Интерферон-подобный белок zcyto21

Интерферон-подобный белок zcyto21

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируется гормонами и полипептидными факторами роста. Эти диффундируемые молекулы позволяют клеткам осуществлять коммуникацию друг с другом и действовать совместно для образования тканей и органов и для репарации и регенерации поврежденной ткани. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя, среди прочих, стероидные гормоны, паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерфероны, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.

Гормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм посредством связывания с рецепторными белками. Некоторые рецепторы являются интегральными мембранными белками, которые связываются с гормоном или фактором роста вне клетки и которые связаны с путями передачи сигналов внутри клетки, такими как системы вторичных мессенджеров. Другие классы рецепторов являются растворимыми внутриклеточными молекулами.

Цитокины обычно стимулируют пролиферацию и/или дифференцировку клеток гемопоэтического направления дифференцировки или участвуют в механизмах иммунных и воспалительных реакций организма. Примеры цитокинов, которые влияют на гемопоэз, включают в себя эритропоэтин (ЕРО), который стимулирует развитие эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), который стимулирует развитие клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки; и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), который стимулирует развитие нейтрофилов. Эти цитокины применимы в восстановлении нормальных уровней клеток крови в пациентах, страдающих от анемии, тромбоцитопении и нейтропении, или получающих химиотерапию по поводу рака. Цитокины играют важные роли в регуляции гемопоэза и иммунных реакций и могут влиять на развитие лимфоцитов.

Класс II семейства цитокинов человека включает в себя подтипы интерферона-α (IFN-α), интерферон-β (IFN-β), интерферон-γ (IFN-γ), IL-10, IL-19 (патент США 5 985 614), MDA-7 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-20 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-22 (Xie et al., J.Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)) и АК-155 (Knappe et al., J.Virol. 74, 3881-3887, (2000)). Большинство цитокинов связывают и передают сигналы через рецепторы цитокинов Класса I или Класса II. Члены семейства рецепторов цитокинов класса II человека включают в себя интерферон-αR1 (IFN-α R1), интерферон-γ-R2 (IFN-γ-R2), интерферон-γR1 (IFN-γR1), интерферон-γR2 (IFN-γR2), IL-10R (Liu et al., J.Immunol. 152, 1821-1829, (1994)), CRF2-4 (Lutfalla et al., Genomics 16, 366-373, (1993)), IL-20Rβ (Blumberg et al., Cell 104, 9-19, (2001)) (так же известный как zcytor7 (патент США 5 945 511) и CRF2-8 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2557-2565, (2000)), IL-20Rβ (Blumberg et al., ibid, (2001)) (так же известный как DIRS1 (РСТ WO 99/46379)), IL-21 (IL-22 рецептор-α1, представленный в HUGO для одобрения) (так же известный как IL-22R (Xie et al., J.Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)), zcytor11 (патент США 5 965 704) и CRF2-9 (Kotenko et al, Oncogene 19, 2557-2565, (2000)) и тканевой фактор.

Рецепторы цитокинов класса II являются обычно гетеродимерами, состоящими из двух различных цепей рецептора, α- и β-субъединиц рецептора (Stahl et al., Cell 74, 587-590, (1993)). Обычно α-субъединицы являются первичными цитокинсвязывающими белками, а β-субъединицы требуются для образования сайтов связывания высокой аффинности, а также для трансдукции сигнала. Исключением является рецептор IL-20, в котором обе субъединицы необходимы для связывания IL-20 (Blumberg et al., ibid, (2001)).

Рецепторы цитокинов класса II идентифицируют по консервативному цитокинсвязывающему домену из приблизительно 200 аминокислот (D200) во внеклеточной части этого рецептора. Этот цитокинсвязывающий домен состоит из двух доменов фибронектина типа III (Fnlll), из приблизительно 100 аминокислот каждый (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6934-6938, (1990); Thoreau et al., FEBS Lett. 282, 16-31, (1991)). Каждый домен FnIII содержит консервативные остатки Cys, Pro и Trp, которые определяют характерную конфигурацию укладки семи β-тяжей, сходную с константным доменом иммуноглобулинов (Uze et al., J. Interferon Cytokine Res. 15, 3-26 (1995)). Эти консервативные структурные элементы семейства рецепторов цитокинов класса II позволяют идентифицировать новые члены этого семейства на основе гомологии первичной аминокислотной последовательности. Ранее авторы данного изобретения успешно идентифицировали два новых члена семейства рецепторов цитокинов класса II, zytor7 (патент США 5 945 511) (так же известный как IL-20R α (Blumberg et al., ibid, (2001)) и zcytor11 (патент США 5 965 704) (так же известный как IL-22R (Blumberg et al., ibid, (2001)) с использованием этого подхода. Идентификация дополнительных новых членов семейства рецепторов цитокинов класса II представляет интерес, так как цитокины играют первостепенную роль в регуляции биологических реакций.

IL-22, так же известный как IL-TIF (IL-10-родственный происходящий из Т-клеток индуцируемый фактор) (Dumoutier et al., J.Immunology 164, 1814-1819, (2000)), является недавно описанным гомологом IL-10. Мышиный IL-22 первоначально идентифицировали как ген, индуцируемый IL-9 в Т-клетках и тучных клетках in vitro (Dumoutier et al., J.Immunology 164, 1814-1819, (2000)). Активность индукции реагентом острой фазы наблюдали в печени мыши при инъекции IL-22, и экспрессия IL-22 быстро индуцировалась после инъекции липополисахарида (LPS), что предполагает, что IL-22 способствует воспалительной реакции in vivo (Dumoutier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10144-10149, (2000)).

Интерлейкины являются семейством цитокинов, которые опосредуют иммунологические реакции, в том числе воспаление. Интерлейкины опосредуют разнообразные воспалительные патологии. Центральной для иммунной реакции является Т-клетка, которая продуцирует многие цитокины и создает искусственный (приобретенный) иммунитет к антигенам. Цитокины, продуцируемые Т-клеткой, были классифицированы как цитокины Типа 1 и Типа 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Цитокины Типа 1 включают в себя IL-2, IFN-γ, LT-α и участвуют в воспалительных реакциях, противовирусном иммунитете, иммунитете против внутриклеточных паразитов и отторжении аллотрансплантата. Цитокины Типа 2 включают в себя IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13 и участвуют в гуморальных реакциях, иммунитете против гельминтов и аллергической реакции. Имеются некоторые доказательства для предположения, что продуцирующие цитокины Типа 1 и Типа 2 популяции Т-клеток преимущественно мигрируют в различные типы воспаленной ткани.

Особый интерес, с терапевтической точки зрения, представляют собой интерфероны (обзоры по интерферонам обеспечены De Maeyer and De Maeyer-Guignard, "Interferons," in The Cytokine Handbook, 3^rd Edition, Thompson (ed.), pages 491-516 (Academic Press Ltd. 1998) и Walsh, Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology, pages 158-188 (John Wiley & Sons 1998)). Интерфероны проявляют различные биологические активности и применимы для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, в частности, раков, и усиления иммунной реакции против инфекционных агентов, в том числе вирусов, бактерий, грибков и простейших. К настоящему времени были идентифицированы шесть форм интерферонов, которые были классифицированы на две основные группы. Так называемые интерфероны «типа I» включают в себя интерферон-α, интерферон-β, интерферон-ω, интерферон-δ и интерферон-τ. В настоящее время интерферон-γ и один подкласс интерферона-α являются единственными интерферонами типа II.

Интерфероны типа I, которые, как считается, происходят из одного и того же предкового гена, сохранили достаточно сходную структуру, чтобы действовать посредством одного и того же рецептора поверхности клетки, α-цепь рецептора интерферона-α/β человека содержит внеклеточный N-концевой домен, который имеет характеристики рецептора цитокинов класса II. Интерферон-γ не имеет значимой общей гомологии с интерферонами типа 1 или с подтипом интерферона-α типа II, но имеет ряд общих биологических активностей с интерферонами типа I.

У людей по меньшей мере 16 неаллельных генов кодируют различные подтипы интерферона-α, тогда как интерфероны-β и ω кодируются единственными генами. Гены интерферонов типа I собраны в кластер в коротком плече хромосомы 9. В противоположность типичным структурным генам человека, гены интерферона-α, интерферона-β и интерферона-ω не имеют интронов. Единственный ген для интерферона-γ локализован на хромосоме 12 и содержит три интрона. К настоящему времени интерферон-τ был описан только в крупном рогатом скоте и овцах, тогда как интерферон-δ был описан только в свиньях.

Клиницисты используют преимущество множественных активностей интерферонов посредством использования этих белков для лечения большого диапазона состояний. Например, одна форма интерферона-α была одобрена для применения в более, чем 50 странах, для лечения таких медицинских состояний, как ретикулоэндотелиоз, почечно-клеточный рак (гипернефрома), базально-клеточный рак (базалиома), злокачественная меланома, связанная со СПИДом саркома Капоши, множественная миелома, хронический миелогенный лейкоз, не-Ходжкинская лимфома, папилломатоз гортани, грибовидный микоз, остроконечная кондилома, хронический гепатит В, гепатит С, хронический гепатит D и хронические не-А, не-В/С гепатиты. Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США одобрил применение интерферона-β для лечения множественного склероза, хронического заболевания нервной системы, интерферон-γ используют для лечения хронических гранулематозных заболеваний, в которых интерферон усиливает иммунную реакцию пациента для разрушения инфекционных бактериальных, грибковых и принадлежащих к простейшим патогенов. Клинические исследования показывают также, что интерферон-γ может быть применим в лечении СПИДа, лейшманиоза и лепроматозной проказы.

Продемонстрированные in vivo активности этого семейства цитокинов иллюстрируют огромный клинический потенциал этих цитокинов и потребность в других цитокинах, агонистах цитокинов и антагонистах цитокинов. Данное изобретение удовлетворяет эти потребности обеспечением нового цитокина, стимулирующего клетки гемопоэтической линии дифференцировки, а также связанных с этим цитокином композиций и способов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

На фиг.1-5 представлен интерферон-подобный белок Zcyto21.

На фиг.6 представлен профиль гидрофильности Hoop/Woods последовательности белка Zcyto21, показанной в SEQ ID NO:2. Этот профиль основан на скользящем окне из шести остатков. Скрытые остатки G, S и Т и открытые остатки Н, Y и W не принимались во внимание. Эти остатки указаны на фиг.6 строчными буквами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания определение следующих терминов:

Термин «аффинная метка» используется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или детектирования второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают в себя полигистидиновый участок (тракт), белок A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), глутатион S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), аффинную метку Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991. ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Термин "аллельный вариант" используется здесь для обозначения любой из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно через мутацию и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена.

Термины "амино-концевой" и "карбоксил-концевой" используются здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Там, где позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, некоторая последовательность, расположенная карбоксил-терминально относительно ссылочной последовательности в полипептиде, расположена проксимально относительно карбоксил-конца ссылочной последовательности, но не обязательно находится при карбоксил-конце полного полипептида.

Термин "пара комплемент/антикомплемент" обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т.п. В случае, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания <10⁹ М^-1.

Термин «комплементы полинуклеотидной молекулы" обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую комплементарную последовательность оснований и обращенную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5′-ATGCACGGG-3′ комплементарна 5′-CCCGTGCAT-3′.

Термин «вырожденная нуклеотидная последовательность» обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. триплеты GAU и GAC, каждый, кодируют Asp).

Термин «экспрессирующий вектор» используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные сегменты включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и могут также включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих.

Термин "выделенный", в применении к полинуклеотиду, обозначает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5′- и 3′-нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация связанных районов будет очевидной лицу с обычной квалификацией в данной области (см., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

«Выделенным» полипептидом или белком является полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например, отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме, выделенный полипептид является по существу не содержащим других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 95%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте, термин «выделенный» не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы.

Термин «неопластический», при упоминании в отношении клеток, обозначает клетки, подвергающиеся новой и отклоняющейся от нормы (аномальной) пролиферации, в частности, в ткани, где эта пролиферация является неконтролируемой и прогрессирующей, приводящей к неоплазме. Неопластические клетки могут быть либо злокачественными, т.е. инвазивными и метастатическими, либо доброкачественными.

Термин «функционально (операбельно) связанные», при ссылке на ДНК- сегменты, указывает, что эти сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей, например, транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора.

Термин «ортолог» обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, являющийся функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования.

"Паралоги" являются отличающимися, но структурно родственными белками, производимыми организмом. Считается, что паралоги возникают в результате дупликации генов. Например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами друг друга.

Термин "полинуклеотид" обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5′-конца к 3′-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как пары нуклеотидов (сокращенно "п.н."), нуклеотиды ("нт") или тысячи пар нуклеотидов ("т.п.н."). Там, где позволяет контекст, два последние термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения общей длины, и должно быть понятно, что он является эквивалентным термину "пары нуклеотидов". Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены ступенчато в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными.

"Полипептид" является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют "пептидами".

Термин "промотор" используется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНК-полимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5′-некодирующих районах генов.

"Белок" обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные компоненты могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но тем не менее они могут присутствовать.

Термин "рецептор" используется здесь для обозначения связанного с клеткой белка, который связывается с биоактивной молекулой (т.е. "лигандом") и опосредует действие этого лиганда на клетку. Мембраносвязанные рецепторы характеризуются мультипептидной структурой, содержащей внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в трансдукции сигнала. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другой молекулой (молекулами) в клетке. Это взаимодействие, в свою очередь, приводит к изменению в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитоллипидов и гидролиз фосфолипидов. Обычно рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреоидстимулирующего гормона, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например, рецептор PDGF, рецептор гормона роста, рецептор IL-3, рецептор GM-CSF, рецептор G-CSF, рецептор эритропоэтина и рецептор IL-6).

Термин «секреторная сигнальная последовательность» обозначает последовательность ДНК, которая кодирует полипептид («секреторный пептид»), который, как компонент большего полипептида, направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь.

Термин "сплайсинговый вариант" используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибируемых из гена. Сплайсинговая вариация возникает природно посредством использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК, или менее обычно между раздельно транскрибируемыми молекулами РНК, и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин сплайсинговый вариант используют здесь также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена.

Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые непрецизионными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как "около" Х или "приблизительно" X, указанная величина Х должна пониматься как величина, определенная с точностью до ±10%.

Все цитируемые здесь ссылки включены в качестве ссылки в их полном виде.

Ген Zcyto21 кодирует полипептид из 200 аминокислот, показанный в SEQ ID NO:2. Сигнальная последовательность для Zcyto21 может быть предсказана как содержащая аминокислотный остаток 1 (Met) - аминокислотный остаток 19 (Ala) SEQ ID NO:2. Зрелый белок для Zcyto21 начинается при аминокислотном остатке 20 (Gly).

Ген Zcyto21 содержится в ВАС-последовательностях АС 011445 и АС 018477, которые картированы в хромосоме человека 19q13.13. Этот район хромосомы 19 может также содержать кластер интерферон-подобных генов. Консенсусная кДНК, показывающая полинуклеотидную последовательность Zcyto21, показана в SEQ ID NO:6, а кодируемый ею полипептид показан в SEQ ID NO:7.

Как описано ниже, данное изобретение обеспечивает выделенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной либо аминокислотным остаткам 20-200 SEQ ID NO:2, либо аминокислотным остаткам 1-200 SEQ ID NO:2. Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной либо аминокислотным остаткам 20-219 SEQ ID NO:9, либо аминокислотным остаткам 1-219 SEQ ID NO:9. Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной либо аминокислотным остаткам 20-203 SEQ ID NO:12, либо аминокислотным остаткам 1-203 SEQ ID NO:12. Данное изобретение включает в себя также полипептид, который дополнительно содержит сигнальную секреторную последовательность, которая находится в амино-концевом положении относительно первой аминокислотной последовательности, причем эта сигнальная секреторная последовательность содержит аминокислотные остатки 1-19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.

В общем предсказывается, что цитокины имеют четырех-α-спиральную структуру, причем спирали А, С и D являются наиболее важными в лиганд-рецепторных взаимодействиях и являются более высококонсервативными среди других членов этого семейства. Однако, интерфероны (INF) и, в частности, интерферон-альфа и интерферон-тау, характеризуются как шестиспиральные пучки. Спираль А интерферона эквивалентна спирали A Zcyto21; спираль В интерферона эквивалентна спирали С Zcyto21; спираль С интерферона эквивалентна спирали D Zcyto21 и спираль D интерферона эквивалентна спирали F Zcyto 21. Таким образом, петля между АВ-петлей и CD-петлей интерферона расширена в Zcyto21 таким образом, чтобы содержать короткие спирали В и Е Zcyto21.

Предсказывается, что спирали Zcyto21 являются следующими: спираль А определяется аминокислотными остатками 49 (Ser) - 63 (Leu); спираль В - аминокислотными остатками 76 (Asn) - 84 (Val); спираль С - аминокислотными остатками 89 (Val) - 104 (Ala); спираль D - аминокислотными остатками 111 (Glu) - 133 (Gln); спираль Е - аминокислотными остатками 137 (Thr) - 158 (Lys) и спираль F - аминокислотными остатками 163 (Gly) - 189 (Leu); как показано в SEQ ID NO:2. Остатки цистеина являются консервативными между Zcyto21 и IFN-α и могут образовывать межмолекулярную дисульфидную связь, в частности, для образования гомодимеров с дополнительными молекулами Zcyto21. Дополнительный анализ Zcyto21 на основе множественных сопоставлений предсказывает, что цистеины в положениях аминокислотных остатков 34 и 131 и 68 и 164 (как показано в SEQ ID NO:2) будут образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи. Цистеин в остатке 190 является свободным и может образовывать межмолекулярную дисульфидную связь. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие районы, домены, мотивы, остатки и последовательности Zcyto21, описанные здесь, показаны в SEQ ID NO:1. Вырожденная полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2 показана в SEQ ID NO:3. Вырожденная полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO:9 показана в SEQ ID NO:10. Вырожденная полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO:12 показана в SEQ ID NO:13.

Подробный мутационный анализ мышиного IL-2 (Zurawski et al., EMBO J. 12:5113-5119, 1993) показывает, что остатки в спиралях А и С являются важными для связывания с IL-2Rβ; критическими остатками являются Asp₃₄, Asn₉₉ и Asn₁₀₃, Множественные остатки в петле А/В и спирали В мышиного IL-2 являются важными для связывания с IL-2Rα, тогда как только единственный остаток, Gln₁₄₁ в спирали D, является первостепенным для связывания с IL-2Rα. Подобным образом, спирали А и С являются сайтами взаимодействия между IL-4 и IL-4Rα (структурно сходного с IL-2Rα), и остатки внутри спирали D являются критическими для взаимодействия IL-2Rα (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J. 11:3237-3244, 1992). В частности, мутация Tyr₁₂₄ в Asp в IL-4 человека создает антагонист, который связывается с IL-4Rα, но не с IL-2Rα и, следовательно, не может передавать сигнал (Kruse et al. ibid., 1992).

Цитокины с четырехспиральными пучками группируются также по длине из компонентов-спиралей. Цитокины «длинноспиральной» формы состоят из спиралей с 24-30 остатками и включают в себя IL-6, цилиарный нейтрофический фактор (CNTF), ингибирующий лейкоз фактор (LIF) и гормон роста человека (hGH). Цитокины «короткоспиральной» формы обычно состоят из спиралей с 18-21 остатками и включают в себя IL-2, IL-4 и GM-CSF. Исследования с использованием CNTF и IL-6 демонстрируют, что спираль CNTF может заменять эквивалентную спираль в IL-6, придавая свойства связывания CNTF полученной химере. Таким образом, по-видимому, функциональные домены четырехспиральных цитокинов определяются на основе структурной гомологии, независимо от идентичности последовательностей, и могут сохранять функциональную целостность в химере (Kallen et al., J.Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Таким образом, спиральные домены Zcyto 21 будут применимы для получения химерных слитых молекул, в частности, с другими интерферонами, для определения и модуляции специфичности связывания рецептора. Особый интерес представляют слитые белки, которые объединяют спиральные и петлевые домены из интерферонов и цитокинов, таких как IFN-α, IL-10, гормон роста человека.

мРНК Zcyto21 была идентифицирована в тканях головного мозга, островков, предстательной железы, яичка, гипофиза, плаценты, опухоли яичника, опухоли легкого, ректальной опухоли и опухоли яичника, а также активированной линии иммунных клеток (CD3+) и линии эпителиальных клеток предстательной железы, которые были трансформированы вирусом папилломы человека IV (HPVS).

Данное изобретение обеспечивает полинуклеотидные молекулы, в том числе молекулы ДНК и РНК, которые кодируют описанные здесь полипептиды Zcyto21. Специалистам в данной области будет понятно, что, в связи с вырожденностью генетического кода, возможна значительная вариация среди этих полинуклеотидных молекул. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:13 являются вырожденными последовательностями ДНК, которые включают в себя все ДНК, которые кодируют полипептид Zcyto21 SEQ ID NO:2, 9 и 12, соответственно. Специалистам в данной области будет понятно, что вырожденная последовательность SEQ ID NO:3, например, обеспечивает все последовательности РНК, кодирующие SEQ ID NO:2, путем замены U (урацилом) Т (тимина). Таким образом, кодирующие полипептид Zcyto21 полинуклеотиды, содержащие район от нуклеотида 1 или 58 до нуклеотида 603 SEQ ID NO:3, и их РНК-эквиваленты рассматриваются данным изобретением. Таблица 1 дает однобуквенные коды, используемые в SEQ ID NO:3 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. "Разрешения" представляют собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. "Комплемент" указывает код для комплементарного нуклеотида (комплементарных нуклеотидов). Например, код Y обозначает либо С, либо Т, а его комплемент R обозначает А или G, причем А является комплементарным Т, а G является комплементарным С.

ТАБЛИЦА 1
Нуклеотид	Разрешение	Комплемент	Разрешение
А	А	Т	Т
С	С	G	G
G	G	С	С
Т	Т	А	А
R	A|G	Y	С|Т
Y	С|Т	R	A|G
М	А|С	К	G|T
К	G|T	М	А|С
S	C|G	S	C|G
W	А|Т	W	А|Т
H	А|С|Т	D	A|G|T
В	C|G|T	V	A|C|G
V	A|C|G	В	C|G|T
D	A|G|T	Н	A|C|T
N	A|C|G|T	N	A|C|G|T

Вырожденные кодоны, используемые в SEQ ID NO:3, 10 и 13, включающие в себя все возможные кодоны для конкретной аминокислоты, представлены в таблице 2.

ТАБЛИЦА 2
Амино-Кислота	Однобуквенный код	Кодоны	Вырожденный кодон
Cys	С	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT ТСА ТСС TCG ТСТ	WSN
Thr	Т	АСА АСС ACG ACT	CAN
Pro	Р	ССА ССС CCG ССТ	CCN
Ala	А	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGG GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	Е	GAA GAG	GAR
Gln	Q	CAA CAG	CAR
His	Н	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG GGA GGG GGG GGT	MGN
Lys	К	AAA AAG	AAR
Met	М	ATG	ATG
lie	L	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	СТА CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter	.	TAA TAG TGA	TRR
Asn|Asp	В		RAY
Glu|Gln	Z		SAR
Any	X		NNN

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что некоторая двусмысленность вводится в определение вырожденного кодона, представляющего все возможные кодоны, кодирующие каждую аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (WSN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать аргинин (AGR), а вырожденный кодон для аргинина (MGN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать серин (AGY). Сходная взаимосвязь существует между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности, но специалист с обычной квалификацией в данной области сможет легко идентифицировать такие вариантные последовательности сравнением с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Вариантные последовательности могут быть легко тестированы на функциональность, как описано здесь.

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды могут проявлять "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов". В общем, см., Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al, Curr. Biol. 6:315-24,1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J.Mol. Biol. 158:573-97, 1982. В применении здесь, термин "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов" или "предпочтительные (преферентивные) кодоны" является термином данной области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (См. таблицу 3). Например, аминокислота треонин (Thr) может кодироваться АСА, АСС, ACG или ACT, но в клетках млекопитающих наиболее обычно используемым кодоном является АСС; в других видах, например, в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны Tnr. Предпочтительные кодоны для конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами, известными в этой области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Таким образом, вырожденная последовательность кодонов, описанная в SEQ ID NO:3, служит в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и описанных здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы для экспрессии в различных видах и испытаны на функциональность, как описано здесь.

Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и РНК. Способы получения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Обычно РНК выделяют из ткани или клетки, которая продуцирует большие количества РНК Zcyto21. Такие ткани и клетки идентифицируют Нозерн-блоттингом (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) или скринингом кондиционированной среды из различных типов клеток на активность на клетках-мишенях или ткани-мишени. После идентификации активности или продуцирующей РНК клетки или ткани, тотальная РНК может быть получена с использованием экстракции изотиоцианатом гуанидиния с последующим выделением центрифугированием в градиенте CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Поли (А)⁺ РНК получают из тотальной РНК с использованием способа Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412 (1972). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли (A)⁺ РНК при помощи известных способов. Альтернативно, может быть выделена геномная ДНК. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды Zcyto21, идентифицируют и выделяют, например, с использованием гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Более длинный клон, кодирующий Zcyto21, может быть получен общепринятыми процедурами клонирования. Клоны комплементарной ДНК (кДНК) являются предпочтительными, хотя для некоторых применений (например, экспрессиии в трансгенных животных) могут быть предпочтительными использование геномного клона или модификация клона кДНК с целью включения по меньшей мере одного геномного интрона. Способы получения клонов кДНК и геномных клонов хорошо известны и находят