Рекомбинантные антитела и композиции, а также способы их создания и использования

Рекомбинантные антитела и композиции, а также способы их создания и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка имеет приоритет в соответствии Предварительной Заявкой США №60/314023, поданной 21 августа 20 г., которая включена здесь в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, в том числе к последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности моноклональных антител человека, нейтрализующих вирус бешенства.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Бешенство представляет собой острое неврологическое заболевание, вызываемое инфицированием центральной нервной системы вирусом бешенства, представителем рода Lyssavirus семейства Rhabdovirldae. Из-за большой исторической значимости, связанной с его древностью и устрашающей природой данного заболевания, вирус бешенства продолжает представлять собой опасную инфекцию для человека и в ветеринарии из-за обширного распространения среди различных видов диких животных. Почти по всему миру для определенных видов наземных животных эндемичны разные варианты вируса бешенства, которые имеют мало общего между собой, особенно у. Несмотря на то, что в некоторых регионах, включая Великобританию, Австралии, Японию и многие острова, бешенство наземных животных отсутствует, вирус бешенства и вирусы, связанные с бешенством, ассоциированные с летучими мышами, в последнее время идентифицированы в Великобритании и Австралии.

Вирус бешенства представляет собой типичную оболочечную частицу пулевидной формы, в среднем, от 75 до 180 нанометров. Вирион состоит из одноцепочечного обратносмыслового РНК-генома и пяти структурных белков: нуклеопротеиновых (N) молекул, фосфопротеина (NS), полимеразы (L), матриксного белка (М) и вирусного гликопротеина (G).

Белки N и G несут антигенные детерминанты, которые позволяют серотипически характеризовать разные штаммы вируса бешенства. Детерминанты N высококонсервативны у разных вирусных изолятов и являются поэтому очень удобными мишенями для иммуногистологического определения инфекции вируса бешенства с использованием специфичных антител. С другой стороны, антигенные детерминанты, содержащиеся в белке G, существенно варьируют среди штаммов вируса бешенства. Нейтрализующие вирус антитела, индуцируемые при вакцинации инактивированным вирусом, направлены против G. Хотя ясно, что Т-клеточные ответы на G, N, и NS, принимают участие в иммунных ответах на данный вирус в экспериментальных условиях, оценка иммунитета к вирусу бешенства обычно ограничивается серологическими исследованиями, особенно что касается антител, нейтрализующих вирус.

В тех областях по всему миру, в которых все еще распространено заболевание человека бешенством, собака является основным резервуаром данного вируса, который поражает людей. Поскольку бешенство собак было в большинстве своем ликвидировано путем вакцинации, лисы, койоты, скунсы, еноты, летучие мыши, и ряд других млекопитающих дали убежище вариантам данного вируса. Во многих областях резервуары вируса, благодаря диким животным, продолжают расширяться. Кроме того, вирус бешенства может быть передан от видов-резервуаров людям или другим конечным хозяевам животными, обычно не ассоциируемыми с бешенством, такими, например, как кошки, кролики и т.п.

Будучи почти неотвратимо смертельным при проявлении клинических симптомов, бешенство может быть предотвращено путем неотложного лечения инфицированного индивида сочетанием пассивной и активной иммунизации. Пассивная иммунизация состоит из введения уже готовых антител, нейтрализующих вирус бешенства, полученных из объединенной сыворотки индивидов, обладающих иммунитетом к бешенству (иммуноглобулин человека против бешенства; HRIG), или гипериммунизированных лошадей (иммуноглобулин лошадей против бешенства; ERIG). Оба вида реагентов представляют определенный риск для реципиентов, в том числе из-за переменной антигенной специфичности и, следовательно, разного действия на разные изоляты вируса бешенства.

HRIG получают из объединенной человеческой сыворотки, поэтому существует вероятность того, что препараты HRIG могут быть контаминированы известными или неизвестными патогенами человека. С другой стороны, будучи препаратом чужеродного антигена, ERIG связан с тяжелыми анафилактическими реакциями. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к вирусу бешенства, предполагается использовать для послеэкспозиционной профилактики, но, подобно ERIG, они антигенно чужеродны для людей. Это может привести к их быстрому выведению из организма человека, а также вызвать возможную анафилактическую реакцию.

Использование человеческих моноклональных антител ограничено, поскольку гибридомные клеточные линии человека трудны в получении, как правило, нестабильны, и не образуют моноклональных антител соответствующей специфичности в достаточных количествах, а также довольно дорогие. Себестоимость моноклональных антител заставляет искать более экономичные альтернативы получению моноклональных антител из гибридом.

Четко установлено, что области Fab и Fab2, которые содержат зариабельные и шарнирные участки тяжелой и легкой цепей, не защищают от инфекции вирусом бешенства. Эффективность антител in vivo зависит от полной последовательности, то есть антирабическую активность проявляют только определенные антитела. За иммунореактивность ответственна константная область антитела. Поэтому она является свойством константной области(ей), которая необходима для защиты против вируса бешенства. Вариабельные области, сплайсированные с константной областью другого антитела, т.е. антитела против вируса бешенства, полученного искусственно, неэффективны.

Существует потребность в рекомбинантных антителах, применимых для диагностики, профилактики и лечения инфекции бешенства, содержащих их фармацевтических композициях и предусматривающих их использование способах. Существует потребность в композициях и способах получения таких рекомбинантных антител.

Существует потребность в рекомбинантных антителах, применимых для диагностики, профилактики и лечения инфекции патогенов, воздействующих на нервную ткань, содержащих их фармацевтических композициях и предусматривающих их использование способах. Существует потребность в композициях и способах получения рекомбинантных антител.

Для создания наилучшего реагента были созданы человеческие моноклональные антитела путем слияния трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (EBV) специфичных к вирусу бешенства В-клеток человека и мышиных-человеческих гетерогибридных доноров. Клоны кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител в этих клетках, конструировали так, чтобы данные антитела экспрессировались в гетерологичных экспрессирующих системах. Эти конструкции делают возможным получение в контролируемых системах нейтрализующих вирус бешенства человеческих антител определенной специфичности, не содержащих возможных вредных примесей. Настоящее изобретение относится к данным моноклональным антителам человека, нейтрализующим вирус бешенства, последовательностям нуклеиновых кислот их тяжелых и легких цепей и аминокислотным последовательностям данных кодируемых белков. Настоящее изобретение также относится к способам использования указанных моноклональных антител в качестве терапевтически эффективного послеэкспозиционного профилактического лечения индивидов, подвергшихся воздействию вируса бешенства.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, композициям и способам получения таких антител. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к рекомбинантным антирабическим антителам, а также композициям и способам получения таких антител. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам со специфичной константной областью, которая делает их особенно эффективными в борьбе с патогенами, которые поражают нервную систему.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным последовательностям ДНК, к рекомбинантным векторам, содержащим такие последовательности, к клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, и к способам получения рекомбинантных антител с использованием таких клеток-хозяев.

Настоящее изобретение дополнительно относится к использованию рекомбинантных антител для диагностики, профилактики и лечения патогенных инфекций нервной ткани, особенно бешенства.

Настоящее изобретение относится к молекулам выделенной нуклеиновой кислоты, обладающим последовательностью нуклеиновой кислоты тяжелой цепи и легкой цепи, кодирующим аминокислотную последовательность тяжелой и легкой цепи. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой аминокислотные последовательности нейтрализующего вирус бешенства моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком вируса бешенства.

Настоящее изобретение относится к молекулам выделенной нуклеиновой кислоты, которые кодируют нейтрализующее вирус бешенства моноклональное антитело, которые являются производными последовательностей кДНК тяжелой цепи SEQ ID NO:1 и легкой цепи SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение относится к выделенному нейтрализующему вирус бешенства моноклональному антителу человека, кодируемому клонами кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела, экспрессируемые в гетерологичных экспрессирующих системах и не содержащие вредных примесей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность выделенного моноклонального антитела человека, нейтрализующего вирус бешенства, представляет собой, соответственно, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4.

Настоящее изобретение относится к слитому гену, кодирующему химерную легкую цепь иммуноглобулина. Данная химерная легкая цепь содержит первую последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства, полученную с помощью гетерогибридомной клеточной линии; и вторую последовательность ДНК, кодирующую константную область легкой цепи человека. Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, который экспрессирует данный слитый ген. Следующим объектом является клетка-хозяин для экспрессирующего вектора.

Настоящее изобретение относится к слитому гену, кодирующему химерную тяжелую цепь иммуноглобулина. Данная химерная тяжелая цепь содержит первую последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства, полученного с помощью гетерогибридомной клеточной линии; и вторую последовательность ДНК, кодирующую константную область тяжелой цепи человека. Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, который экспрессирует данный слитый ген. Дополнительная цель заключается в создании клетки-хозяина для созданного экспрессирующего вектора.

Настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, нейтрализующему вирус бешенства, производное слитого гена, кодирующего химерную легкую цепь иммуноглобулина, и слитого гена, кодирующего химерную тяжелую цепь иммуноглобулина.

Настоящее изобретение относится к способу лечения индивида, подвергшегося воздействию вируса бешенства, путем введения данному индивиду терапевтически эффективного количества моноклонального антитела человека, нейтрализующего вирус бешенства, который кодируется клонами кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепи данного антитела, экспрессируемые в гетерологичных экспрессирующих системах и не содержащих вредных примесей, предотвращая тем самым проникновение вируса бешенства в центральную нервную систему.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с гликопротеином вируса бешенства разных штаммов. Послеэкспозиционное лечение с помощью моноклонального антитела, или смесью разных моноклональных антител, будет нейтрализовать вирус бешенства на уровне ворот инфекции и препятствовать распространению данного вируса в центральную нервную систему (ЦНС). Поэтому, при чрескожном или мукозальном контакте с вирусом бешенства в место укуса вкапывают, а также вводят системно, специфичные к вирусу бешенства моноклональные антитела. Поскольку репликация вируса ограничивается почти исключительно нервными клетками, нейтрализация и клиренс данного вируса с помощью моноклональных антител настоящего изобретения перед его проникновением в ЦНС представляет собой эффективную послеэкспозиционную профилактику.

Первый аспект настоящего изобретения заключается в создании последовательностей моноклональных антител против вируса бешенства. Хотя большая часть вариабельной области Mab 57 хорошо известна (Cheung и соавт., J. Virol. 66:6714-6720, 1992, которые включены здесь в качестве ссылки), константная область остается неизвестной. Было клонировано и секвенировано полное моноклональное антитело, и константная, и вариабельная области. Настоящее изобретение относится к новой нуклеотидной последовательности константной области Mab 57, нуклеотиды 476-1431, которая включает константный домен 1 (CH1) и шарнирную область. Данная последовательность может использоваться в рекомбинантных антителах, включая антирабические антитела, или в рекомбинантных антителах, нацеленных против других патогенов, которые поражают нервную ткань, таких как энцефалит и герпес.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены, и к клеткам-хозяевам, которые включают данные векторы. Настоящим изобретением разработаны также способы получения и использования данных рекомбинантных антител.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab 57. Получаемые из гибридом Mab 57 представляют собой антитела IgG2; рекомбинантные антитела, получаемые из Mab 57, представляют собой антитела IgGI. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab 57, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены и к клеткам-хозяевам, которые включают данные векторы. Настоящее изобретение относится также к способам создания и использования данных рекомбинантных антител.

Настоящее изобретение относится также к полной последовательности тяжелой и легкой цепей антирабического моноклонального антитела Mab JA. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab JA, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены, и к клеткам-хозяевам, которые включают данные векторы. Настоящее изобретение относится также к способам создания и использования рекомбинантных антител.

Настоящее изобретение относится также к полной последовательности тяжелой и легкой цепей антирабического моноклонального антитела Mab JB.1. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab JB.1, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены, и к клеткам-хозяевам, которые включают данные зекторы. Настоящим изобретением разработаны также способы создания и использования рекомбинантных антител.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения рекомбинантное антитело настоящего изобретения представляет собой одноцепочечное антитело, в котором тяжелая цепь вариабельного домена и легкая цепь вариабельного домена соединены с помощью спейсерной группы, предпочтительно пептида. Наиболее предпочтительным является одноцепочечное антитело, в котором вариабельный домен тяжелой цепи локализован на N-конце данного рекомбинантного антитела. Данное одноцепочечное рекомбинантное антитело может дополнительно включать эффекторную молекулу и/или сигнальные последовательности, облегчающие процессинг данного антитела в клетке-хозяине, в которой его получают.

Рекомбинантные антитела настоящего изобретения могут использоваться для идентификации вируса бешенства, например, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания инфицированных клеток, с помощью иммуноблоттинга непосредственно или путем иммунопреципитации и переноса белка из иммунокомплексов, либо с помощью иного иммуноанализа, например связывания, перекрестного ингибирования или конкурентного радио- либо иммуноферментного анализа.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается способ производства рекомбинантных антител настоящего изобретения. рекомбинантные антитела настоящего изобретения можно получить с помощью методов рекомбинантной ДНК, предусматривающих культивирование трансформированного хозяина в условиях, обеспечивающих его экспрессию и выделение указанного антитела.

Более конкретно, настоящее изобретение относится также к способу получения рекомбинантного антитела, предусматривающему культивирование хозяина, трансформированного гибридным вектором, содержащим экспрессирующую кассету, включающую промотор и ДНК, кодирующую указанное рекомбинантное антитело, причем ДНК контролируется указанным промотором, и выделения указанного рекомбинантного антитела.

Производство in vitro позволяет получать относительно чистые препараты антител и масштабировать процесс для получения больших количества желаемых антител. Методы культивирования бактериальных клеток, дрожжей или клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают в себя гомогенную суспензионную культуру, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе непрерывного действия с механическим перемешиванием, либо иммобилизованную клеточную культуру или клеточную культуру с включением, например, в полые волокна, в микрокапсулы, в агарозные микрошарики или в керамические картриджи.

Вырожденные последовательности являются вырожденными в смысле генетического кода, в соответствии с которым неограниченное количество нуклеотидов заменяется другими нуклеотидами без изменения исходно кодируемых аминокислотных последовательностей. Такие вырожденные последовательности могут находить применение благодаря различию их сайтов рестрикции и/или частоты отдельных кодонов, которые являются предпочтительными у конкретного хозяина, в частности E.coli, для достижения оптимальной экспрессии данного рекомбинантного антитела.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается рекомбинантная ДНК, которая представляет собой гибридный вектор, включающий вставку, кодирующую рекомбинантное антитело, описанное выше, и, необязательно, точку начала репликации или автономно реплицирующуюся последовательность, одну или несколько доминантных маркерных последовательностей, контролирующие экспрессию последовательности, сигнальные последовательности и дополнительные сайты рестрикции.

Векторы обычно выполняют две функции во взаимодействии с совместимыми клетками-хозяевами. Первая функция заключается в обеспечении клонирования нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуноглобулиновые домены, т.е. в получении используемых количеств данной нуклеиновой кислоты (клонирующие векторы). Другая функция заключается в обеспечении репликации и экспрессии рекомбинантных генных конструкций в подходящем хозяине, либо путем сохранения в качестве внехромосомного элемента, либо путем интеграции в хромосому данного хозяина (экспрессирующие векторы). Клонирующий вектор включает описанные выше рекомбинантные генные конструкции, точку начала репликации или автономно реплицирующуюся последовательность, доминантные маркерные последовательности и, необязательно, сигнальные последовательности и дополнительные сайты рестрикции. Экспрессирующий вектор дополнительно включает контролирующие экспрессию последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции рекомбинантных генов.

Точка начала репликации или автономно реплицирующаяся последовательность обеспечивается либо путем конструирования вектора, который включает экзогенную точку начала, такой как полученный из вируса 40 иммунодефицита обезьян (SV 40), или из другого вирусного источника, либо с помощью хромосомных механизмов клетки-хозяина.

Указанные маркеры обеспечивают возможность отбора клеток-хозяев, которые содержат данный вектор. Маркеры отбора включают гены, которые придают резистентность к тяжелым металлам, таким как медь, или к антибиотикам, таким как генитицин (G-418) или гигромицин, или гены, которые комплементируют с генетическим повреждением клетки-хозяина, таким, например, как отсутствие тимидинкиназы, гипоксанитинфосфорилтрансферазы, дигидрофолатредуктазы и тому подобное.

Сигнальные последовательности могут представлять собой, например, последовательности-предшественники или секреторные лидерные последовательности, управляющие секрецией данного рекомбинантного антитела, сигналы сплайсинга и тому подобное. Примеры сигнальных последовательностей, управляющих секрецией данного рекомбинантного антитела, представляют собой последовательности, полученные из гена ompA, гена pelB (пектатлиазы) или гена phoA.

В качестве контролирующих экспрессию последовательностей векторная ДНК включает промотор, последовательности, необходимые для инициации и терминации транскрипции и для стабилизации мРНК, и, необязательно, энхансеры и дополнительные регуляторные последовательности.

Можно использовать широкий ряд промотирующих последовательностей, в зависимости от природы клетки-хозяина. Промоторы, которые являются сильными и, в то же время, хорошо регулируемыми, являются наиболее пригодными. Последовательности для инициации трансляции представляют собой, например, последовательности Шайн-Дальгарно. Последовательности, необходимые для инициации и терминации транскрипции и для стабилизации мРНК, обычно находятся, соответственно, в некодирующих 5'-областях и 3'-областях вирусной или эукариотической кДНК, например, из данного экспрессирующего хозяина. Энхансеры и стимулирующие транскрипцию последовательности ДНК вирусного происхождения, например, полученные из вируса иммунодефицита обезьян, полиомного вируса, вируса папилломы крупного рогатого скота или вируса саркомы Молони, или геномного происхождения, особенно мыши.

Разные сегменты ДНК векторной ДНК соединены путем сшивки, т.е. они являются непрерывными и находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Примерами векторов, которые применимы для репликации и экспрессии в штамме E.coli, являются бактериофаги, например, производные лямбда-бактериофагов, или плазмиды, такие, например, в частности, как плазмида ColE1 и ее производные, например, рМВ9, pSF2124, pBR317 или pBR322, а также ллазмиды, полученные из pBR322, такие как pUC9, pUCKO, pHRi148 и рLc24. Подходящие векторы содержат полный репликон, маркерный ген, последовательности, узнающие рестрикционные эндонуклеазы, так что чужеродную ДНК и, при необходимости, экспрессирующую контрольную последовательность можно встроить в эти сайты, а также необязательно сигнальные последовательности и энхансеры.

Промоторы микроорганизмов представляют собой, например, сильный левый промотор Р_L бактериофага X, который контролируется температурно-чувствительным репрессором. Подходящими также являются промоторы E.coli, такие как lac (лактозный)-промотор, регулируемый lac-репрессором и индуцируемый изопропил-бета-D-тиогалактозидом, trp (триптофановый)-промотор, регулируемый trp-репрессором и индуцируемый, например, при триптофановом голодании, а также tac (гибридный trp-lac-промотор), регулируемый lac-репрессором.

Векторы, применимые для репликации и экспрессии в дрожжах, содержат дрожжевую точку начала репликации и генетический маркер отбора для дрожжей. Одна группа таких векторов включает так называемые ars-последовательности (автономные репликационные последовательности) в качестве точки начала репликации. Данные векторы сохраняются внехромосомно в дрожжевой клетке после трансформации и реплицируются автономно. Кроме того, можно использовать векторы, которые содержат всю или часть 2 мкм - плазмидной ДНК Saccharomyces cerevisiae. Такие векторы будут интегрироваться путем рекомбинации в уже существующие в данной клетке 2 мкм плазмиды или реплицироваться автономно. 2 мкм последовательности особенно пригодны для достижения высокой частоты трансформации и большого числа копий.

Контролирующие экспрессию последовательности, которые применимы для экспрессии в дрожжах, представляют собой, например, контрольные последовательности высокоэкспрессируемых дрожжевых генов. Поэтому, можно использовать промоторы генов ТRP1, ADHI или ADHII, гена кислой фосфатазы (РНО3 или РНО5), изоцитохромного гена или промотор, вовлеченный в гликолитический путь, такой как промотор генов енолазы, глицеральдегид-3-фосфаткиназы (PGK), гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы, пируваткиназы, триозофосфатизомеразы, фосфоглюкозизомеразы, и глюкокиназы.

Векторы, применимые для репликации и экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно содержат промотирующие последовательности, полученные из ДНК вирусного происхождения, например из вируса 40 иммунодефицита обезьян (SV40), вируса саркомы Рауса (RSV), аденовируса 2, вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV), BK-мутанта паповавируса (BKV) или цитомегаловируса (CMV) мыши или человека. Альтернативно, векторы могут включать промоторы из продуктов экспрессии млекопитающих, таких как актин, коллаген, миозин и т.п., или нативный промотор и контрольные последовательности, которые обычно ассоциированы с желаемой генной последовательностью, т.е. промотор Н-цепи или L-цепи иммуноглобулина.

Некоторые предпочтительные векторы применимы как для прокариотических, так и для эукариотических хозяев и основываются на вирусных репликационных системах. Особенно предпочтительны векторы, включающие промоторы вируса иммунодефицита обезьян, например pSVgpt или pSVneo, дополнительно включающие энхансер, например, энхансер обычно ассоциированный с последовательностями иммуноглобулинового гена, s частности, энхансер Н- или L-цепи Ig мыши.

Рекомбинантную ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело настоящего изобретения, можно получить, например, путем культивирования трансформированной клетки-хозяина и необязательного выделения полученной ДНК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным с помощью описанных выше рекомбинантных ДНК, а именно клеткам-хозяевам, трансформированным ДНК, кодирующей тяжелую цепь и/или ДНК, кодирующей легкую цепь рекомбинантного антитела, в особенности, к клеткам-хозяевам, трансформируемым с помощью ДНК, кодирующей одноцепочечное рекомбинантное антитело.

В частности, в настоящем изобретении рассматривается клетка-хозяин, трансформированная гибридным вектором, содержащим экспрессирующую кассету, включающую промотор и ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной гибридным вектором, содержащим экспрессирующую кассету, включающую промотор, функционально связаны с первой последовательностью ДНК, кодирующей сигнальный пептид, присоединенный в открытой рамке считывания ко второй последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантное антитело.

Примеры подходящих хозяев представлены микроорганизмами, которые не содержат или содержат мало ферментов рестрикции или модифицирующих ферментов, таких как бактерии, в частности штаммами Escherichia coli, например E.coli X1776, E.coli Y1090, Е.coli HB 101, E.coli W3110, E.coli HB 101/LM1055, E.coli JA 221, E.coli DH5.alpha., E.coli K12, или E.coli штамм СС118, Bacillus subtilis. Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus и другими, а также дрожжами, например Saccharomyces cerevisiae, такими как S.cerevisiae 3RF 18. Кроме того, подходящие клетки-хозяева представлены клетками высших организмов, в особенности стабильными непрерывными клеточными линиями человека или животных, например легочными фибробластами L132 эмбриона человека, клетками Bowes злокачественной меланомы человека, клетками HeLa, трансформированными вирусом SV40 почечными клетками африканской зеленой мартышки COS-7 или клетками яичников китайского хомячка (СНО) или клетками лимфоидного происхождения, такими как лимфомные, миеломные, гибридомные, триомные или квадромные клетки, например, PAI, Sр2/0 или Х63-Аg8.653.

Настоящее изобретение относится также к способам получения трансформированных клеток-хозяев, в которых подходящие реципиентные клетки-хозяева, как описано выше, трансформируются с помощью гибридного вектора в соответствии с настоящим, изобретением, и полученные трансформированные клетки отбирают. Трансформацию микроорганизмов осуществляют, как описано в соответствующих печатных трудах, например для S.cerevisiae (A.Hinnen и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978), для В. subtilis (Anagnostopoulos и соавт., J. Bacteriol. 81:741, 1961), и для E.coli (М.Mandel и соавт., J. Mol. Biol. 53:159, 1970).

В соответствии с этим, способ трансформации клеток E.coli включает, например, предобработку клеток ионами Са²⁺ для того, чтобы сделать возможным захват ДНК, и инкубацию с данным гибридным вектором. Затем можно осуществить селекцию трансформированных клеток, например, путем переноса клеток на селективную ростовую среду, что позволяет отделить трансформированные клетки от родительских клеток, в зависимости от природы маркерной последовательности векторной ДНК. Предпочтительно использовать ростовую среду, которая не позволяет расти клеткам, которые не содержат данный вектор. Трансформация дрожжей включает, например, стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз, обработку полученных сферопластов данным вектором в присутствии полиэтиленгликоля и ионов Ca²⁺, и регенерацию удаленной клеточной оболочки путем заключения обработанных сферопластов в агар. Предпочтительно, агар для регенерации получают способом, который делает возможными регенерацию и селекцию трансформированных клеток, как описано выше, в одно и то же время.

Трансформацию клеток высших эукариот, таких как клеточные линии млекопитающих, предпочтительно успешно выполняют путем трансфекции. Трансфекцию осуществляют традиционными методами, такими как кальций-фосфатное осаждение, микроинъекция, слияние протопластов, электропорация, т.е. интродукция ДНК с помощью электрического импульса, который временно повышает проницаемость клеточной мембраны, или в присутствии вспомогательных соединений, таких как диэтиламиноэтилдекстран, диметилсульфоксид, глицерин или полиэтиленгликоль, и им подобные. После операции трансфекции трансфицированные клетки идентифицируют и селектируют, например, путем культивирования в селективной среде, выбранной в зависимости от природы селективного маркера, например в стандартной культуральной среде, такой как модифицированная Дюльбекко среда Игла (DMEM), минимальная незаменимая среда, среда RPMI 1640 и им подобные, содержащие, например, соответствующий антибиотик.

Рекомбинантные антитела, в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать для качественного и количественного определения присутствия вируса бешенства. Вообще, рекомбинантные антитела, в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать в любом известном иммуноферментом анализе, который зависит от связывающего взаимодействия между антителами и антигенами бешенства. Примеры таких анализов представляют собой радио-, ферментный, флуоресцентный, хемилюминисцентный, иммунопреципитационный, латексноагглютинационный, и гемагглютинационный иммунный анализ, а также, в частности, способы иммунного окрашивания.

В соответствии с настоящим изобретением антитела могут использоваться как таковые или в виде конъюгированных с ферментом производных в иммуноферментном анализе. Можно использовать любую известную модификацию иммуноферментного анализа, например, жидкофазный (гомогенный) иммуноферментный анализ, твердофазный (гетерогенный) иммуноферментный анализ, одностадийный иммуноферментный анализ или двухстадийный (сэндвич) иммуноферментный анализ с прямым или непрямым (конкурентным) определением присутствия вируса бешенства.

Примером такого иммуноферментного анализа является сэндвич-иммуноферментный анализ, в котором подходящий носитель, например пластиковую поверхность микротитровальной плашки или пробирки, например полистироловую, полипропиленовую или поливинилхлоридную, стеклянные или пластиковые шарики, фильтровальную бумагу, декстрановые и ему подобные ацетатцеллюлозные или нитроцеллюлозные листы, намагниченные частицы или им подобные, покрывают моноклональным антителом настоящего изобретения простой адсорбцией или необязательно после активации данного носителя, например с помощью глутаральдегида или бромциана. Затем добавляют испытуемые растворы, содержащие вирус бешенства, и, наконец, рекомбинантные антитела настоящего изобретения, включающие детектируемый фермент, например щелочную фосфатазу. Количество вируса бешенства в испытуемом растворе прямо пропорционально количеству связанного рекомбинантного антитела и определяется путем добавления фермент-субстратного раствора. Фермент-субстратная реакция дает, например, изменение в окраске, которое можно наблюдать невооруженным глазом или с помощью оптических измеряющих устройств.

В соответствии с настоящим изобретением антитела можно использовать как таковые или в виде радиоактивно меченых производных в радиоиммунном анализе (РИА). Как указано выше для лммуноферментных анализов, можно использовать любую модификацию радиоиммунного анализа.

Тестирование осуществляют способом, аналогичным вышеописанным иммуноанализам с использованием радиоактивной метки, например ¹²⁵I, вместо ферментной метки. Количество иммунного комплекса, образованного с соответствующим количеством вируса бешенства, присутствующего в тестируемых растворах, определяют путем измерения радиоактивности иммунного комплекса.

Для иммунноокрашивания срезы замороженного или хранимого при криогенной температуре биопсийного материала или заключенные в парафин тканевые срезы обрабатывают раствором, содержащим рекомбинантное антитело настоящего изобретения, включающего поддающийся обнаружению фермент. Связанное рекомбинантное антитело детектируется путем обработки подходящим ферментным субстратом, предпочтительно ферментным субстратом, который дает осадок твердых частиц (краситель) на участке присутствующего рекомбинантного антитела настоящего изобретения. Вместо рекомбинантных антител, включающих фермент, можно использовать рекомбинантное антитело, включающее стрептавидин и раствор биотин-фермент-конъюгата, что ведет к повышенной ферментной концентрации на участке данного антитела и, следовательно, повышает чувствительность способа иммунного окрашивания. Осадок твердых частиц ферментного субстрата детектируется просмотром под микроскопом, например с помощью флуоресцентного микроскопа, или путем сканирования оптической плотности при определенной длине волны данного красителя.

Использование, в соответствии с настоящим изобретением, рекомбинантных антител, как описано выше, для определения вируса бешенства включает также другие иммунные анализы, известные per se, например иммунофлуоресцентные анализы, латексную агглютинацию с частицами латекса, покрытыми антителом или антигеном, гемагглютинацию красных кровяных телец, покрытых антителом или антигеном, анализ затухающих волн света с использованием покрытого антителом оптоволокна или другими иммуносенсорами прямого действия, которые преобразуют событие связывания в электрический или оптический сигнал, или им подобные.

В настоящем изобретении рассматриваются также тест-наборы для качественного и количественного определения присутствия вируса бешенства, включающие рекомбинантные антитела настоящего изобретения и необязательно вспомогательные вещества, положительные и/или отрицательные контроли, буферы, инструкции и