Ингибитор и стимулятор пролиферации стволовой клетки и их использование

Ингибитор и стимулятор пролиферации стволовой клетки и их использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к использованию модуляторов пролиферации стволовой клетки для регулирования цикла стволовой клетки при лечении людей и животных с аутоиммунными болезнями, при старении, раке, миелодисплазии, предлейкозном состоянии, лейкозе, псориазе, приобретенном синдроме иммунодефицита (СПИД), миелодиспластических синдромах, гипопластической анемии или других заболеваниях, характеризующихся гипер- или гипопролиферацией, а также к использованию подобных соединений для анальгезии. Настоящее изобретение также относится к методу лечения людей и животных, ожидающих или перенесших воздействие химиотерапевтических средств или других средств, нарушающих цикл развития стволовых клеток, или методу лечения людей и животных, подвергшихся воздействию облучения, а также для защиты от подобных средств во время лечения ex vivo. И наконец, настоящее изобретение относится к улучшению сохранения стволовой клетки или размножающихся культур для процедур ауто- или аллотрансплантации или для пересадки генов, а также для лечения in vivo для усовершенствования подобных процедур.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Большинство клеток на терминальной стадии дифференцировки в возобновляющихся системах является короткоживущими и должны непрерывно заменяться в течение жизни. Например, клетки крови происходят из самовозобновляющейся популяции мультипотентных кроветворных стволовых клеток (КСК). Кроветворные стволовые клетки являются субпопуляцией кроветворных клеток. Кроветворные клетки можно получить, например, из костного мозга, крови пуповины или периферийной крови (немобилизованными либо мобилизованными таким средством, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор); кроветворные клетки включают популяцию стволовой клетки, клетки-предшественники, дифференцированные клетки, клетки стромы и другие клетки, обеспечивающие среду, необходимую для продуцирования зрелых кровяных клеток. Кроветворные клетки-предшественники представляют собой подмножество стволовых клеток, которые более ограничены в потенциале своего развития. Клетки-предшественники могут дифференцироваться только в одну или две последовательности клеточных поколений [например, эритроидная бурстообразующая единица (БОЕ_э) и эритроцитная колониеобразующая единица (КОЕ-Е), которые могут дать начало только эритроцитам или гранулоцитарно-макрофагальной колониеобразующей единице (КОЕ-ГМ), которые дают начало гранулоцитам и макрофагам], в то время как стволовые клетки (такие как колониеобразующие единицы смешанного типа (КОЕ_микст) или колониеобразующие единицы гранулоцитов-эритроцитов-макрофагов-мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ)) могут генерировать множество направлений дифференцировки клеточных поколений и/или другие стволовые клетки. Так как кроветворные стволовые клетки необходимы для развития всех зрелых клеток кроветворной и иммунной систем, их выживание является существенным для восстановления полностью функционирующей основной защитной системы у субъектов, прошедших лечение химиотерапией или другими средствами.

Продуцирование кроветворных клеток регулируется рядом факторов, которые стимулируют рост и дифференциацию кроветворных клеток, некоторые из которых, например, эритропоэтин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, в настоящее время используются в клинической практике. Однако одна часть механизма контроля, которая не была широко охарактеризована, представляет собой физиологический механизм, который контролирует состояние цикла развития стволовых клеток (Eaves et al. Blood 78:110-117, 1991; Lord, in Stem Cells (C.S.Potten, Ed) стр.401-22, 1997 (Academic Press, Нью Йорк)).

Ранние исследования Лорда и его коллег продемонстрировали существование растворимых белковых факторов в обычных и регенерирующих вытяжках костного мозга, которые могли либо подавлять (ингибировать), либо стимулировать пролиферацию стволовой клетки (рассматривается в Lord and Wright, Blood Cells 6:581-593, 1980; Wright and Lorimore, Cell Tissue Kinet. 20:191-203, 1987; Marshall and Lord, Int. Rev. Cyt. 167:185-261, 1996). Эти виды деятельности были соответственно обозначены как ингибитор стволовой клетки (ИСК) и стимулятор стволовой клетки (ССК).

К настоящему времени ни одна молекула-кандидат в стимуляторы стволовой клетки не была очищена из вытяжек костного мозга, приготовленных, как описано Лордом и др. (см. приведенные выше ссылки). Очистка стимулятора стволовой клетки (ССК) или ингибитора стволовой клетки (ИСК) из первичных источников не была осуществлена из-за трудностей, свойственных анализу in vivo, требующему большого количества облученных мышей. В попытке преодолеть эти проблемы Прагнелл и его коллеги разработали анализ in vitro для примитивных кроветворных клеток (КОЕ-А) и выявили линии клеток, являющиеся источниками ингибиторной (подавляющей) деятельности (см. Graham et al. Nature 344:442-444, 1990). Так как в ранних исследованиях макрофаги были идентифицированы как возможные источники для ингибитора стволовой клетки (Lord et al. Blood Cells 6:581-593,1980), была выбрана линия клеток макрофага мыши, J774.2. (Graham et al., Nature 344:442-444, 1990). Обусловленная среда из данной линии клеток была использована Грехэм и другими для очистки; был выделен ингибиторный пептид, который оказался идентичным ранее описанному воспалительному белку макрофага цитокина 1-альфа - (MIP-1α). Рецепторы для MIP-1α клонировались; как и другие хемокинные рецепторы эти рецепторы MIP-1α представляют собой семь рецепторов трансмембранной области (или рецепторами, "имеющими связь по гуанину"), которые соединены с белками, связывающими нуклеотид гуанина (GTP) подкласса G_{ингнбиторный} (Gi) (рассмотренных в Murphy, Cytokine & Growth Factor Rev. 7:47-64, 1996). Для подкласса Gi "ингибирующее" предназначение определяется его ингибирующей активностью на аденилат циклазе.

MIP-α был выделен из клеточной линии, а не из первичного материала. В то время как Грехэм и др. наблюдали, что антитело к MIP-1α аннулировало деятельность сырой вытяжки костного мозга, другие авторы продемонстрировали, что важной является другая ингибирующая активность. Например, Грехэм и др. (Журнал экспериментальной медицины. 178:925-32, 1993) предположили, что трансформирующий фактор роста бета- (TGFβ), а не MIP-1α, является основным ингибитором для кроветворных стволовых клеток. Далее, Ивз и др. (PNAS 90:12015-19, 1993) предположили, что как MIP-1α, так и TGFβ присутствуют на субоптимальных уровнях в здоровом костном мозге и что ингибирование требует синергии между двумя факторами.

Недавно были получены мыши, у которых ген MIP-1α был удален путем гомологической рекомбинации (Cook et al., Science 269:1583-5, 1995). У подобных мышей не наблюдалось явного нарушения кроветворной системы, ставя под сомнение роль MIP-1α в качестве физиологического регулятора цикла развития стволовой клетки при нормальных гомеостатических условиях. Подобным же образом, хотя трансформирующий фактор роста бета - (TGFβ) также обладает ингибирующей стволовую клетку активностью, продолжительность периода времени, который занимает реакция стволовой клетки на данный цитокин, дает основания полагать, что он не является эндогенным фактором, присутствующим в вытяжках костного мозга; далее, нейтрализующие антитела к TGFβ не устраняют деятельности ингибитора стволовой клетки в супернатантах костного мозга (Hampson et al., Exp. Hemat. 19:245-249, 1991).

Другие авторы описывали дополнительные, ингибирующие стволовые клетки факторы. Фриндел и соавторы выделили из мозгового вещества зародыша теленка и из печеночных вытяжек тетрапептид, который обладает ингибирующей стволовую клетку активностью (Lenfant et al., PNAS 86:779-782,1989). Пауковитц и др. (Cancer Res. 50:328-332,1990) охарактеризовали пентапептид, который в своей мономерной форме является ингибитором, а в своей димерной форме является стимулятором прохождения цикла стволовой клеткой. Другие факторы также были заявлены как ингибирующие в различных системах in vitro (см. Wright and Pragnell in Bailliere's Clinical Haematologv, том 5, стр.723-39, 1992 (Bailliere Tinadall, Paris); Marshall and Lord, Int Rev. Cyt. 167:185-261, 1996).

Цирлова и др., SU 1561261 A1, раскрыла процесс очистки для ингибитора пролиферации стволовой клетки.

Заявки, находящиеся в совместной собственности, WO 94/22915 и WO 96/10634 раскрывают ингибитор пролиферации стволовой клетки, и они полностью включены здесь в виде ссылки.

К настоящему времени ни один из этих факторов не был одобрен для клинического использования. Однако существует потребность в эффективных ингибиторах стволовой клетки. Основная токсичность, связанная с химиотерапией или лечением облучением, связана с разрушением аномально пролиферирующих клеток, что может привести к подавлению костного мозга или желудочно-кишечной токсичности. Эффективный ингибитор стволовой клетки защитит эти клетки и позволит оптимизировать эти терапевтические режимы. Подобно тому, как существует доказанная необходимость в различных стимулирующих цитокинах (т.е. таких цитокинах, как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофакгальный колониестимулирующий фактор (G-M-CSF), эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор стволовой клетки, лиганд flk/flt3 и т.д., которые стимулируют прохождение цикла кроветворными клетками), в зависимости от клинической ситуации, также вероятна необходимость различных ингибирующих факторов для удовлетворения разнообразных клинических потребностей.

Далее, существует необходимость быстрого реверсирования деятельности подобного ингибитора. Первоначальные исследования Лорда и др. (ссылка на работы которых делается выше) продемонстрировали, что ингибирующая активность могла бы быть реверсирована путем добавления стимулирующей активности. В то время как были идентифицированы различные стимулирующие цитокины (см. выше), ни один из них не продемонстрировал присутствия в вытяжках костного мозга активности, описанной Лордом и соавторами, и способность реверсировать деятельность ингибитора.

У здоровых взрослых кроветворные клетки предшественники и стволовые клетки, в основном, находятся в костном мозге. При определенных условиях, например химиотерапии или лечении такими цитокинами, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, большие количества клеток предшественников и стволовых клеток выходят в периферийную кровь, процесс называемый "мобилизацией" (рассмотренный в Simmons et al., Stem Cells 12 (suppl 1): 187-202, 1994; Scheding et al. Stem Cells 12 (suppl 1): 203-11, 1994; Mangan, Sem. Oncology 22:202-9,1995; Moolten, Sem. Oncology 22:271-90, 1995). Недавно опубликованные данные дают основания полагать, что преобладающее большинство мобилизованных клеток предшественников не принимает активного участия в цикле развития клетки (Roberts and Metcalf, Blood 86:1600, 1995; Donahue et al., Blood 87:1644, 1996; Siegert and Serke, Bone Marrow Trans. 17:467, 1996; Uchida et al., Blood 89:465-72, 1997).

Гемоглобин является хорошо сохраняющимся тетрамерным белком с молекулярным весом приблизительно 64000 Дальтон. Он состоит из двух цепочек альфа- и двух цепочек бета-. Каждая цепочка связывает отдельную молекулу гемма (ферропротопорфирин IX), железосодержащую протетическую группу. Цепочки альфа- и бета-позвоночных, вероятно, выводились из отдельного предкового гена, который удвоился и затем разветвился; две цепочки сохраняют большую степень идентичности как между собой, так и между различными позвоночными (см. фиг.16А). У человека кластер альфа-цепочки на хромосоме 16 содержит два альфа-гена (альфа-1 и альфа-2), которые кодируют идентичные полипептиды, а также гены, кодирующие другие альфа-подобные цепочки: зета-, тета- и ряд нетранскрибируемых псевдогенов (см. фиг.16 В по поводу кДНК и последовательностей аминокислот альфа-цепочки человека). Кластер бета-цепочки на хромосоме 11 состоит из одного гена бета-цепочки и нескольких бета-подобных генов: дельта-, эпсилон-, G-гамма- и А-гамма-, а также по крайней мере двух невыраженных псевдогенов (см. фиг.16С по поводу кДНК и последовательностей аминокислот бета-цепочки человека).

Выражение этих генов меняется во время развития. В кроветворении человека, которое было широко охарактеризовано, эмбрионные эритробласты последовательно синтезируют тетрамеры двух зета-цепочек и двух цепочек эпсилон- (Gower I), две альфа-цепочки и две цепочки эпсилон- (Gower II) или две зета-цепочки и две гамма-цепочки (Hb Portland). По мере прохождения эмбриогенезиса преобладающая форма состоит из фетального гемоглобина (Hb F), который состоит из двух альфа- цепочек и двух гамма-цепочек. Гемоглобин взрослого (две альфа- и две бета-цепочки) начинает синтезироваться во время фетального периода; при рождении приблизительно 50% гемоглобина имеет взрослую форму и переход завершается к приблизительно шести месяцам. Преобладающее большинство гемоглобина (приблизительно 97%) у взрослых состоит из вида, имеющего две альфа- и две бета- цепочки (Hb А) с обнаружением небольших количеств Hb F или дельта-цепочки (Hb A2).

Использовалось несколько методов для выражения рекомбинантных цепочек гемоглобина в Е-coli и в дрожжах (например, Jessen et al., Methods Enz. 231:347-364, 1994; Looker et al., Methods Enz. 231: 364-374, 1994; Ogden et al., Methods Enz. 231:374-390, 1994; Martin de Llano et al., Methods Enz. 231:364-374, 1994). Таким образом, до сих пор не предоставлялось возможным выразить изолированную альфа-цепочку человека в больших количествах с помощью рекомбинантных методов (например, Hoffman et al., PNAS 87:8521-25, 1990; Hernan et al., Biochem. 31:8619-28, 1992). Очевидно, что изолированная альфа-цепочка не принимает стабильную форму и быстро деградирует в Е.coli. Совместное выражение бета-цепочки с альфа-цепочкой приводит к увеличенной выраженности того и другого (Hoffman et al. and Hernen et al., цитируемая работа). В то время как альфа-цепочка выражалась как слитый белок с частью бета-цепочки и местом распознания фактора Ха (Nagai and Thorgersen, Methods Enz. 231:347-364, 1994), при этих условиях она выражается как нерастворимое включение.

Как бета-цепочка, так и альфа-цепочка содержат места присоединения для гаптоглобина. Гаптоглобин представляет собой сывороточный белок с чрезвычайно высоким аффинитетом к гемоглобину (например, Putnam в The Plasma Proteins-Structure, Function and Genetic Control (F.W.Putnam, Ed.), том 2, стр.1-49 (Академик Пресс, Нью Йорк); Hwang and Greer, JBC 255:3038-3041, 1980). Перенос гаптоглобина в печень является основным катаболическим путем для циркулирующего гемоглобина. На альфа-цепочке имеется единственное место присоединения для гаптоглобина (аминокислоты 121-127) и два - на бета-цепочке (участки аминокислот 11-25 и 131-146) (Kazim and Atassi, Biochem J. 197:507-510, 1981; McCormick and Atassi, J. Prot. Chem. 9:735-742, 1990).

Биологически активные пептиды с опиатной активностью были получены протеолитической деградацией гемоглобина (рассмотрено в Karelin et al., Peptides 16:693-697, 1995). Альфа-цепочка гемоглобина имеет кислотно-лабильный участок дробления клетки между аминокислотами 94-95 (Shaeffer, J. Biol. Chem. 269:29530-29536, 1994).

Креглер и др. (Экспериментальная гематология 9:11-21, 1981) описали, что гемоглобин имеет усиливающее воздействие на колонии клеток предшественников колониеобразующих единиц КОЕ-С костного мозга мыши. Подобные анализы демонстрируют воздействие на популяции клеток предшественников КОЕ-ГМ и КОЕ-М, в отличие от таких стволовых клеток как колониеобразующие единицы смешанного типа (КОЕ_микст). Авторы наблюдали активность в обеих изолированных цепочках альфа- и бета-гемоглобина. Данная активность устранялась путем обработки N-этилимидмалеиновой кислоты, что навело Креглера и др. на мысль о необходимости сульфидрильной группы. Это наблюдение, наряду с тем фактом, что стимулирующая деятельность оказывала сопротивление усвоению трипсина, навели Креглера и др. на мысль о том, что за эту активность отвечала С-терминальная гидрофобная область или "сердечник". Могатташ и др. (Acta. Haematol. 92:182-186, 1994) раскрыли, что рекомбинантный гемоглобин имеет стимулирующее воздействие на число клеток предшественников КОЕ-Е, БОЕ_э и КОЕ-ГМ, что подобно воздействию, наблюдаемому у гемина. Мюллер и др. (Кровь 86: 19746 1995) раскрыли, что очищенный взрослый гемоглобин стимулирует эритроидные клетки-предшественники подобно гемину.

Петров и др. (Bioscience Reports 15:1-14, 1995) раскрыли использование "неидентифицированной миелопептидной смеси" при лечении врожденной анемии у мыши W^v/W^v. Смесь увеличивала число колоний селезенки, особенно имеющих эритроидный тип.

Гем и гемин широко исследовались в отношении их влияния на кроветворение (см. Sassa, Seminars Hemat. 25:312-20, 1988, и N. Abraham et al., Int. J. Cell Cloning 9:185-210, 1991, где рассматриваются эти вопросы). Гем необходим для созревания эритробластов; in vitro гемин (хлороферропротопорфирин IX, т.е. гем с дополнительным ионом хлорида) увеличивает пролиферацию колониеобразующей единицы гранулоцитов-эритроцитов-макрофагов-мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), эритроидной бурстобразующей единицы (БОЕ_э) и КОЕ-Е. Подобным же образом гемин увеличивает насыщенность клетками в долгоживущих культурах костного мозга.

"Опиаты" являются веществами с анальгетическими свойствами, подобными морфину, основному активному веществу в опиуме. Опиаты могут быть небольшими органическими молекулами, такими как морфин и другие алкалоиды или синтетические соединения, или эндогенными пептидами, такими как энкефалины, эндорфины, динорфины и их синтетические производные. Эндогенные опиатные пептиды производятся in vivo из более крупных предшественников - пред-проэнкефалина А для Met и Leu энкефалинов, пред-проопиомеланокортина для α, β и γ эндорфинов и пред-продинорпина для динорпинов А и В, α-неоэндорпина и β-неоэрдорпина. В дополнение, пептиды с опиатной активностью могут быть получены из неклассических источников, таких как протеолиз или гидролиз таких белков, как α- или β-казеин, клейковина пшеницы, лактальбумин, цитохромы или гемоглобин или из других источников, таких как кожа лягушки (дерморфины) или коровье адренальное мозговое вещество. Подобные пептиды назывались термином "экзорфины" в противоположность классическим эндорфинам; их также называют атипичными опиатными пептидами (Zioudrou et al.; JBC 254:2446-9, 1979; Quirion and Weiss, Peptides 4:445, 1983; Loukas et at., Biochem. 22:4567, 1983; Brantl, Eur. J. Pharm. 106:213-14, 1984; Brantl et al., Eur. J. Pharm. 111:293-4, 1985; Branti et al., Eur Pharm. 125:309-10, 1986; Brantl and Neubert, TIPS 7:6, 1986; Glamsta et al., BBRC 184:1060-6, 1992; Teschemacher, Handbook Exp.Pharm. 104:499-28, 1993; Petrov et al., Bioscience Reports 15:1-14, 1995; Karelin et al., Peptides 16:693-7, 1995). Было показано, что другие эндогенные пептиды, такие как семейство Tyr-MIF-1, также имеют опиатную активность (Reed et al., Neurosci. and Biobehav. Rev. 18:519-25, 1994).

Опиаты выполняют свои действия путем связывания трех основных фармакологических классов эндогенных опиатных рецепторов: мю-, дельта- и каппа-. Рецепторы, представляющие каждый фармакологический класс, клонировались и были показаны как связанные гуанином (G) рецепторы, соединенные с Gi (описано в Reisine and Bell, TINS 16: 506-510, 1993; Uhl et al., TINS 17:89-93, 1994; Knall et al., FASEB J. 9:516-525, 1995; Satoh and Minami, Pharm. Ther. 68:343-64, 1995; Kieffer, Cell. Mol. Neurobiol. 15:615-635, 1995; Reisine, Neuropharm. 34:463-472, 1995; Zaki et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 36:379-401, 1996).

Для каждого рецептора имеются специфические агонисты и антагонисты, например, для мю-рецепторов (которые селективно активируются DAMGO и DALDA и селективно подавляются СТОР и налоксоназином), для каппа-рецепторов (которые селективно активируются GR 89696 фурмаратом или U-69593 и селективно подавляются нор-биналтофимин гидрохлоридом) и для дельта-рецепторов (которые селективно активируются DADLE и DPDPE и селективно подавляются натриндолом). В дополнение, существуют антагонисты (такие как налоксон) и агонисты (такие как эторпин) широкого спектра, которые действуют на все три подтипа рецепторов.

Как классические, так и атипичные опиатные пептиды могут быть химически видоизменены или дериватизированы для того, чтобы изменить их специфические свойства связывания опиатных рецепторов (рассмотрено в Hruby and Gehrig, Med. Res. Rev. 9:343-401, 1989; Schiller, Prog. Med. Chem. 28:301-40, 1991; Teschemacher, Handbook Exp.Pharm. 104:499-28, 1993; Handbook of Experimental Pharmacology, A. Hertz (Ed), тома 104/1 и 104/11, 1993, Springer Verlag, Berlin; Karelin et al., Peptides 16:693-7, 1995). Примеры включают производные дерморфина (например, DALDA) и энкефалинов (например, DADLE, DAMGO или DAMME). Могут также быть получены пептиды, которые обычно не связываются с опиатными рецепторами, такие как соматостатин, со специфическим свойством связывания опиатных рецепторов (например, СТОР (Hawkins et al., J. Pharm. Exp. Ther. 248:73, 1989)). Аналоги могут также быть выведены из алкалоидов, таких как морфин с измененными свойствами связывания рецепторов (например, героин, кодеин, гидроморфон, оксиморфон, леворфанол, леваллорфан, кодеин, гидрокодон, оксикодон, налорфин, налоксон, налтрексон, бупренорфин, бутанорфанол и налбуфин); в дополнение к этому, небольшие молекулы, структурально не связанные с морфином, могут также действовать на опиатные рецепторы (например, меперидин и представители его же рода - альфа-продин, дипеноксилат и фентанил) (см. Руководство по экспериментальной фармакологии, цитируемая работа; Goodman and Oilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed., A.G. Gilman, T.W. Rail and F. Murad (Eds), 1985 Macmillan Publishing Co. Нью Йорк).

Эндогенные опиатные пептиды (энкефалины, эндорфины и динорфины) имеют сохраненный N-терминальный тетрапептид Tyr-Gly-Gly-Phe, за которым следует Leu или Met и любая оставшаяся С-терминальная последовательность. Удаление гидроксильной группы на N-терминальном Tyr (что дает N-терминальное Phe) приводит к сильной потере активности для Met-энкефалина. Эти структурные данные привели к гипотезе "сообщение-адрес", по которой N-терминальное "сообщение" вызывает биологическую активность, в то время как С-терминальный "адрес" придает специфичность и усиливает активность (Chavkin and Goildstein, PNAS 78:6543-7, 1981). Экзорфины обычно имеют Tyr-Pro, заменяющий N-терминальный Tyr-Gly классических опиатных пептидов; считается, что остаток пролина придает большую стабильность против деградации аминопептидазы (Shipp et al., PNAS 86:287, 1989; Glasma et al., BBRC 184:1060-6, 1992).

Недавно был клонирован рецептор орфан ("ORL1") в связи со связью последовательности с опиатными рецепторами мю-, дельта- и каппа- (Mollereau et al., FEBS 341:33-38, 1994, Fukuda et al., FEBS 343:42-46, 1994; Bunzow et al., FEBS 347:284-8, 1994; Chen et al., FEBS 347:279-83, 1994; Wang et al., FEBS 348:75-79; Keith et al., Reg. Peptides 54 143-4, 1994; Wick et al., Mol. Brain Res. 27:37-44, 1994; Halford et al., J. Neuroimmun. 59:91-101, 1995). Лиганд для данного рецептора, называемый по-разному, ноцисептин или орфанин FQ (далее называемый ноцисептин), был клонирован и оказался гептадекапептидом, который выводится из более крупного предшественника (Meunier et al., Nature, 377:532-535, 1995; Reinscheid et al., Science 270:792-794, 1995). Было продемонстрировано, что он обладает проноцисептическими, гиперанальгезирующими функциями in vivo, в противоположность классическим опиатам, имеющим анальгезирующие свойства. Ноцисептин имеет в основе N-терминальный Phe-Gly-Gly-Phe... в отличие от N-терминальной основы Tyr-Gly-Gly-Phe... классических опиатных пептидов, рассмотренных выше. Соблюдая требование о наличие N-терминального Tyr для деятельности опиатов в классических опиатных пептидах, ноцисептин проявляет низкую аффинность или отсутствие аффинности к опиатным рецепторам мю-, каппа- или дельта-. Подобным же образом нолаксон, антагонист опиата широкого спектра, не имеет заметной аффинности к ORL1.

Наблюдалось, что энкефалины не влияют на мышиную кроветворную деятельность in vivo при условиях иммобилизационной нагрузки (Goldberg et al., Folia Biol. (Praha) 36:319-331, 1990). Лей-энкефалин ингибировал, а мет-энкефалин стимулировал кроветворную деятельность костного мозга. Эти воздействия были косвенными, и, как полгал Голдберг и др., вызывались воздействиям на глюкокортикоидных уровнях и миграцией Т-лимфоцита. Кризанаг-Бенгез и др. (Biomed. & Pharmacother, 46:367-43, 1992; Biomed. & Pharmacother. 49:27-31, 1995; Biomed. & Pharmacother, 50:85-91, 1996) рассмотрели воздействия этих соединений in vitro. Предварительная обработка костного мозга мышей мет- или лей-энкефалином или нолаксоном влияла на количество гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, наблюдаемых при анализе колонии. Этот эффект был чрезвычайно переменным и приводил к подавлению, стимулированию или отсутствию влияния; далее, не было четкой реакции на дозу. Эта переменчивость относилась Кризанак-Бенгез и др. на счет циркадных ритмов и А-клеток.

Недавно было продемонстрировано, что у мышей, у которых опиатный рецептор мю был делецирован гомологической рекомбинацией, увеличивалось число КОЕ-ГМ, БОЕ_э и КОЕ-ГЭММ на бедренной кости. У этих мышей с делецированным мю рецептором клетки-предшественники костного мозга и селезенки более быстро проходили цикл по сравнению с обычными мышами. Не было определено, было ли это воздействие вызвано прямым или косвенным влиянием на стволовые клетки костного мозга, возникающим вследствие отсутствия мю рецептора у этих животных (Broxmeyer et al., Blood 88:338a, 1997).

I. Химиотерапия и лучевая терапия рака.

Продуктивное исследование стимулирующих факторов роста привело к клиническому использованию ряда из этих факторов (эритропоэтина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и т.д.)). Эти факторы снизили смертность и заболеваемость, связанные с лечением химиотерапией и облучением. Дальнейшие клинические преимущества для пациентов, проходящих химиотерапию или облучение, могут быть обеспечены альтернативной стратегией блокировки поступления стволовых клеток в клеточный цикл, тем самым защищая их от токсических побочных эффектов. Реверсирование данной защиты позволит быстро восстановить функцию костного мозга после химиотерапии или лучевой терапии.

II. Трансплантация костного мозга и стволовой клетки, размножение стволовой клетки ex vivo и очистка опухоли.

Трансплантация костного мозга (ВМТ) является полезным лечением для разнообразных гематологических, аутоиммунных и злокачественных заболеваний. Используемая в настоящее время терапия включает кроветворные клетки, полученные из крови пуповины, эмбриональной печени или из периферийной крови (немобилизованные, либо мобилизованные такими средствами, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или циклофосфоамид), а также из костного мозга; стволовые клетки могут быть неочищенными, частично очищенными (например, аффинитетная очистка популяции CD34⁺) или интенсивно очищенными (например, путем флуоресцентного активированного сортирования клеток с использованием таких маркеров, как CD34, CD38 или родамин). Манипулирование кроветворными клетками ex vivo в настоящее время используется для расширения примитивных стволовых клеток в популяцию, пригодную для трансплантации. Оптимизация этой процедуры требует: (1) достаточного числа стволовых клеток, способных поддерживать долгосрочное восстановление кроветворения; (2) истощения трансплантанта по отношению к исходным индуцирующим Т-лимфоцитам и (3) отсутствия остаточных злокачественных клеток. Эта процедура может быть оптимизована путем включения ингибитора(ов) стволовой клетки и/или стимулятора(ов) стволовой клетки.

Эффективность очистки кроветворных клеток цитотоксическими лекарственными средствами для удаления остаточных злокачественных клеток ограничена из-за токсичности этих соединений для здоровых кроветворных клеток и в особенности стволовых клеток. Существует необходимость эффективной защиты здоровых клеток во время очистки; защита может быть выполнена путем выведения стволовых клеток из цикла с помощью эффективного ингибитора.

III. Сбор периферийных стволовых клеток.

По сравнению с костным мозгом стволовые клетки периферийной крови (PBSC) предоставляют ряд потенциальных преимуществ для аутотрансплантации. У пациентов, не имеющих приемлемых участков для сбора мозгового вещества в связи с опухолью или предшествовавшей лучевой терапией, все равно можно производить сборы PBSC. Использование стволовых клеток крови устраняет необходимость общей анестезии и хирургической процедуры для пациентов, которые не хорошо переносят это. Технология аферезиса, необходимая для сбора стволовых клеток, является эффективной и широко распространена в большинстве крупных медицинских центров. Главными ограничениями метода являются низкая повторяемость нормального стационарного состояния стволовых клеток в периферийной крови и интенсификация прохождения цикла после процедур мобилизации лекарствами или факторами роста (например, циклофосфамидом, гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, фактором стволовой клетки). Эффективный ингибитор стволовой клетки будет необходим для возвращения подобных клеток в спокойное состояние, тем самым предотвращая их потерю путем дифференциации.

IV. Лечение гиперпролиферативных нарушений.

Ряд заболеваний характеризуются гиперпролиферативным состоянием, при котором разрегулированные стволовые клетки приводят к перепроизводству клеток на терминальной стадии дифференцировки. Подобные болезненные состояния включают псориаз, но не ограничиваются им, при котором существует перепроизводство клеток эпидермы, предзлокачественные состояния желудочно-кишечного тракта, характеризующиеся появлением кишечных полипов, и приобретенный синдром иммунодефицита (СПИД), при котором ранние стволовые клетки не инфиируются ВИЧ инфекцией, а осуществляют быстрое прохождение цикла, что приводит к истощению стволовой клетки. Ингибитор стволовой клетки был бы полезен при лечении подобных состояний.

V. Лечение гипопролиферативных нарушений.

Ряд заболеваний характеризуется гипопролиферативным состоянием, при котором разрегулированные стволовые клетки вызывают недопроизводство клеток на терминальной стадии дифференцировки. Подобные болезни включают миелодиспластический синдром или апластическую анемию, при которой существует недопроизводство клеток крови, а также состояния, связанные со старением, при которых существует дефицит регенерации клеток и их замены. Стимулятор стволовой клетки будет полезен при лечении подобных состояний.

VI. Пересадка генов.

Способность переносить генетическую информацию в кроветворные клетки используется в настоящее время в клинических условиях. Кроветворные клетки являются полезной мишенью для генной терапии из-за легкости доступа, обширного опыта манипулирования и лечения этой ткани ex vivo и из-за способности кровяных клеток проходить сквозь ткани. Более того, корректировка некоторых генетических дефектов человека может быть возможна путем введения функционального гена в примитивные стволовые клетки кроветворной системы человека.

Существует несколько ограничений введения генов в кроветворные клетки человека при использовании либо ретровирусных векторов, либо физических приемов пересадки гена: (1) низкая частота стволовых клеток в кроветворных тканях приводит к необходимости разработки высокоэффективных приемов пересадки генов и (2) более быстро циклирующие стволовые клетки оказались более подверженными векторной инфекции, но увеличение частоты встречаемости инфекции путем стимуляции пролиферации стволовой клетки факторами роста оказывает отрицательное воздействие на долгосрочную экспрессию гена, потому что клетки, содержащие данные трансгены, вынуждаются к необратимой дифференциации и теряют свое самовозобновление. Эти проблемы могут быть смягчены путем использования ингибитора стволовой клетки для предотвращения дифференциации и потери самовозобновления и стимулятора стволовой клетки для регулирования вхождения стволовых клеток в цикл, тем самым облегчая пересадку гена с ретровирусным посредником.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединениям, включающим пептиды и полипептиды, которые являются ингибиторами и/или стимуляторами пролиферации стволовой клетки (соединения INPROL и опиатные соединения) и их использованию.

Настоящее изобретение включает ингибитор пролиферации стволовой клетки, характеризующийся следующими свойствами:

a) удельной активностью (IC₅₀), меньшей или равной 20 нг/мл при анализе колониеобразующей единицы селезенки мыши (КОЕ-С) (см. Пример 4),

b) молекулярным весом, большим 10000 Дальтон и меньшим чем 100000 Дальтон (по ультрафильтрации),

c) активностью, чувствительной к деградации трипзином,

d) большей гидрофобностью, чем MIP-1α или TGFβ и отделимостью от того и другого путем обращенно-фазовой хроматографии (см. Пример 12),

е) биологической активностью, сохраняющейся после нагревания в течение одного часа при 37°С, 55°С или 75°С в водном растворе, и

f) биологической активностью, сохраняющейся после осаждения 1% хлористоводородной кислотой в ацетоне.

Настоящее изобретение далее характеризуется и отличается от других кандидатов в ингибиторы стволовой клетки (например, MIP-1α, TGFβ и различных олигопептидов) своей способностью достигать ингибирования в анализе in vitro после короткого прединкубационного периода (см. Пример 5).

Настоящее изобретение также включает фармацевтические средства, содержащие INPROL для лечения различных нарушений.

Настоящее изобретение обеспечивает метод лечения субъекта, ожидающего воздействия агентом, способным убивать или повреждать стволовые клетки, путем введения данному субъекту количества состава, эффективного для ингибирования стволовой клетки. Стволовая клетка, защищенная данным методом, может быть обычной кроветворной стволовой клеткой, присутствующей и делящейся в костном мозге, пуповинной клетке, фетальной печени или мобилизованной в циркуляцию периферийной крови. В то время как большинство мобилизованных стволовых клеток находится в состоянии покоя при анализе активированным флуоресцентным классификатором (FACS), мультипотентные стволовые клетки демонстрируют прохождение цикла развития и могут быть ингибированы INPROL в количествах, необходимых для ингибирования стволовой клетки. Альтернативно, стволовые клетки могут быть эпителиальными, расположенными, например, в кишечнике или в волосистой части кожи головы или в других областях тела, или зародышевыми клетками, расположенными в репродуктивных органах. Метод данного изобретения может подходить для использования на людях, хотя в данный метод также включено лечение животных. При использовании в данном документе термины "субъект" или "пациент" относятся к животному, подобному млекопитающим, включая человека.

Настоящее изобретение также обеспечивает метод лечения субъекта с гипопролиферирующими стволовыми клетками путем введения данному субъекту количества состава, эффективного для стимуляции стволовой клетки. Стволовые клетки, стимулируемые данным методом, могут быть кроветворными стволовыми клетками, обычно присутствующими в костном мозге, пуповинной крови, фетальной печени или мобилизованными в циркуляцию периферийной крови; подобные стволовые клетки могли быть ранее переведены в состояние покоя путем использования INPROL в количествах, необходимых для ингибирования стволовой клетки. INPROL в количествах, вызывающих стимулирующее действие на стволовые клетки, позволит при желании стимулировать циклирование стволовой клетки, например, после сбора стволовых клеток для использования во время размножения ех vivo или in vivo после трансплантации стволовой клетки и приживления. Альтернативно, стволовые клетки могут быть эпителиальными, расположенными, например, в кишечнике или в волосистой части кожи головы или в других областях тела, или зародышевыми клетками, расположенными в репродуктивных органах.

В другом аспекте изобретение предоставляет метод защиты и восстановления кроветворной, иммунной или других систем стволовых клеток у пациентов, проходящих химиотерапию, что включает прием пациентом количества INPROL, эффективного для ингибирования стволовой клетки, и/или для стимулирования восстановления после химиотерапии или облучения путем введения INPROL в количествах, эффективных для стимулирования стволовой клетки.

В еще одном дальнейшем аспекте настоящее изобретение включает метод вспомогательного лечения любого вида рака, включая вид, характеризующийся твердыми опухолями (например, опухолями груди, толстой кишки, легких, тестикулярными, овариальными, печени, почек, поджелудочной железы, мозга, саркомы), путем приема пациентом, имеющим рак, количества INPROL, эффективного для ингибирования стволовых клеток, для защиты стволовых клеток костного мозга, желудочно-кишечного тракта или других органов от токсического воздействия химиотерапии или лучевой терапии и/или для стимулирования восстановления после химиотерапии или лучевой терапии путем приема INPROL в количествах, стимулирующих стволовую клетку.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лечению лейкоза (например, хронического миелопоэзного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитного лейкоза, острого лимфоц