозяева, целые организмы или части организмов, трансформированные таким образом, что они приобретают способность разрушать дикамбу, контактирование популяции клеток-хозяев, целых организмов или частей организма с дикамбой и оценку наличия или уровня флуоресценции вследствие присутствия 3,6-дихлорсалициловая кислоты. 3,6-Дихлорсалициловая кислота образуется в трансформированных клетках-хозяевах, целых организмах или частях организмов в результате разрушения дикамбы, но не может образовываться в нетрансформированных клетках хозяина, целых организмах или частях организмов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Диаграмма схемы предполагаемого транспорта электронов для дикамбы. Электроны от НАД последовательно переносятся с редуктазы_DIC на ферредоксин_DIC и затем на оксигеназу_DIC. Реакция кислорода с субстратом дикамбы c образованием 3,6-дихлорсалициловой кислоты катализируется оксигеназой_DIC. Обозначения: "окис" - окисленный; "восст" - восстановленный.

Фигура 2. Сравнение производной аминокислотной последовательности ферредоксинового компонента дикамбы-O-деметилазы с аминокислотными последовательностями членов адренодоксинового семейства ферредоксинов. На фигуре 2: ferr di6 = ферредоксиновый компонент дикамбы-O-деметилазы Pseudomonas maltophilia DI-6 [SEQ ID NO:5]; fer6 rhoca = ферредоксин Rhodobacter capsulatus [SEQ ID NO:10]; fer caucr = ферредоксин Caulobacter crescentus [SEQ ID NO:11]; thcc rhocr = ферредоксин Rhodococcus erythropolis [SEQ ID NO:12]; putx psepu = ферредоксин Pseudomonas putida [SEQ ID NO:13]; terp psesp = ферредоксин Pseudomonas sp. [SEQ ID NO:14]. Также на фигуре 1 номера 1-3 обозначают три консервативных мотива адренодоксинового семейства бактериальных ферредоксинов.

Фигура 3. Сравнение производной аминокислотной последовательности двух редуктазных компонентов дикамбы-O-деметилазы с аминокислотными последовательностями членов семейства FAD-зависимых пиридиннуклеотидредуктаз. На фигуре 3: red1 di6 = редуктазный компонент дикамбы-O-деметилазы Р. maltophilia DI-6 [SEQ ID NO:7]; red2 di6 = редуктазный компонент дикамбы-O-деметилазы Р. maltophilia DI-6 [SEQ ID NO:9]; AJ002606 = редуктаза Sphingomonas sp. [SEQ ID NO:15]; thcd rhoer = редуктаза R. erythropolis [SEQ ID NO:16]; cama psepu = редуктаза P. putida [SEQ ID NO:17]; tera pscsp = редуктаза Pseudomonas sp. [SEQ ID NO:18]. Также на фигуре 3 номера 1-5 обозначают пять консервативных мотивов FAD-зависимых пиридиннуклеотидредуктаз.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществление изобретения

Предыдущие исследования (Cork & Krueger, Adv. Appi. Microbiol., 36, 1-56 и Yang et al., 1994, Anal Biochem., 219, 37-42) показали, что почвенная бактерия Pseudomonas maltophilia штамма DI-6 способна нарушать гербицидную активность дикамбы в результате одностадийной реакции, в которой дикамба (3,6-дихлор-2-метоксибензойная кислота) превращается в 3,6-дихлорсалициловую кислоту (3,6-DCSA). 3,6-DCSA не обладает гербицидной активностью и для нее не было ранее установлено наличия какого-либо отрицательного действия на растения. Кроме того, 3,6-DCSA легко разрушается нормальной бактериальной флорой, присутствующей в почве.

Описанные здесь эксперименты подтвердили гипотезу Янга с соавт. (Yang et al., цит. выше), согласно которой O-деметилаза контролирует превращение дикамбы с образованием 3,6-DCSA с участием P.maltophilia штамма DI-6, и позволили установить, что О-деметилаза является трехкомпонентной ферментной системой, включающей редуктазу, ферредоксин и оксигеназу. См. примеры 1 и 3, в которых подробно описаны выделение, очистка и характеристика О-деметилазы Р. maltophilia и трех ее компонентов. Схема реакции, катализируемой этими тремя компонентами дикамбы-О-деметилазы, представлена на фигуре 1. Как показано на фигуре 1, электроны от НАД переносятся по короткой электронной цепочке, состоящей из редуктазы и ферредоксина, на конечную оксигеназу, которая катализирует окисление дикамбы с образованием 3,6-DCSA.

В первом осуществлении настоящее изобретение представляет выделенные и по крайней мере частично очищенные дикамба-разрушающие ферменты. Понятие "выделенные" при использовании здесь означает то, что эти ферменты по меньшей мере удалены из клеток, в которых они вырабатываются (т.е. они находятся в составе клеточного лизата). Понятие "по крайней мере частично очищенные" при использовании в данном тексте означает то, что эти ферменты по крайней мере частично были отделены от других компонентов клеточного лизата. Предпочтительно, чтобы ферменты были очищены до такой степени, чтобы полученные ферментные препараты были гомогенными по крайней мере примерно на 70%.

В частности, настоящее изобретение предоставляет выделенную и по крайней мере частично очищенную дикамба-разрушающую О-деметилазу. По использованию в данном тексте "дикамба-разрушающая О-деметилаза" обозначает комбинацию дикамба-разрушающей оксигеназы, дикамба-разрушающего ферредоксина и дикамба-разрушающей редуктазы, все, как определено ниже.

Также настоящее изобретение представляет выделенную и по крайней мере частично очищенную дикамба-разрушающую оксигеназу. При использовании здесь термин "дикамба-разрушающая оксигеназа" обозначает оксигеназу, очищенную из P.maltophilia штамма DI-6, и оксигеназы, аминокислотные последовательности которых гомологичны на уровне по крайней мере примерно 65% (и предпочтительно идентичны), и, более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 75% (и предпочтительно идентичны), и, более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 85% (и предпочтительно идентичны), и, даже более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 95% (и предпочтительно идентичны) по отношению к последовательности оксигеназы P.maltophilia и которые могут участвовать в разрушении дикамбы. "Дикамба-разрушающие оксигеназы" включают мутантные оксигеназы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью оксигеназы P.maltophilia, где одна или более аминокислот добавлены, дилетированы или замещены в составе последовательности оксигеназы P.maltophilia. Такие оксигеназы включают ферментативно активные фрагменты оксигеназы, а также оксигеназы, обладающие определенным процентом гомологии или идентичности по отношению к последовательности оксигеназы P.maltophilia. Активность дикамба-разрушающих оксигеказ может быть определена так, как это описано в примерах 1 и 3.

Также настоящее изобретение предоставляет выделенный по крайней мере частично очищенный дикамба-разрушающий ферредоксин. При использовании здесь термин "дикамба-разрушающий ферредоксин" обозначает ферредоксин, очищенный из P.maltophilia штамма DI-6, и ферредоксины, аминокислотные последовательности которых гомологичны на уровне по крайней мере примерно 65% (и предпочтительно идентичны), и, более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 75% (и предпочтительно идентичны), и, более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 85% (и предпочтительно идентичны), и, даже более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 95% (и предпочтительно идентичны) по отношению к ферредоксину Р.maltophilia, которые могут участвовать в разрушении дикамбы. "Дикамба-разрушающие ферредоксины" включают мутантные ферредоксины, характеризующиеся аминокислотной последовательностью ферредоксина P.maltophilia, где одна или более аминокислот добавлены, делетированы или замещены в составе последовательности ферредоксина P.maltophilia. Такие ферредоксины включают ферментативно активные фрагменты ферредоксина, а также ферредоксины, обладающие определенным процентом гомологии или идентичности по отношению к последовательности ферредоксина P.maltophilia. Активность дикамба-разрушающих ферредоксинов может быть определена так, как это описано в примерах 1 и 3.

Наконец, настоящее изобретение предоставляет выделенную и по крайней мере частично очищенную дикамба-разрушающую редуктазу. По использованию в данном тексте термин "дикамба-разрушающая редуктаза" обозначает редуктазу, очищенную из Р.maltophilia штамма DI-6, и редуктазы, аминокислотные последовательности которых гомологичны на уровне по крайней мере примерно 65% (и предпочтительно идентичны), и, более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 75% (и предпочтительно идентичны), и, более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 85% (и предпочтительно идентичны), и, даже более предпочтительно, гомологичны на уровне по крайней мере примерно 95% (и предпочтительно идентичны) по отношению к редуктазе P.maltophilia, которые могут участвовать в разрушении дикамбы. "Дикамба-разрушающие редуктазы" включают мутантные редуктазы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью редуктазы P.maltophilia, где одна или более аминокислот добавлены, делетированы или замещены в составе последовательности редуктазы P.maltophilia. Такие редуктазы включают обладающие ферментативной активностью фрагменты редуктазы, а также редуктазы, обладающие определенным процентом гомологии или идентичностью по отношению к последовательности редуктазы P.maltophilia. Активность дикамба-разрушающих редуктаз может быть определена так, как это описано в примерах 1 и 3.

Способы определения степени гомологии аминокислотных последовательностей хорошо известны в данной области. Например, компьютерная программа FASTA из программного пакета Genetics Computing Group (GCG; University of Wisconsin, Madison, Висконсин) может быть использована для сравнение последовательностей из различных белковых баз данных, например, Swiss Protein Database.

Дикамба-разрушающие ферменты по настоящему изобретению могут быть выделены и очищены так, как это описано в примерах 1 и 3, из P.maltophilia или других организмов, которые разрушают дикамбу. Другие подходящие организмы включают другие, помимо P.maltophilia штамма DI-6, бактерии, которые разрушают дикамбу. Некоторые штаммы таких бактерий известны и включают многие почвенные бактерии, а также пресноводные бактерии. См. патент США №5445962; Krueger et al., 1989, J. Agricult. Food Chem., 37, 534-538; Cork & Krueger, 1991, Adv. Appi. Microbiol., 38, 1-66; Cork & Khalil, 1995, Adv. Appi. Microbiol, 40, 289-32C. Дикамба-разрушающие бактерии (т.е. бактерии, которые используют дикамбу в качестве единственного источника углерода) обнаружены во многих родах бактерий, включая в качестве неограничивающих примеров Pseudomonas, Sphingomonas, Aeromonas, Xanthomonas, Alcaligenes и Moraxella. Другие дикамба-разрушающие бактерии, могут быть выделены, как были выделены данные штаммы, способами, хорошо известными в данной области.

Предпочтительно, однако, дикамба-разрушающие ферменты по настоящему изобретению получают с применением технологий рекомбинантной ДНК (см. ниже). В частности, мутантные ферменты, характеризующиеся аминокислотной последовательностью фермента P.maltophilia, где одна или более аминокислот добавлены, делетирована или заменены по отношению к аминокислотной последовательности P.maltophilia, получают данным способом с использованием, например, опосредованного олигонуклеотидами мутагенеза, мутагенеза на основе "сканирования линкером", мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакции и тому подобного. См. Ausubel et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience, 1990 и McPherson (ed.), "Directed Mutagenesis: A Practical Approach", IRL Press, 1991.

Во втором осуществлении настоящее изобретение представляет выделенные молекулы ДНК, кодирующие дикамба-разрушающие ферменты по изобретению. Термин "выделенные" при использовании здесь означает, что молекула ДНК была изъята из ее естественной среды или же не является встречающейся в природе молекулой ДНК. Способы получения таких молекул ДНК хорошо известны в данной области. См., например, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY, 1982; Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Например, молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть выделенными кДНК или геномными клонами и могут также включать молекулы РНК. Идентификация и выделение клонов, кодирующих дикамба-разрушающие ферменты P.maltophilia штамма DI-6, описаны в примерах 2 и 4-5. Дополнительные клоны, кодирующие дикамба-разрушающие ферменты, могут быть получены сходным образом. Выделенные клоны или их части могут быть использованы в качестве зондов, предназначенных для идентификации и выделения дополнительных клонов из тех организмов, которые отличаются от организмов, из которых такие клоны были исходно выделены. Подходящие организмы включают бактерии, которые разрушают дикамбу. Как отмечалось выше, в дополнение к P.maltophilia штамма DI-6 известны некоторые другие бактериальные штаммы, способные разрушать дикамбу. См. патент США №5445962; Kruger et al., 1989, J. Agricult. Food Chem., 37, 534-538; Cork & Krueger, 1991, Adv. Appl. MicrobioL, 38, 1-66; Cork & Khalil, 1995, Adv. Appi. Microbiol., 40, 289-320,

Молекулы ДНК по настоящему изобретению также могут быть химически синтезированы с использованием последовательностей выделенных клонов. Такие способы хорошо известны в данной области. Например, последовательности ДНК могут быть синтезированы с помощью метода фосфоамидитного синтеза с применением автоматического ДНК-синтезатора. Химический синтез имеет ряд достоинств. В частности, химический синтез является предпочтительным, поскольку для оптимизации экспрессии могут быть использованы кодоны, которые являются предпочтительными для хозяина, в котором будет экспрессироваться последовательность ДНК. Улучшение параметров экспрессии не требует изменения всех кодонов, однако предпочтительным является изменение тех кодонов, которые редко используются в геноме организма-хозяина. Высокий уровень экспрессии может быть достигнут путем изменения более чем примерно 50% кодонов, более предпочтительно, по крайней мере, примерно 80% кодонов на кодоны, предпочитаемые организмом-хозяином. Предпочтительность использования кодонов в различных клетках-хозяев известна. См., например, "Maximizing Gene Expression", pp.225-285, Reznikoff & Gold (eds.), 1986, PCT WO 97/31115, PCT WO 97/11086, EP 646643, EP 553494 и патенты США W 5689052, 5567862, 5567600, 5552299 и 5017692. Предпочтительности использования кодонов у других клеток-хозяев могут быть определены способами, известными в данной области. Также, с использованием химического синтеза последовательности молекулы ДНК или кодируемого ею белка могут быть легко изменены, например, с целью оптимизации экспрессии (например, путем удаления тех вторичных структур мРНК, которые могут являться помехами для транскрипции и трансляции), добавления уникальных рестрикционных сайтов по стандартным положениям, удаления сайтов расщепления протеазами, и т.д.

В третьем варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет ДНК-конструкции, включающие ДНК, кодирующую дикамба-разрушающий фермент, функционально присоединенную к последовательностям, регулирующим экспрессию. "ДНК-конструкции" определены здесь как конструируемые (не встречающиеся в природе) молекулы ДНК, которые могут использоваться для введения ДНК внутрь клеток-хозяев, и при этом данный термин включает химерные гены, экспрессионные кассеты и векторы.

При использовании здесь термин "функционально присоединенный" означает связывание последовательностей ДНК (включая порядок расположения последовательностей, ориентацию последовательностей и относительный размер отдельных последовательностей) таким образом, чтобы обеспечить экспрессию кодируемых ими белков. Способы функционального присоединения контролирующих экспрессию последовательностей к кодирующим последовательностям хорошо известны в данной области техники. См., например, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY, 1982; Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY, 1989.

"Последовательностями, регулирующими экспрессию" являются последовательности ДНК, участвующие в осуществляемой любым путем регуляции транскрипции или трансляции у прокариот и эукариот. Подходящие последовательности, регулирующие экспрессию, и способы их получения и использования хорошо известны в данной области.

Последовательности, регулирующие экспрессию, должны включать промотор. Промотором может быть любая последовательность ДНК, которая проявляет транскрипционную активность в выбранных клетке-хозяине или организме. Промотор может быть индуцибельным или конститутивным. Он может быть встречающимся в природе (нативным), может включать фрагменты различных встречающихся в природе промоторов или может быть частично или полностью синтетическим. Руководство для конструирования промоторов предоставлено на основании исследований структуры промоторов, таких как работа Harley & Reynolds, 1987, Nucl. Acids Res., 15, 2343-2361. Также может быть оптимизировано расположение промотора по отношению к сайту инициации транскрипции: см., например, Roberts et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 760-764. Много промоторов, подходящих для использования у прокариот и эукариот, хорошо известны в данной области.

Например, конститутивные промоторы, подходящие для использования у растений, включают: промоторы растительных вирусов, такие как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), полноразмерный транскрипционный промотор с дуплицированными энхансерными доменами колимовируса хлоротичной полосатости арахиса (Maiti Shepherd, BBRC 244:440-444 (1998)), промоторы генов метилтрансферазы вируса хлореллы (патент США №5563328); полноразмерный транскрипционный промотор вируса мозаики листьев инжира (патент США №5378619); промоторы таких генов, как ген актина риса (McElroy et al., 1990, Plant Cell, 2, 163-171), ген убиквитина (Christensen et al., 198-9, Plant Mol. Biol., 12, 619-632 и Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol., 18, 675-689), pEMU (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet., 81, 581-588), MAS (Velten et al., 1984, EMBO J., 3, 2723-2730), ген гистона Н3 кукурузы (Lepetit et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 231, 276-285; и Atanassova et al., 1992, Plant J., 2 (3), 291-300), ALS3 Brassica napus (заявка PCT WO 97/41228); промоторы различных генов Agrooacterium (см. патенты США №№4771002, 5102796, 5182200, 5428147).

Индуцибельные промоторы, подходящие для использования в растениях, включают: промотор системы АСЕ1, реагирующий на медь (Mett et al., 1993, PNAS, 90, 4567-4571), промотор гена In2 кукурузы, реагирующий на бензолсульфонамидный гербицидный сафенерс (Hershey et al., 1991, Mol. Gen. Genetics, 227, 229-237; и Gatz et al., 1994, Mol. Gen. Genetics, 243, 32-38), и промотор Tet-репрессорной системы Tn10 (Gatz et al., 1991, Mol. Gen. Genet., 227, 229-237). Особенно предпочтительным индуцибельным промотором для использования в растениях является один из тех промоторов, которые реагируют на индуцирующий агент, на который в норме растения не реагируют. Примером индуцибельного промотора такого типа является индуцибельный промотор гена сфероидного гормона, транскрипционная активность которого индуцируется глюкокортикостероидным гормоном (Schena et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10421). Другие индуцибельные промоторы для использования в растениях описаны в ЕР 332104, РСТ WO 93/21334 и РСТ WO 97/02269.

Промоторы, подходящие для использования в бактериях, включают промотор гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus, гена α-амилазы Bacillus licheniformis, гена BAN-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, гена щелочной протеазы Bacillus subtilis, гена ксилозидазы Bacillus pumilis, промоторы P_R и P_L фага λ и промоторы оперонов lac, trp и tac Escherichia coli. См. РСТ WO 96/23898 и РСТ WO 97/42320.

Промоторы, подходящие для использования в дрожжевых клетках-хозяевах, включают промоторы генов гликолитического пути дрожжей, промоторы генов алкогольдегидрогеназы, промотор ТРI1 и промотор ADH2-4C. См. РСТ WO 96/23898.

Промоторы, подходящие для использования в нитчатых грибах, включают промотор ADH3, промотор tpiA, промоторы генов, кодирующих ТАКА-амилазу Aspergillus oryzae, аспартопротеазу Rhizomucor miehei, нейтральную α-амилазу Aspergillus niger, кислую стабильную α-амилазу А.niger, глюкоамилазу А.niger или Aspergillus awamori, липазу R. miehei, щелочную протеазу А. oryzae, триозофосфатизомеразу A.oryzae и ацетамидазу Aspergillus nidulans. См. РСТ WO 96/23898.

Промоторы, подходящие для использования в клетках млекопитающих, включают промотор SV40, промотор гена металлотионеина, промотор вируса опухоли молочной железы мышей, промотор вируса саркомы Рауша и главный поздний промотор аденовируса - 2. См. РСТ WO 97/42320 и РСТ WO 96/23898.

Промоторы, подходящие для использования в клетках насекомых, включают промотор полиэдрина, промотор Р10, промотор гена основного белка вируса полиэдроза ядер Autographa californica, бакуловирусный промотор предраннего гена-1 и бакуловирусный промотор постраннего гена 39К. См. РСТ WO 96/23898.

Наконец, могут быть использованы промоторы, составленные из частей других промоторов, а также частично или полностью синтетические промоторы. См., например, Ni et al., 1995, Plant J., 7, 661-676 и РСТ WO 95/14098, описывающие такие промоторы, использующиеся в растениях.

Промотор может включать или быть так модифицированным, чтобы включать один или более энхансерных элементов. Предпочтительно промотор включает множество энхансерных элементов. Промоторы, несущие энхансерные элементы, обеспечивают более высокий уровень транскрипции по сравнению с промоторами, в которых таких элементов нет. Энхансерные элементы, подходящие для использования в растениях, включают энхансерный элемент 353 генома вируса мозаики цветной капусты (патенты США №№5106739 и 5164316) и энхансерный элемент вируса мозаики инжира (Maiti et al., 1997, Transgenic Res., 6, 143-156). Известны и другие энхансеры, подходящие для использования в других типах клеток. См. PCT WO 96/23898 и "Enhancers and Eukaryotic Expression" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1983).

Для обеспечения эффективной экспрессии кодирующие последовательности предпочтительно функционально соединяют также с 3'-нетранслируемой последовательностью. 3'-Нетранслируемая последовательность включает последовательности терминации транскрипции и/или трансляции. 3'-Нетранслируемые участки могут быть выделены из фланкирующих сегментов генов бактериальных, растительных или других эукариотических клеток. Для использования в прокариотах 3'-нетранслируемый сегмент должен включать последовательность терминации транскрипции. Для использования в растениях и других эукариотах 3'-нетранслируемая последовательность должна включать последовательность терминации транскрипции и последовательность полиаденилирования. 3'-Нетранслируемые последовательности, подходящие для использование в растениях, включают последовательности гена 35S вируса мозаики цветной капусты, гена запасающего белка семян фасоли фазеолина, гена малой субъединицы Е9 фермента рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы гороха, гена запасающего белка 7S сои, гена октопинсинтазы и гена нопалинсинтазы.

В растениях и других эукариотах также используется 5'-нетранслируемая последовательность. 5'-Нетранслируемая последовательность является частью молекулы мРНК, которая простирается от 5'-"кэп"-сайта до кодона инициации трансляции. Этот участок мРНК необходим для инициации трансляции у эукариот и играет роль в регуляции генной экспрессии. Подходящие для использования в растениях 5'-нетранслируемые сегменты включают последовательности вируса мозаики люцерны, гена капсидного белка вируса мозаики огурца и вируса мозаики табака.

Как отмечалось выше, ДНК-конструкция может представлять собой вектор. Вектор может включать одну или более реплицирующихся систем, которые обеспечивают его репликацию в клетках-хозяевах. Самореплицирующиеся векторы включают плазмиды, космиды и вирусные векторы. С другой стороны, вектор может являться интегрирующим вектором, который обеспечивает интегрирование в хромосому клетки-хозяина последовательности, кодирующей дикамба-разрушающий фермент по настоящему изобретению. Также желательно, чтобы вектор включал уникальные рестрикционные сайты для встраивания последовательностей ДНК. Если вектор не имеет уникальных рестрикционных сайтов, то он может быть модифицирован с целью введения или удаления рестрикционных сайтов так, чтобы сделать его более пригодным для дальнейших манипуляций.

ДНК-конструкции по настоящему изобретению могут быть использованы для трансформации различных клеток-хозяев (см. ниже). Генетический маркер должен быть использован для отбора трансформированных клеток-хозяев ("селективный маркер"). Селективные маркеры обычно позволяют получать трансформированные клетки путем негативной селекции (т.е. происходит подавление роста тех клеток, которые не несут селективный маркер) или путем скрининга продукта, кодируемого селективным маркером.

Наиболее часто используемым в трансформации растений геном, являющимся селективным маркером, является ген неомицинфосфотрансферазы-II (nptII), выделенный из Тп5, который, в случае помещения его под контроль растительных регуляторных сигналов, обеспечивает резистентность к канамицину (Fraley et. al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4803). Другим обычно используемым в качестве селективного маркера геном является ген гигромицинфосфотрансферазы, который обеспечивает резистентность к антибиотику гигромицину (Vanden Elzen et al., 1985, Plant Mol. Biol., 5, 299).

Другие рассматриваемые в качестве селективных маркеров гены бактериального происхождения, которые обусловливают резистентность к антибиотикам, включают ген гентамицинацетилтрансферазы, ген стрептомицинфосфотрансферазы, ген аминогликозид-3'-аденилтрансферазы и ген резистентности блеомицину (Hayford et al., 1988, Plant Physiol, 86, 1216, 1988; Jones et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 210, 86; Svab et al., 1990, Plant Mol. BioL, 14, 197; Hille et al., 1986, Plant Mol. BioL, 7, 171). Другие являющиеся селективными маркерами гены обеспечивают резистентность к гербицидам, таким как глифозат, глюфозинат или бромксинил (Comai et al., 1985, Nature, 317, 741-744; Gordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell, 2, 603-618; и Stalker et al., 1988, Science, 242, 419-423).

Другие используемые в качестве селективных маркеров гены, пригодные для трансформации растений, имеют небактериальное происхождение. Эти гены включают, например, ген дигидрофолатредуктазы мыши, ген растительной 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы и растительной ацетолактатсинтазы (Eichholtz et al., 1987, Somatic Cell Mol. Genet., 13, 67; Shah et al., 1986, Science, 233, 478; Charest et al., 1990, Plant Cell Rep., 8, 643).

Гены, обычно используемые для скрининга предположительно трансформированных клеток, включают ген β-глюкуронидазы (GUS), β-галактозидазы, люциферазы и хлорамфениколацетилтрансферазы (Jefferson R.A., 1987, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387; Teeri. et al., 1959, EMBO J., 8, 343; Ko